3-ニトロチロシン

岡 山 医 学 会 雑 誌 第118巻January2007,PP.225-234

総

説

3− ニ ト ロ チ ロ シ ン

荻 野 景 規

岡山大学大学院医歯薬学総合研究科 公衆衛生学 キ ー ワ ー ド:3-ニ トロ チ ロ シ ン,活 性 窒 素 種,翻 訳 後 修 飾 要 約 種 々 の 機 序 に よ り産 生 さ れ た 活 性 窒 素 種(reactive nitrogen species)に よ る チ ロ シ ン残 基 の ニ ト ロ化 に よ る3− ニ ト ロ チ ロ シ ン(3-NT)の 生 成 は,蛋 白 質 の 翻 訳 後 修 飾 の 一 つ と し て 広 く認 め られ て い る.種 々 の 炎 症 性 疾 患 組 織 で は,一 酸 化 窒 素 ・二 酸 化 窒 素 ・ペ ル オ キ シ ナ イ トラ イ ト と い っ た 活 性 窒 素 種 が 異 な る機 序 で 産 生 さ れ,3-NTの 産 生 に 関 与 して い る.チ ロ シ ン ニ トロ化 蛋 白 質 の 同 定 や,蛋 白 質 分 子 中 の チ ロ シ ン ニ ト ロ 化 部 位 が 決 定 で き る よ う に な り,蛋 白 質 の 寿 命,蛋 白 質 問 相 互 作 用 に対 す る 悪 影 響,蛋 白 質 機 能 喪 失 と の 関 連 づ け が 可 能 に な っ て き た.測 定 法 と して は,免 疫 組 織 化 学 的 手 法,ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ に よ る 半 定 量 法 か ら,ELISA,HPLC-ECD,LC-MS/MS,GC -MS/MSを _{用 い た 定 量 的 な 方 法 が あ る .本 総 説 で は,} 3-NTに つ い て,そ の 生 成 機 序,測 定 方 法,予 防 医 学 的 応 用 を 述 べ る. -酸 化 窒 素(NO)の 生 成 蛋 白 質 内 チ ロ シ ン残 基 の ニ トロ 化 を 論 じ る 場 合,最 初 に 示 さ ね ば な ら な い の が,一 酸 化 窒 素(NO)で あ る.既 に 広 く知 られ て い る よ う に,心 血 管 系 の シ グ ナ ル 分 子 と し て のNOの 発 見 は,1998年,Robert

FurchgOott,Louis Ignarro,Ferid Muradら に ノ ー ベ

ル 賞 を も た ら し た.ノ ー ベ ル 賞 は,ダ イ ナ マ イ トの 原 料 で あ る ニ ト ロ グ リ セ リ ン で 一・財 を 成 し たAlfred Nobe1に よ り設 立 さ れ たNObel財 団 に よ り授 与 さ れ る.A1fred Nobe1は,自 身 の 狭 心 症 の 治 療 に ニ トロ グ リ セ リ ン を使 用 し て い た ら しい.ニ トロ 化 合 物 で あ る ニ トロ グ リ セ リ ン の 心 血 管 系 で の 作 用 機 序 は,一 部 解 明 さ れ,mitochondria1 a1dehydede hydrogenaseが 代 謝 に 関 与 し て い る ら しい1).

