IRUCAA@TDC : 凍結組織を用いたフローサイトメトリーによる口腔扁平上皮癌の核ＤＮＡ量解析
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(2) ９ ４. ―――― 歯学の進歩・現状 ――――. 凍結組織を用いたフローサイトメトリーによる 口腔扁平上皮癌の核 DNA 量解析 高 木 多加志 東京歯科大学口腔外科学第一講座. 抄 録：口腔扁平上皮癌５ ７例から得られた凍結標本を用いて，フローサイトメトリーによる核 DNA 量解析を行い，臨床病理組織学的悪性度との関連を検索した。 Aneuploidy は３ ０例，diploidy は１ ５例で，aneuploid の出現率は６ ８． ４％であった。原発巣別の aneuploid の出現率は，舌癌で６ ０． ９％，歯肉癌で７ ０． ８％，口底癌８ ０． ０％，頬粘膜癌６ ６． ７％であった。Ｔ 分類では，Ｔ１が６ ６． ７％，Ｔ２が５ ８． ３％，Ｔ３が７ ６． ５％でＴ４は６ ６． ７％であった。Ｎ分類との間では， Ｎ０は６ ４． ７％，Ｎ１は６ ４． ３％，Ｎ２は７ ５． ０％で あ り，Ｎ３は５ ０． ０％で あ っ た。Stage 分 類 で は，stage !は７ ７． ８％，stage"は５ ０． ０％，stage#は６ ４． ３％で stage$は６ ８． ８％であった。分化度との関係で は，高分化型６ ０． ６％，中分化型６ １． ５％，低分化型１ ０ ０％と分化度が低いほど aneuploid の出現率は 高くなっていた。浸潤様式（山本・古浜分類） との関係では，２型５ ０． ０％，３型６ ９． ６％，４Ｃ型６ １． １ ％，４D 型９ ０％と浸潤様式が高度ほど aneuploid の出現率は高くなっていた。病理学的な頸部リン パ節転移（pN） との関係では，pN（＋） が７ ５． ０％，pN（−） が６ ４． ０％と pN（＋） の aneuploid 出現率が やや高く，歯肉癌では，pN（＋） は全て aneuploidy だった。予後との関係では，予後良好（生存） ６ ６． ０％，予後不良（死亡） １ ０ ０％と死亡例は全て aneuploidy だった。 キーワード：フローサイトメトリー，核 DNA 量，口腔扁平上皮癌. 緒. 言. 所見や腫瘍マーカー，さらには癌遺伝子などをレ. 口腔癌の治療成績は，手術療法を中心として放 射線療法，化学療法を併用する，いわゆる三者併. トロスペクティブに解析する研究が，種々の施設 や研究者により行われてきています。. 用療法により飛躍的に治癒率が向上してきまし. １９７２年に米国国立予防衛生研究所で開発された. た。当科においても手術療法を中心とした口腔. フローサイトメトリーは，細胞をその大きさや形. 癌，とくに進行癌の治癒成績は年々向上してきて. 態，さらには細胞内物質の含有量などによって分. います。しかし，口腔局所の癌が制御されたにも. 類することで，細胞個々の性質を明確に識別し，. かかわらず，術後の後発肺転移などにより，不幸. 癌の細胞診断学などの分野で発展してきた研究手. な転帰をとる患者もいるのが現状です。これらの. 法のひとつです。このフローサイトメトリーを用. 予後不良例に対して，その原因を解明し個々の患. いた細胞解析手法は，分析機器の数度にわたる改. 者に有効な治療方法を選択することが，患者の. 良によって飛躍的にその分析精度が向上し，さら. QOL を向上することにつながってゆくことと思. にフローサイトメトリー分析機器とマイクロコン. われます。そのため，従来からの病理組織学的な. ピュータの連動によって，データの解析を即座に. Takashi TAKAKI : Flowcytometric Analysis of the Nuclear DNA Content of Oral Squamous Cell Carcinoma（First Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Tokyo Dental College） 別刷請求先：〒２ ６ １ ‐ ８ ５ ０ ２ 千葉市美浜区真砂１−２−２ 東京歯科大学口腔外科学第一講座 高木多加志 ― 94 ―.