NOは 基 本 的 に3種 類 のNO合 成 酵 素(NOS)に よ

りL-ア ル ギ ニ ン を 基 質 と し,L-シ トル リ ンへ 変 換 す

る と き生 成 され,神 経 由 来 のNOS-1(nNOS又 はtype

INOS),誘 導 型 のNOS-2(iNOS又 はtypeIINOS),

内 皮 細 胞 由 来 のNOS-3(eNOS又 はtypeIIINOS) が 知 ら れ て い る2-4).NOS-1やNOS-3は,細 胞 に 恒 常 的 に発 現 し て お り,細 胞 内 カ ル シ ウ ム の 上 昇 に 伴 う カ ル モ ジ ュ リ ン の 結 合 に よ り活 性 化 さ れ る の に 対 し て,NOS-2は カ ル モ ジ ュ リ ン が 常 に 結 合 し て お り カ ル シ ウ ム の 上 昇 に 関 係 な く,内 毒 素(endotoxin)や 前 炎 症 性 サ イ トカ イ ン 等 の 種 々 の 刺 激 に よ り誘 導 さ れ る.つ ま り,NOS-2は,定 常 状 態 の 細 胞 に は 発 現 せ ず,刺 激 が 加 わ る と種 々 の 細 胞 に 発 現 し,他 のNOS 平 成18年11月 受 理 〒700-8558岡 山 市 鹿 田 町2-5-1 電 話:086-235-7184FAX:086-226-0715 E-mail:[email protected] ◆ プ ロ フ ィ ー ル ◆ 昭和55年4月 に,山 口 大学 医 学 部 医学 科 を卒業 後,昭 和55年6月,山 口 大学 医 学 部 附属 病 院 第 一 内科 へ 入局 。 そ の後,昭 和63年8月 に,山 口大 学 医学 部助 手,講 師,助 教 授(公 衆 衛 生 学講 座)を 経 て,平 成7年2月 に は,金 沢大 学 医 学 部教 授(公 衆 衛 生 学 講座)に 就任 す る。 こ の度,平 成18年4月,岡 山 大学 大 学 院 医 歯薬 学 総 合研 究科 教 授(公 衆衛 生 学 分 野)に 就 任 し現 在 に至 る。最 近 の研 究 テ ーマ は,活 性 窒素 種 の 生体 影 響 に よ るバ イ オマ ー カ ー と しての チ 口 シ ンニ ト口化 蛋 白質 の検 索 で あ る。 今後,生 活 習慣 病 予 備 軍 を対 象 に チ ロ シ ンニ ト口化 蛋 白質 の質 的,量 的検 討 に よ り,予 防 医 学 的 リス ク評価 を行 う予定 で ある。

に比 し多 量 のNOを 産 生 す る.す な わ ち,多 量 に 産 生 さ れ たNOが 疾 病 に 関 与 す る こ と に な る. ニ トロ 化 と ニ トロ ソ 化 ア ミ ノ 酸 の 中 で ベ ン ゼ ン環 を 有 す る チ ロ シ ン と フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン,そ し て(ベ ンゼ ン 環 を 一 部 含 む)イ ミ ダ ゾ ー ル 環 を 有 す る ト リ プ トフ ァ ン は,反 応 性 の 高 い 活 性 窒 素 種 の 一 つ で あ る ペ ル オ キ シ ナ イ ト ラ イ ト (ONOO-)が 作 用 す る とNO2基 を付 加 さ れ,そ れ ぞ れ,ニ トロ チ ロ シ ン,ニ トロ フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン,ニ ト ロ ト リ プ ト フ ァ ン を 生 成 す る こ と が 知 ら れ て い る5) (図1).― 方,NOは,蛋 白 質 中 ア ミ ノ酸 で あ る シ ス テ イ ン や シ ス テ イ ン を 含 む トリ ペ プ チ ドで あ る グ ル タ チ オ ン とSH基 を 介 して 直 接 結 合 し,ニ トロ ソ チ オ ー ル(S-Nitrosothiols;SNOs)を 生 成 し,NOの プ ー ル さ れ た 状 態 と し て 存 在 す る.ニ ト ロ ソ チ オ ー ル は,細 胞 増 殖 に 関 与 す る オ ル ニ チ ン脱 炭 酸 酵 素(ornithine decarboxylase)の 活 性 中心 の シ ス テ イ ン に 結 合 し活 性 を 抑 制 す る こ とや6),カ ス パ ー ゼ(caspase-3ｅ)の シ ス テ イ ン残 基 に 結 合 し ニ ト ロ ソ化/脱 ニ トロ ソ 化 の 調 節 か ら ア ポ トー シ ス に 関 与 す る こ と が 知 ら れ て い る7). し か し な が ら,ニ トロ ソ化 の 詳 細 な 生 体 調 節 作 用 に 関 し て は,こ こ で は 紙 面 の 都 合 上 割 愛 させ て い た だ き, JS Stamlerら の 総 説 を参 考 に さ れ た い8,9). チ ロ シ ンニ トロ化 に 関与 す る活 性 窒 素種 の産 生 機 序 (図2) チ ロ シ ン の ニ トロ 化 は,ペ ル オ キ シ ナ イ ト ラ イ ト (ONOO-)10),二 酸 化 窒 素(NO2)11,12),塩 化 ニ ト リ ル (NO2C1)13)の チ ロ シ ン残 基 芳 香 環 へ の 攻 撃 で,蛋 白 質 の チ ロ シ ン残 基,及 び 血 中 及 び 組 織 中 に存 在 す る チ ロ シ ン に 対 し て ニ トロ基 に よ る 共 有 結 合 修 飾 が な さ れ る こ と で 起 こ る.ONOO-は 通 常,ス ー パ ー オ キ シ ド(O2-) 図1チ ロ シ ン,フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン,ト リ プ ト フ ァ ン と そ の ニ ト ロ 化 物 図2生 体 に お け る ニ ト ロ チ ロ シ ン の 生 成 機 構 ペ ル オ キ シ ナ イ ト ラ イ ト を 介 し た 経 路,ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ の 関 与 す る 過 酸 化 水 素 を 介 し た 経 路 が よ く 知 ら れ て い る が,そ の 他 に も 塩 化 ニ ト ロ イ ル,硝 酸 イ オ ン(酸 性 条 件),ニ ト ロ ソ ペ ル オ キ シ カ ル ボ キ シ レ ー ト,カ タ ラ ー ゼ を 介 し た 機 構 も 存 在 す る.図 中 の 略 語;