(3) 歯科学報. Vol．１ ０ ３，No．１（２ ０ ０ ３）. 行うことが可能となって，今まで基礎研究分野で. ９ ５. Ｎ２２４例，Ｎ３ ２例です。さらに，Stage 分類で. の細胞解析手法として発展してきた癌細胞の解析. は Stage!９例，Stage"２例，Stage#１４例，Stage. も，臨床の場での診断材料としての性格をもった. $３２例と進展症例が多くを占めていました（図. 検査機器・手技のひとつとして，消化器外科，産. １）。. 婦人科，耳鼻科など，種々の分野で用いられるよ. 対象症例の背景因子は，性別は男性３０例，女性. うになってきました。なかでも，癌細胞の細胞核. ２７例で，年齢は６１±１２歳（男性５９±１ ０歳，女性６４. DNA 量 解 析 で は DNA の 分 布 パ タ ー ン で あ る. ±１３歳）でしたが，症例の部位，臨床病期などに. DNA ploidy を解析する手法が悪性腫瘍の臨床研. 男女差は認められませんでした。. 究の一分野として注目されています。 研. フ ロ ー サ イ ト メ トリ ー を 用 い た 腫 瘍 組 織 の DNA ploidy 解析においては，一般に DNA aneu-. 究. 方 法. １）検体の処理と核 DNA 量の測定. ploidy が悪性腫瘍の全ての組織で検出されるわけ. 採取した検体の処理の流れを図２に示します。. ではありませんが，DNA aneuploidy が検出され. まず，生検材料より採取した検体を直ちにデム. る腫瘍 は 臨 床 的 に 予 後 が 悪 い と言 わ れ て い ま. ソー緩衝溶液に浸漬し，−４ ０℃で凍結保存いたし. １）∼５）. 。また，凍結組織標本を用いたフローサイ. ました。ついで，凍結組織を１mm３程度にミンシ. トメトリーによる細胞核 DNA 量解析では，DNA. ン グ し た 後，０． １％RNase， ０． １％TritonX−１００溶. aneuploidy の 検 出 率 は，固 形 腫 瘍 で は４９． １∼. 液５ml で ボ ル テ ッ ク ス ミ キ サ ー で ミ キ シ ン グ. ７１． ４％と身体各部の癌腫によって異なるとされて. し，４０µ ナイロンメッシュを通して propidium io-. はいますが比較的高い値が報告されており，癌の. dine（PI）溶液を入れミキシングした後，４ ０µ ナイ. す. 診断や治療方法の選択，さらには現在最も注目さ. ロンメッシュを通して， FAC Scan／Cell Fit DNA. れている予後や治療効果の判定への応用など，そ. system（Becton Dickinson Immunocytometry Sys-. の利用価値は高いと言われている分野の研究のひ. tem USA）で測定しました（図３ａ）。. ６）∼１０）. とつです. 。. 検体の量不足などから測定不能な症例は，解析 不能症例（NA：No Analyze）としてploidy pattern 対象および方法. の解析からは除外しましたが，DNA. aneuploid. 出現率の算定には含めて検討しました。. １．研究対象 研究対象は，１９９２年２月から１９９５年４月の間に. 今回の研究で使用したFAC Scan／Cell Fit DNA. 当科で加療した口腔扁平上皮癌一次症例のうち，. system は，空冷アルゴンイオンレーザー／４８０nm. 生検組織材料の一部から核 DNA 量解析のための. を用いて，５つのパラメーターの同時取得 （前方. 試料が採取可能であった５７例です。なお，細胞核. 散乱光，側方散乱光，緑色蛍光，オレンジ蛍光，. DNA 量解析への試料の利用にあたっては，患者. 赤色蛍光） が可能な機器で，測定条件は測定速度. へ治療への有益性や学術的な正当性などの説明を. （１００００細胞／秒） ，測定解像度 （１０２４チャンネル）. あらかじめ行い，本研究の趣旨についての同意が. で行いました（図３ｂ）。. 得られた患者の試料を用いました。. ２）DNA Ploidy パターンの判定方法. 研究対象の内訳は，部位別では舌癌２３例，歯肉. DNA. aneuploid の判定は，混在する単核球を. 癌２４例，頬粘膜癌３例，口底癌５例，口蓋・上顎. 正常細胞の内部標準と考え，解析された DNA in-. 洞. 各１例です。また，臨床的に T 分類は Tis１. dex （DI）の値が DI≦０． ９５あるいは DI≧１． ０５に合. 例，Ｔ１ ９例，Ｔ２１２例，Ｔ３１７例，Ｔ４１８例で. 致したものを aneuploid と判定しました（図４）。. Ｔ３，Ｔ４の進展症例が３５例と全体の半数以上を占. ３）臨床的悪性度の評価. めていました。Ｎ分類では，Ｎ０１７例，Ｎ１１４例， ― 95 ―. 臨床的な悪性度の評価項目としては，原発部.
(4) ９ ６. 高木：凍結組織を用いた FCM による口腔扁平上皮癌の核 DNA 量解析. 位，TNM 分類，Stage 分類を用い予後の判定因. パラフィン包埋し薄切標本を作製したのち，He-. 子としては生死の別を用いました。. matoxyline eosin 染色を行って，癌組織の分化度. ４）臨床病理組織学的悪性度の評価. （WHO 分類：図５），浸潤様式 （山本・小浜の分. 病理組織学的な悪性度の評価は，通法に従って Fig.