NADPH,nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,reduced form;EPO,eosinophil peroxidase,MPO,myeloperoxidase;NOS, nitri coxide synthase.

3-ニ トロ チ ロ シ ン の 検 出:荻 野 景 規 と,一 酸 化 窒 素 合 成 酵 素(NOS)に よ り生 成 さ れ たNO と の 反 応 に よ り生 成 す る14).NOとO2-の 反 応 速 度 が O2-の 不 均 化(代 謝)酵 素 で あ る 銅 ・亜 鉛-ス ー パ ー オ キ シ ド デ ィ ス ム タ ー ゼ(Cu,Zn-superoxide dismutase;Cu,Zn-SOD)とO2-の 反 応 速 度 に 近 い た め にNOがO2-を 奪 う こ と に よ る と さ れ て い る.O2-は,キ サ ン チ ン酸 化 酵 素 や ミ トコ ン ドリ ア電 子 伝 達 系 を な すNAD(P)Hオ キ シ ダ ー ゼ 等 に よ り 生 成 さ れ る14-16).またNO2は,ミ エ ロ ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ(MPO), 好 酸 球 ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ(EPO),ミ オ グ ロ ビ ン,シ ト ク ロ ムcと い っ た ヘ ム 含 有 蛋 白 質 に よ っ て,過 酸 化 水 素(H2O2)の 存 在 下 で 亜 硝 酸 イ オ ン(NO2-)の 酸 化 に よ り生 成 さ れ る12,17-22).同 じ くヘ ム 蛋 白 質 の 一 つ で あ る カ タ ラ ー ゼ は,そ の 阻 害 剤 で あ る ア ジ 化 ナ ト リ ウ ム お よ び カ タ ラ ー ゼ-過 酸 化 水 素 複 合 体 と の 反 応 に よ りチ ロ シ ン を ニ ト ロ化 す る23).Mn-SOD,プ ロ ス タ サ イ ク リ ン と い っ た 金 属 含 有 蛋 白 質 は,ONOO-に よ る 自 己 ニ トロ 化 を 触 媒 す る24,25).非 酵 素 的 な チ ロ シ ン ニ ト ロ化 は,二 酸 化 炭 素(CO2)とONOO-の 反 応 中 間 体 と し て 生 成 す る ニ ト ロ ソ ペ ル オ キ シ カ ル ボ キ シ レ ー ト (ONOOCO2-)を 介 し て 最 終 的 にCO3'一 とNO2の 作 用 に よ っ て 生 じ る と さ れ て い る.さ ら に,NO2-か ら生 じ た 硝 酸 イ オ ン(NO3-)に よ る,酸 性 条 件 で の 反 応 も指 摘 さ れ て い る26-28).NO2C1は,MPOに よ り産 生 さ れ た 次 亜 塩 素 酸(HOC1)に よ る 亜 硝 酸 イ オ ン の 酸 化 に よ り 生 成 し,チ ロ シ ン を ニ トロ化 す る29). チ □ シ ン の ニ トロ 化 機 序 多 くの 蛋 白 質 の チ ロ シ ン ニ トロ化 が 知 ら れ て い る. 生 理 的 状 態 に お い て も活 性 酸 素 種 や 活 性 窒 素 種 の 産 生 が な さ れ,多 く の 生 理 的 酸 化 還 元 の 調 節 を行 っ て い る. そ れ 故,3-NTの 産 生 も病 的 状 態 の み な らず,生 理 的 状 態 で も検 出 さ れ て い る.し か しな が ら,全 て の 蛋 白 質 が ニ トロ 化 さ れ る わ け で は な い し,さ ら に 蛋 白 質 内 の 全 て の チ ロ シ ンが ニ トロ化 さ れ る わ け で は な い.そ こ に は,あ る 程 度 の 法 則 が 考 え ら れ て い る.す な わ ち 1)  活 性 窒 素 種 の 発 生 場 所,2)  活 性 窒 素 種 の 種 類 と そ の 化 学 的 特 性,3)  蛋 白 質 の 構造 と局 所 環 境 等 で あ る. 1)活 性 窒 素種 の発 生場 所