１. Clinicohistlogical Findings and DNA ploidy Sex. Age. Location. TN／Stage. Ｔ. Ｎ. Stage. Histological Findings. Alive. Tongue Gingiva Buccal Floor Palate Sinus. １１） 類：図６） を判定して評価基準としました。. Female. Male. ６ ４±１ ３. ５ ９±１ ０. ９ １ ４ ２ １. Total ６ １±１ ２. DNA ploidy Aneuploidy Diploidy ６ ０±１ １. １. ２ ３ ２ ４ ３ ５ １ １. １ ４ １ ７ ２ ４ １ １. Tis Ｔ１ Ｔ２ Ｔ３ Ｔ４. ５ ６ ８ ８. １ ４ ６ ９ １ ０. １ ９ １ ２ １ ７ １ ８. １ ６ ７ １ ３ １ ２. ３ ５ ３ ４. Ｎ０ Ｎ１ Ｎ２ Ｎ３. ９ ８ ９ １. ８ ６ １ ５ １. １ ７ １ ４ ２ ４ ２. １ １ ９ １ ８ １. ４ ５ ５ １. Stage! Stage" Stage# Stage$. ４ １ ６ １ ６. ５ １ ８ １ ６. ９ ２ １ ４ ３ ２. ７ １ ９ ２ ２. ２ １ ４ ８. １ ２. Alive Death Unkown. ２ ３ ４. ２ ７ １ ２. ５ ０ ５ ２. ３ ３ ５ １. １ ５. ２. Differentiation. １ ６ ６ ５. １ １ ７ ７ ５. １ ３ ３ １ ３ １ ０. １ ２ ０ ８ １ ０. Type of Invation. ２ ３ ４Ｃ ４Ｄ. ３ ６ １ ２ ６. ３ １ ７ ６ ４. ６ ２ ３ １ ８ １ ０. pN. ＋ −. ５ １ ５. １ １ １ ０. ２ ７. ３ ０. ８ ５ １ １. ７ ８±６. １ ４ １ ０ １ ４ １ ０. in situ highly moderate poorly. Total. ６ １±１ ２. ％ aneuploidy. NA. １ ２. １ ２ ２ １. １. １ １ ４. ２ １. ３ １ ６ １ １ ９. ２ ７ ６. １. １ ６ ２ ５. １ ２ １ ６. ５ ７. ３ ０. ６ ０． ９％ ７ ０． ８％ ６ ６． ７％ ８ ０． ０％ １ ０ ０． ０％ １ ０ ０． ０％ １ ０ ０． ０％ ６ ６． ７％ ５ ８． ３％ ７ ６． ５％ ６ ６． ７％ ６ ４． ７％ ６ ４． ３％ ７ ５． ０％ ５ ０． ０％ ７ ７． ８％ ５ ０． ０％ ６ ４． ３％ ６ ８． ８％ ６ ６． ０％ １ ０ ０． ０％ ５ ０． ０％ １ ０ ０． ０％ ６ ０． ６％ ６ １． ５％ １ ０ ０． ０％. １ １. ５ ０． ０％ ６ ９． ６％ ６ １． １％ ９ ０． ０％. ４ ７. ２. ７ ５． ０％ ６ ４． ０％. １ ５. ３. ６ ８． ４％. NA：No Analyze ― 96 ―.
(5) 歯科学報. Vol．１ ０ ３，No．１（２ ０ ０ ３）. さらに，頸部郭清術を施行した症例に関して は，病理学的頸部リンパ節転移の有無 （pN）との. ９ ７. （図１，８）。また，全症例での aneuploid の出現 率は，６８． ４％でした。. 関係もあわせて検索しました。頸部郭清術を施行. 原発巣の大きさ（Ｔ）と DNA ploidy との関係で. した症例は，４１例で男性２１例，女性２０例でした（図. は，Ｔ３が７６． ５％と最も高い aneuploid の出現 頻. １）。. 度でしたが，腫瘍の大きさとの間には明瞭な関連 は認められませんでした（図９）。 結. 果. また，臨床的な所属リンパ節転移（Ｎ）と DNAp-. １．全症例の DNAploidy 解析について. loidy との関係では，いずれも diploid より aneu-. 原発部位と DNA ploidy pattern の解析結果と. ploid の症例の方が多くなっていました。とくに. の関係では，すべての原発部位において diploid. Ｎ２の場合の aneuploid の出現率は， ７５． ０％と高率. より aneuploid の 方が 多 く 認 め ら れ ま し た。ま. でした（図１０）。. た，aneuploid の出現率は舌癌で６０． ９％，歯肉癌. さらに，臨床病期 （stage）と DNA. ploidy との. で７０． ８％と歯肉癌の aneuploid 出現率のほうがや. 関係では，stage!の aneuploid の出現率が７７． ８％. や高く，頬粘膜癌で６６． ７％，口底癌８０． ０％でした. と最も高率で，stage"６４． ３％，stage#６８． ８％と. Fig.２. Treatment of specimens and determination of nuclear DNA contents Fig.３−a FACScan／Cell Fit DNA system（Becton Dickinson Immunocytometry System USA）. Fig.４ Fig.３−b FACScan／Cell Fit DNA system （Becton Dickinson Immunocytometry System USA） ― 97 ―. Determination of DNA ploidy patterns with Flow cytometry.
(6) ９ ８. 高木：凍結組織を用いた FCM による口腔扁平上皮癌の核 DNA 量解析. 臨床病期の進展と aneuploid の出現率との間には. 型が１００％であり，分化度が低く な る に 従 っ て. 明瞭な関連性は認められませんでした（図１１）。. aneuploid の検出頻度が明らかに高くなっていま. 病理組織学的な悪性度との関係をみると，分化. した（図１２）。. 度と DNA ploidy との関係では，aneuploid の出. さらに，浸潤様式と DNA ploidy との関係は，２. 現率は高分化型６０． ６％，中分化型６１． ５％，低分化. 型５０． ０％，３型６ ９． ６％，４Ｃ型６ １． １％，４Ｄ型. Fig.５. Histological Differentiation. Fig.６. Mode of Invasion ― 98 ―.
(7) 歯科学報 Fig.７ Location. Gingiva. Tis Ｔ１ Ｔ２ Ｔ３ Ｔ４. ６ ３ ９ ５. ３ ５ ５ １ １. Ｎ. Ｎ０ Ｎ１ Ｎ２ Ｎ３. ８ ５ ９ １. ５ ９ ９ １. Stage. Stage! Stage" Stage# Stage$. ５ １ ７ １ ０. ３ １ ３ １ ７. ３. Alive Death Unkown. ２ ０ １ ２. ２ １ ３. ２ １. ５. in situ highly moderate poorly. １ ４ ４ ５. １ ３ ８ ３. １ １ １. ５. ２ ３ ４Ｃ ４Ｄ. ２ ９ ６ ６. １ ９ １ １ ３. １ １ １. １ ４. ＋ −. ７ ５. ６ １ ６. ２. TN／Stage Histological Findings. Alive. Differentiation. Type of Invation. pN. ９ ９. Clinicopathological Findings and Location Tongue. Ｔ. Fig.８. Vol．１ ０ ３，No．１（２ ０ ０ ３）. Buccal. Floor. Palate. Sinus. １ １ １ １. ３ １ １. １. １. １. １. ２. ４. ０. ０. １. １ ３ ２. １. １. １. １. DNA Ploidy Pattern and Location. Fig.９. ― 99 ―. １ ３. １ ９ １ ２ １ ７ １ ８ １７ １ ４ ２４ ２ ９ ２ １ ４ ３ ２ ５ ０ ５ ２. １. １ ３ ３ １ ３ １ ０. １. ６ ２ ３ １ ８ １ ０. １. １. Total. １ ６ ２ ５. DNA Ploidy Pattern and T Grouping.
(8) １ ０ ０. 高木：凍結組織を用いた FCM による口腔扁平上皮癌の核 DNA 量解析. Fig.１ ０ DNA Ploidy Pattern and N Grouping. Fig.１ １ DNA Ploidy Pattern and Stage Grouping. Fig.１ ２ DNA Ploidy Pattern and HistlogicDifferentiation. Fig.１ ３ DNA Ploidy Pattern and Type of Invation. Fig.１ ４ DNA Ploidy Pattern and Lymphonode Metastasis. Fig.１ ５ DNA Ploidy Pattern and Survival. ９０． ０％と浸潤様式が高くなるにしたがって aneu-. 病理組織学的なリンパ節転移 （pN）と DNA. ploid の検出頻度が高くなる傾向を示し，とくに. ploidy との関係では，aneuploid の出現率 は pN. ４Ｄ型では diploid の症例は認められませんでし. （＋）で は７５． ０％，pN（−）で は６４． ０％で，頸 部 郭. た（図１３）。. 清術後の病理学的なリンパ節転移において，転移 ― 100 ―.
(9) 歯科学報. Vol．１ ０ ３，No．１（２ ０ ０ ３）. １ ０ １. が認められたものは aneuploid の出現率が高い傾. 度，病理組織学的悪性度についての結果を示しま. 向を示しました（図１４）。. す。. さらに，臨床的な予後（生死）と DNA ploidy と. 原発巣の大きさ （Ｔ）との関係では，aneuploid. の関係をみると，予後不良例 （制御不能による死. の出現頻度は，舌癌ではＴ１からＴ４までほぼ同様. 亡症例）の５例は全て aneuploid が検出されてお. な傾向を示しましたが，歯肉癌ではＴ１，Ｔ３症例. り，予後良好例の aneuploid の検出頻度６ ６． ０％に. での aneuploid 出現頻度が高い傾向を示していま. 比較して明らかに aneuploid の出現率は高くなる. した（図１６）。 臨床的な所属リンパ節転移（Ｎ）と DNA ploidy. 傾向を示していました（図１５）。 ２．舌癌と歯肉癌の比較による DNA ploidy 解析. との関係では，症例の少なかったＮ３をのぞく. について. と，舌癌，歯肉癌ともにリンパ節への転移がつよ. ついで，症例数の多かった舌癌２３例と歯肉癌２４. く疑われるほど aneuploid の出現率が高くなる傾. 例についての DNA ploidy 解析結果と臨床的悪性. 向を示していました（図１７）。. Fig.１ ６ DNA Ploidy Pattern and T Grouping. Fig.１ ７ DNA Ploidy Pattern and N Grouping ― 101 ―.
(10) １ ０ ２. 高木：凍結組織を用いた FCM による口腔扁平上皮癌の核 DNA 量解析. 臨床病期（stage）と DNA ploidy との関係では，. さらに，浸潤様式と DNA ploidy との関係は，. 症例の少ない stage!以外での aneuploid の出現. 舌 癌 で は４Ｄ型 の 全 て の 症 例 が aneuploidy で. 頻度は，舌，歯肉ともほぼ同様の傾向でした （図. あったのに対して，歯肉癌では３型，４Ｃ型，４. １８）。. Ｄ型での aneuploid の検出頻度に差は認められま. 病理組織学的な悪性度との関連をみると，分化. せんでした（図２０）。. 度と DNA ploidy との関係は舌癌では中分化型と. 病理組織学的なリンパ節転移 （pN）と DNA. 高分化型で aneuploid の出現頻度に差は認められ. ploidy との関係では，舌癌では aneuploid の出現. ませんでしたが，歯肉癌では分化度が低くなるに. 頻度は pN（＋），pN（−）で差が見られなかったの. 従っ て，aneuploid の 検 出 頻 度 が 明 ら か に 高 く. に 対 し て，歯 肉 癌 で は pN（＋）の 症 例 は 全 て が. なっていました。また，舌癌，歯肉癌ともに低分. aneuploidy であり，頸部郭清術後の病理学的な. 化 型 は す べ て の 症 例 が aneuploidy で し た （図. リンパ節転移において転移が認められたものは. １９）。. aneuploid の出現率が高い傾向を示しました （図. Fig.１ ８ DNA Ploidy Pattern and Stage Grouping. Fig.１ ９ DNA Ploidy Pattern and HistlogicDifferentiation ― 102 ―.