ONOO-の 生 成 は,NOの 発 生 源NOSが 細 胞 質 に存 在 す る こ とか ら,さ ら にO2-は 細 胞 膜 を通 過 しな い こ とよ り,主 なONOO-の 標 的蛋 白 質 は細 胞 質 又 は細 胞 膜 内 に存 在 す る と考 え ら れ る.し か し な が ら,NOの 膜 透 過 性 か ら細 胞 外 で 産 生 さ れ るO2-と の 反 応 に よ る こ と も あ り,細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス 蛋 白 質 も標 的 と な り 特 異 性 は な い.ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 依 存 性 の3-NT産 生 は,特 にMPOに つ い て 調 べ ら れ て お り,MPOは 血 管 内 皮 細 胞 に よ っ て 内 皮 細 胞 内 に 取 り込 ま れ,H2O2, NO2-存 在 下 で フ ィ プ ロ ネ ク チ ン(fibronectin)を ニ ト ロ化 す る30).動脈 硬 化 症 患 者 の 血 清 中 のapo1ipoprotein Al(apoA1)の チ ロ シ ン残 基 の ニ ト ロ化 に は,apoA1 とMPOの 結 合 に よ る 機 序 が 指 摘 さ れ て い る31).こ の よ う にMPOの 存 在 す る 場 所 は,チ ロ シ ン ニ トロ化 に 関 与 す る 活 性 分 子 種 が 発 生 す る 可 能 性 が あ る. 2)活 性 窒 素 種 の 種 類 とそ の 化 学 的 特 性 ONOO-は,MPO/H2O2/NO2一 系 反 応 に 比 し細 胞 膜 内 の 疎 水 性 部 分 で ペ プ チ ド内 チ ロ シ ン残 基 の ニ トロ化 を 起 こ し や す い こ と が 知 ら れ て い る32).す な わ ち, ONOO-は,ONOOHと して 作 用 し,細 胞 膜 透 過 性 が 増 し,約30%がNO2とOH･に 分 解 さ れ る.OH･は チ ロ シ ン を チ ロ シ ン ラ ジ カ ル に 変 換 し,そ こへNO2(ラ ジ カ ル)が 反 応 し て ニ ト ロ 化 が 成 立 す る.そ れ に 比 し, MPO/H2O2/NO2『 系 反 応 で は,MPO/H2O2結 合 体 が チ ロ シ ン を チ ロ シ ン ラ ジ カ ル に 変 換 し,ま たNO2-をNO2 に 酸 化 す る.最 終 的 にNO2が チ ロ シ ン ラ ジ カ ル 反 応 す る こ と に よ りニ トロ 化 が 成 立 す る.NO2(ラ ジ カ ル) に よ る チ ロ シ ン の チ ロ シ ン ラ ジ カ ル へ の 変 換 は,反 応 が 遅 い. 3)  蛋 白 質 の 構 造 と局 所 環 境 チ ロ シ ン は,芳 香 族 ア ミ ノ 酸 の 中 で は疎 水 性 が 低 い た め 蛋 白 質 内 部 に埋 没 し て い る こ と は 少 な く,表 面 に 露 出 し て い る こ とが 多 い33).し か し な が ら,ニ ト ロ化 さ れ る チ ロ シ ン は,必 ず し も表 面 に 露 出 した チ ロ シ ン 残 基 で は な い.グ ル タ ミ ン合 成 酵 素 で は,露 出 し て い る チ ロ シ ン残 基 が ニ トロ 化 さ れ る の に対 して34),チ ロ シ ン水 酸 化 酵 素 で は,423番 目 の チ ロ シ ン が ニ ト ロ化 さ れ35),Mn-SODで は,34番 目 の チ ロ シ ン が ニ トロ 化 さ れ る36).ど ち ら も蛋 白 質 表 面 で は な く,Mn-SODで は 酵 素 活 性 中 心 に近 い. ニ トロ化 を受 け や す い チ ロ シ ン残 基 の 環 境 と し て , リ ン酸 化 修 飾 部 位 に 近 い こ とが 指 摘 さ れ て い る.す な わ ち,2次,3次 構 造 か ら,タ ー ン構 造 な ど の 立 体 障 害 構 造 が 近 くに な い こ とや,チ ロ シ ン の 近 傍 に 陰 性 の ア ミ ノ酸 例 え ば グ ル タ ミ ン酸 が 存 在 す る こ とが 重 要 ら しい33).チ ロ シ ンニ トロ 化 が,蛋 白 質 の 立 体 構 造 と