(11) 歯科学報. Vol．１ ０ ３，No．１（２ ０ ０ ３）. ２１）。. １ ０ ３. ようになってきました。また，核 DNA 量につい. また，臨床的な予後（生死）と DNA ploidy との. ての検討は，顕微蛍光測光法やフローサイトメト. 関係をみると，舌癌，歯肉癌ともに予後不良例で. リー法の普及によって，臨床の現場においても勘. は全て aneuploid が検出されており，予後良好例. 弁に行えるようになり，なかでもフローサイトメ. の aneuploid の検出頻度に比較して aneuploid の. トリーを用いた測定はサンプルの調整が簡単で測. 出現率は高くなる傾向を示していました（図２２）。. 定細胞数も多く短時間で測れることから各種の固 形癌においても多くの報告がなされています。さ. 考. 察. らに，フローサイトメトリーを用いた口腔扁平上. 悪性腫瘍の診断と治療，さらには予後に関する. 皮癌の DNA 量についても近年は多くの施設で行. 多くの研究や方法が検討され，腫瘍の細胞生物学. われる よ う に な っ て き て お り，腫 瘍 細 胞 の 核. 的な悪性度を判定する客観的な指標として，腫瘍. DNA 量と臨床的悪性度や病理組織学的悪性度，. 細胞の核 DNA 量の定量という手法が注目される. リンパ節転移や予後との関連に関しての報告がな. Fig.２ ０ DNA Ploidy Pattern and Type of Invation. Fig.２ １ DNA Ploidy Pattern and Lymphonode Metastasis ― 103 ―.
(12) １ ０ ４. 高木：凍結組織を用いた FCM による口腔扁平上皮癌の核 DNA 量解析. Fig.２ ２ DNA Ploidy Pattern and Survival. されています。. とも述べています。さらに，岡らの頭頸部癌１１例. １．DNA anuploidy の出現率について. についての報告中の扁平上皮癌に限ってみると６. DNA. aneuploidy の 出 現 率 に 関 し て は，He-. 検体中の５例に aneuploidy が認められたとあり，. mmer ら１２）７２． ７％，Chen ら１３）６０％，野 谷 ら１４）４４． ８. こ の DNA aneuploidy の 検 出 率 は８０％近 く と な. ％，辻 ら１５）３３． ３％，伊 田 ら１６）２５． ９％と２５∼７０％ま. り，本報告よりも DNA. で報告によって差が見られています。本報告で得. さらに高い報告となります。従来，頭頸部癌とし. られた６８． ４％は，過去の報告と比較すると高い出. て報告されているもののうちの扁平上皮癌におけ. 現率を示しており，組織診による標本を用いた. るの検出率の多くは約８０％前後の報告であり，そ. Hemmer らの報告に近い値を示していました。. れに比較すると本報告の検出頻度はやや低値であ. これは，測定対象が新鮮組織を用いたものか，パ. り，解析不能であった３検体が aneuploid であれ. ラフィン標本なのかなどの検体や標本の調製法な. ば，さらに検出率は高くなっていたのではないか. どの違いからくるもの，あるいは測定に利用され. と推測されます。. た機器 な ど の 影 響 が 考 え ら れ ま す が，辻 ら の. ２．DNA aneuploidy と腫瘍原発部位について. ３３． ３％と 比 較 す る と 本 報 告 の DNA aneuploidy. 原発部位別に DNA. aneuploidy の検出率は. aneuploidy の検出率をみ. の出現率は倍以上の出現率を示していました。こ. ると，舌癌６ ０． ９％，歯肉癌７０． ８％，頬粘膜癌６６． ７. れについては，野谷らは測定時のスタンダードの. ％，口底癌８ ０． ０％となっており，部位によ っ て. 取り方が DNA ploidy 判定上の問題点であると試. DNA aneuploidy の検出率は異なっていました。. 適しています。すなわち，スタンダードの取り方. 原発巣を特定した DNA ploidy 解析についての報. には検体中に存在する炎症性細胞などの正常細胞. 告では，舌癌についての報告が著者の渉猟し得た. をスタンダードとする方法や検体測定時に dip-. 範囲ではほとんどであり，これらの報告をみると. loid pattern を示すリンパ球や赤血球を混入する，. Hemmer１８）ら７０． ２％，野谷らは４４％，Saito１９）らは. いわゆる内分標準をとる方法と検体測定前後にコ. ４２％，William２０）ら は３０％に つ い て aneuploidy が. ントロールをとる外部標準の方法があります。ま. 検出されたと述べています。しかし，伊田らは舌. １７）. た，岡ら は外部標準を用いる方法では測定結果. 癌８例の全例が diploidy であったと述べていま. にばらつきが多く ploidy の判定に問題があった. す。また，新鮮組織とパラフィン包埋組織の両者. ― 104 ―.
(13) 歯科学報. Vol．１ ０ ３，No．１（２ ０ ０ ３）. １ ０ ５. を用いた Norman ら２１）の報告をみると４４％に hy-. 野 谷 ら はＮ０ （３７． ５％），Ｎ１ （８３％），Ｎ２ （８０％）で. perdiploid が検出されたと述べています。これら. Ｎ１＋２ （８１． ８％）とＮの進展に伴って上昇する傾向. の報告に比べると本報告の６ ０． ９％は Hemmer ら. があったと述べています。また，舌癌について検. の報告よりは低いものの，かなり高い検出率を示. 討 し た Saito ら１９）の 報 告 で はＮ０ （３４％） ，Ｎ１，２. していました。この点についは，我々の測定方法. （１００％）であり統計学的な有意差も認められたと. がスタンダードとして内部標準を用いているここ. 述べており，一般的にＮの進行と aneuploid の出. とで，岡らの試適する ploidy の判定の精度とい. 現率との間に関与を示唆する報告が多いようで. う点では問題はなかったと考えれば，測定対象と. す。しかし，Ｎ分類の判定にはＮ０とＮ１との判定. した原発腫瘍の部位の割合や同一の部位でも採取. のように，臨床医の経験に依存する部分も考慮に. した標本の場所などによる影響もあるのではない. 入れなければならず，治療施設によって微妙に判. かと考えられました。. 定が異なる可能性もあるのではないかと考えられ. ３．DNA aneuploidy と臨床的悪性度について. ました。. DNA. aneuploid の出現率と臨床的悪性度との １８）. 臨床病期 （stage 分類）との関連性については，. 関連性については，Hemmer ら はＴ１ （７． ６％），. 本研究では全症例では stage!を除くと病期が進. Ｔ２ （７６． ９％），Ｔ３ （９０． ６％）と報告しており aneu-. むにつれて DNA aneuploid の出現率が高くなる. ploid の出現率はＴのグレードの増加に伴って有. 傾向を示しましたが，舌癌，歯肉癌を比較してみ. 意に増加すると述べています。さらに，野谷らも. ると stage"の症例数が少なく結論は下せません. aneuploid の出現率に差はあるものの T の進展に. が，両者ともに明瞭な関連性は見いだせませんで. 伴い aneuploid の出現率は上昇していたと述べて. した。口腔扁平上皮癌について，臨床病期との関. います。一方，伊田らの DA（DNA aneuploid）の. 連を記載してる野谷らは，臨床病期が進むにつれ. 発現との間には相関はなかったとの報告もありま. aneuploid の出現頻度は高くなり関与がうかがえ. す。本研究においては，Tis の１例をのぞいてＴ. たと述べていますが，本研究結果も同様の傾向は. １６６． ７％，Ｔ２５８． ３％，Ｔ３７６． ５％，Ｔ４６６． ７％. 認められるものの，舌癌・歯肉癌をわけてみても. と原発腫瘍の大きさと aneuploid の出現率には明. 明瞭な関連性は見いだせませんでした。この点に. 瞭な関連性は認められませんでした。この点につ. 関しては，本研究で検討対象とした症例の８０％が. いて，症例数が多かった舌癌と歯肉癌のみをみて. stage#，$であったことなどが影響していると. も，舌癌では aneuploid の 出 現 率 は T に 関 連 な. も考えられました。. く５０∼７０％であり，歯肉癌ではＴ１，３が全例 ane-. ４．DNA aneuploidy と病理組織学的悪性度につ. uploidy ではあったものの，Ｔ２，４は４０∼６０％と. いて. aneuploid の出現率についてはＴとの関連性はと. DNA. くに認められませんでした。. aneuploid の出現率と病理組織学的悪性. 度との関連性については，Hemmer らは，分化. 臨床的な領域リンパ節転移（Ｎ分類）との関連性. 度が低くなるほど DNA aneuploid の出現率が統. については，Ｎ３症例が２例ということもありま. 計学的な有意の差をもって高くなる傾向を示した. すが，Ｎ０とＮ１との間では aneuploid の出現率に. と述べています。本研究においても in. 差はなく，Ｎ３症例がやや高い値を示していたの. 例をのぞいては同様な傾向を示しましたが，舌癌. みでした。しかし，舌癌，歯肉癌についてみる. より歯肉癌でより明瞭な傾向を示していました。. と，両者ともに N の進展にともなって aneuploid. さらに，舌癌，歯肉癌ともに低分化型は全例が. の出現率が増加する傾向が認められました。Ｎ分. aneuploidy でした。しかし，野谷らの報告では. 類と DNA aneuploid の発現については，伊田ら. 明らかではなかったと述べており，口腔扁平上皮. は関連性はみられなかったと報告していますが，. 癌については一致した見解はないようです。ま. ― 105 ―. situ の１.
(14) １ ０ ６. 高木：凍結組織を用いた FCM による口腔扁平上皮癌の核 DNA 量解析. た，浸潤様式（山本・古浜分類）との関係では，高. ます。本研究においても部位に関係なく死亡例は. 度浸潤を示すものほど DNA aneuploid の出現率. 全例が aneuploid であり，diploid の症 例 に 死 亡. が高くなる傾向を示し，４Ｃ型と４Ｄ型の明瞭な. 例は認められませんでした。また，Tytor ら２２），. 違いとして解析不能だった１例を除いて４Ｄ型は. 伊田らの報告にもあるように生存率においても. 全 て の 症 例 が DNA. aneuploidy で し た。こ れ. aneuploid が検出された症例は diloid より低く，. は，舌癌・歯肉癌ともに認められ，高度の瀰漫性. 予後不良例の DNA aneuploid の出現率は高く，. 浸潤をとる４Ｄ型は，４Ｃ型に比べ癌の組織構造. 予後推定の因子の一つとなり得るものと考えられ. （胞巣）としての悪性度に加えて，癌細胞個々の悪. ました。. 性度がより高いことを示唆するものと考えられま 結. した。. 論. 病理学的な頸部リンパ節転移 （pN）との関連性. 口腔扁平上皮癌５７例の核 DNA 量解析と臨床病. については，口腔扁平上皮癌のリンパ節転移と. 理組織学的悪性度との関連を検索し以下の結果を. aneuploidy 発現率とに関して，野谷らは臨床経. 得ました。. 過中のリンパ節転移について詳細な報告を述べて. １．Aneuploidy は３０例，diploidy は１５例，解 析 不. おり，リンパ節転移を認めた症例で５７． ７％に ane-. ４％でした。 能３例で，aneuploid 出現率は６８．. uploid が検出され，認めなかった症例の３ ６． ６％に. ２．原 発 巣 別 の aneuploid の 出 現 率 は，舌 癌 で. 比べてあきらかに高かったと述べています。ま. ６０． ９％，歯肉癌で７０． ８％と歯肉癌のほうが高い. た，伊田らの報告でも DA（DNA aneuploid）群の 全例にリンパ節転移がみられ DA とリンパ節転. 傾向を示しました。 ３．Ｔ分類との間には，関連性は認められません でした。. 移の間には相関性があるのではないかと述べられ ています。これについては，本研究においても pN. ４．Ｎ分類との間では，舌癌，歯肉癌とも に N. （＋）症例の aneuploidy 発現率は pN（−）に比べて. の進展に伴って aneuploid の出現率は増加して. 高い傾向にあり，とくに歯肉癌では pN（＋）症例. いました。. の全例が aneuploid でした。しかし，舌癌では pN. ５．分化度との関係では，分化度が低いほど ane-. （＋）と pN（−）ともに aneuploidy 発現率は約６ ０％. uploid の出現率は高く，低分化型は全て aneu-. であり差はみられませんでした。この点について Saito らは舌癌についての aneuploidy の発現率は. ploidy でした。 ６．浸潤様式（山本・古浜分類）との関係では，高. pN（＋）で３６％，pN（−）で６％であったと報告し. 度浸潤様式ほど aneuploid の出現率は高く，４. ており，本研究よりも明確な関連性を示唆してお. Ｄ型は全て aneuploidy でした。. ります。しかし，伊田らも指摘しているように DD. ７．病理学的な頸部リンパ節転移 （pN）との関係. （DNA diploid）群においてもリンパ節転移が４５％. で は，pN（＋）の aneuploid 出 現 率 が や や 高. 近くに検出されているわけであり，リンパ節への. く，歯肉癌では，pN（＋）は全て aneuploidy で. 転移形成能を検討する何らかの因子をフローサイ トで同時に測定することが必要になると考えられ. した。 ８．予後との関係では，予後不良例（死亡）は全て. ました。. aneuploidy でした。. 臨床的な予後（生死）との関連性では，一般的に DNA. 口腔扁平上皮癌の 生 検 時 の 病 理 標 本 に よ る. aneuploid 症例は，原発部の再発，後発リ. DNA ploidy 解析では，それ単独で予後因子とし. ンパ節転移，生死などについて，経過不良例にそ. て確立されるにはいたりませんが，aneuploid が. の出現率が高い傾向があるとの報告が多く，この. 検出された症例については，すでに確立されてい. 点については一致した見解と考えてもよいと思い. る臨床的指標Ｔ，Ｎ，stage や組織学的悪性度（分. ― 106 ―.
(15) 歯科学報. Vol．１ ０ ３，No．１（２ ０ ０ ３）. 化度，浸潤様式）などをふまえたうえで予後を判 定し，予防的な頸部郭清術の指標にもちいたり， 術前後の化学療法を併用したりする指標とするな ど，より効果的な治療方法の選択に応用できるこ とが示唆されました。 本論文の要旨の一部は第５ ２回日本癌学会総会（１ ９ ９ ３年 １ ０月） ，第３ ８回日本口腔科学会総会（１ ９ ９ ３年１ ０月） ，第５ ３ 回日本癌学会総会（１ ９ ９ ４年１ ０月） ，第２ ５ ４回東京歯科大学 学会（１ ９ ９ ５年２月） ，第２ ５ ５回東京歯科大学学会学長奨励 研究報告（１ ９ ９ ５年６月） ，第１ ９回日本頭 頸 部腫瘍学会総 会（１ ９ ９ ５年６月） および第４回国際癌会 議 （１ ９ ９ ５年１ ０月） において発表した。. 謝. 辞. 稿を終わるに臨み，学長奨励研究補助を戴いた本学 石川達也学長，終始御懇切なる御指導を賜った本学口 腔外科学教室第１講座主任野間弘康教授に深甚なる感 謝の意を捧げると共に，御助言を戴きました大塚アッ セイ研究所の方々，ならびに御協力を戴きました口腔 外科学第１講座教室員各位に深謝いたします。. 参. 考. 文. 献. １）青木昌彦，真里谷靖，渡辺定雄，ほか：下咽頭癌照 射例における flow cytometory を用いた核 DNA 量解 析腫瘍の悪性度，局所一次効果，予後との関連性につ いて，癌の臨床，４ ２&：７ ３ ５∼７ ４ １，１ ９ ９ ６． ２）西村令善，長尾和治，宮山東彦，他：乳癌における Flow cytometry による DNA 量分析の予後因子との 関連および補助療法への応用，乳癌の臨床，９"：２ ８ ７ ∼２ ９ ２，１ ９ ４ ４． ３）山村剛司：DNA Flow Cytometry による大腸癌肝 転移発現高リスク因子の検討，日本大腸肛門病学会雑 誌，４ ４#：４ ４ ２∼４ ４ ７，１ ９ ９ １． ４）土屋敦雄，菊地洋一，阿部力哉，他：mp 胃癌にお ける予後規定因子としての核 DNA 量，日本消化器外 科学会雑誌，３ ０!：１ ５∼１ ９，１ ９ ９ ７． ５）小倉 豊，川瀬恭平，岩瀬克己，他：Flow Cytometry による大腸癌核 DNA 量と臨床病理学的所見，予 後について，藤田学園医学会誌，１ ４"：８ ３∼８ ７， １ ９ ９ １． ６） 佐藤裕二，藤沢純爾，沢口裕二，他：DNA flow cytometry からみた大腸癌の検討，日本臨床外科医学会 雑誌，５ ４(：２ ２ ４ ９∼２ ２ ５ ４，１ ９ ９ ３． ７）藤巻英二，中野 修，山敷宏正，他：胃癌の分化度 別に見た DNA aneuploidy （AP） 検出の臨床的意義， 消化器癌，５"：１ ０ ７∼１ １ ０，１ ９ ９ ５． ８）千葉茂樹，藤巻英二，中野 修，他：Flow Cytometry による大腸腺腫の核 DNA ploidy の検討，癌と化 学療法，２ ０%：７ ６ ７∼７ ７ ０，１ ９ ９ ３．. １ ０ ７. ９）辻田和紀，船橋公彦，渡辺正志，他：Flow−cytometry による大腸癌核 DNA 量測定の意義，日本消化器 外科学会雑誌，２ ４'：２ １ ７ ６∼２ １ ８ ２，１ ９ ９ １． １ ０）清水正嗣，古浜源郁 編：４−５口腔癌細胞の核 DNA の診断学的意義，口腔癌，１ ２ １∼１ ２ ３，デンタル ダイヤモンド社，東京． １ １）E. yamamoto, G. Kohama, H. Sunakawa, M. Iwai and H. Hiratsuka : mode of Invation, Bleomycin Sensitivity, and Clinical Course in Squamous Cell Carcinoma of the Oral Cavity., Cancer, ５ １：２ １ ７ ５∼ ２ １ ８ ０，１ ９ ８ ３． １ ２）Hemmer, J. and Kreidler, J. : Flow cytometric DNA ploidyanalysis of squamous cell carcinoma of the oral cavity comparison with clinicalstaging and histologic grading. Cancer ― philadelphia ―, ６ ６"： ３ １ ７∼３ ２ ０，１ ９ ９ ０． １ ３）Chen, R−B. : Flow cytometoric analysis of benign and malignat tumors of the oral and maxillofacial region. J Oral Maxillofac Surg ４ ７：５ ９ ６∼６ ０ ６， １ ９ ８ ９． １ ４）野谷健一，三浦尚徳，斉藤 徹，福田 博，進藤正 信，雨宮 璋，水野重孝：フローサイトメトリーによ る口腔扁平上皮癌核 DNA 量の検討 ― 臨床所見との 比 較 検 討 ―，日 本 口 腔 外 科 学 会 雑 誌，３ ７%：１ ８∼ ２ ８，１ ９ ９ １． １ ５）辻 龍雄，佐々木功典，木村由香，村上知之，伊田 正道，金川昭啓，葛山 司，篠崎文彦：フローサイト メトリーにより測定した口腔病変の核 DNA 量の解 析，日本口腔外科学会雑誌，３ ８'：１∼４，１ ９ ９ ２． １ ６）伊田正道，葛山 司，井上 敬，辻 龍雄，末次正 康，福田てる代，石丸孝則，田中邦昭，早津良和，篠 崎文彦：フローサイトメトリーによる顎口腔領域扁平 上皮癌の DNA 量の解析と頸部リンパ節転移に関する 検討，日本口腔外科学会雑誌，４ ０$：７ １∼５ ７ ６，１ ９ ９ ４． １ ７）岡 茂，和田安弘，山崎典子，山下敏夫，熊沢 忠 躬，河本圭司：フローサイトメトリーを用いた頭頸部 腫瘍悪性度診断，癌の臨床，３ ５%：６ ５ ３∼６ ５ ８，１ ９ ８ ９． １ ８）Hemmer J., Schoen E., Kreidler J. and Haase S. : Prognostic implications of DNA ploidy in squamous cell carcinoma of the tongue assessedby flow cytometry. J Canser Research and clinical oncology, １ １ ６!：８ ３∼８ ６，１ ９ ９ ０． １ ９）T, Saito, J. Sato, A. Satoh, K. Notani, H. Fukuda, S. Nizuno, M. Shindoh and A. Amemiya : Flow cytometoric analysis of nuclear DNA content in tongue squamous cell carcinoma : relation to cervical lymph node metastasis. Int. J. Oral Maxillofac. Surg.. ２ ３：２ ８∼３ １，１ ９ ９ ４． ２ ０）William B. Farrar, Brenda J. Sickle−Santanello, SedighehKeyhani−Rofapha, jane F. DeCenzo and Robert V. O'Toole : Follow−Up on Flow Cytometric DNA Analysis of Squamous Cell Carcinoma of the Tongue. Am. J. Surgery,１ ５ ７：３ ７ ７∼３ ８ ０，１ ９ ８ ９． ２ １）Norman T. Berlinger, Barbara N. Malone and Neil. ― 107 ―.
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