機 能 に与 え る影 響 に 関 し て は,明 確 な 見 解 は な い が, pKaが チ ロ シ ン の 水 酸 基 に よ る10.07か ら3-NTの 7.5に 変 わ る こ と に よ る 蛋 白 質 分 子 の 局 所 的 荷 電 の 変 化 が 大 き く影 響 し て い る こ と は 想 像 さ れ る と こ ろ で あ る37). チ ロ シ ン ニ トロ 化 蛋 白 質 と ニ トロ 化 の 影 響 図3に 示 さ れ て い る蛋 白 質 は,既 に チ ロ シ ン の ニ ト ロ化 が 証 明 さ れ て い る も の で あ る.蛋 白 質 の チ ロ シ ン ニ トロ化 修 飾 が 蛋 白 質 機 能 を低 下 さ せ る 場 合 と,逆 に 充 進 さ せ る場 合 が あ る.移 植 後,拒 絶 さ れ た 腎 臓 か ら 3-NT含 有 蛋 白 質 と し て,細 胞 内 ミ トコ ン ドリ ァ に 存 在 す るO2-の 消 去 酵 素 で あ るMn-SODが 検 出 さ れ た24).ア ミ ノ 酸 配 列 の34番 目 の チ ロ シ ン の ニ ト ロ化 と 酵 素 活 性 の 低 下 が 報 告 さ れ て い る36).HDLコ レ ス テ ロ ー ル の ア ポ 蛋 白 質 で あ るaPOA1の192番 目 の チ ロ シ ン の ニ トロ化 がMPOの 結 合 に よ っ て 引 き起 こ さ れ, apoA1の コ レ ス テ ロ ー ル 放 出 機 能 低 下 が 指 摘 さ れ て い る38).Mn-SODとapoA1は,ヒ ト生 体 試 料 か ら の 報 告 で あ り,特 にMn-SODの チ ロ シ ン ニ トロ 化 は, 他 の プ ロ テ オ ー ム解 析 で も確 認 さ れ て お り,ミ トコ ン ド リ ア に お け る 活 性 窒 素 種 の 産 生 を 意 味 し て い る.変 異 型SOD1(Cu,Zn-SOD)遺 伝 子 を 導 入 し た 家 族 性 筋 萎 縮 性 側 索 硬 化 症 の 疾 患 モ デ ル マ ウ ス で は,脊 髄 か ら 32種 類 の チ ロ シ ン ニ ト ロ化 蛋 白 質 を 同 定 し,そ の 内, 解 糖 系 の 酵 素 で あ る α-エ ノ ラ ー ゼ の43番 目 の チ ロ シ ン の ニ トロ 化 が 指 摘 さ れ,糖 代 謝 が 障 害 さ れ て い る こ とが 推 測 さ れ た39).こ の 研 究 の 特 徴 は,α-エ ノ ラ ー ゼ の リ ン 酸 化 部 位 で あ る チ ロ シ ン が ニ トロ 化 を 受 け る こ 図3ニ トロ化 と機 能 変 化 が 証 明 され て い る 蛋 白 質 各 蛋 白 質 につ い て,ニ トロ化 さ れ や す い チ ロ シ ン残 基 を示 し た. 図 中 の 略 語;Mn-SOD,manganese superoxide dismutase.

と と,正 常 マ ウ ス の 脊 髄 に認 め ら れ る 多 く の ニ トロ化 蛋 白 質 の 量 が 神 経 変 性 疾 患 群 で 増 加 し て い る こ と で あ る.ウ シ で は,粥 状 硬 化 動 脈 の 病 変 部 試 料 か ら,3-NT 含 有 プ ロ ス タサ イ ク リ ン合 成 酵 素 が 証 明 さ れ た.プ ロ ス タ サ イ ク リ ン合 成 酵 素 は,ヘ ム 蛋 白 質 で あ りヘ ム 近 傍 の430番 目 の チ ロ シ ン が ニ ト ロ化 さ れ,動 脈 硬 化 初 期 段 階 か ら ニ トロ 化 に よ る 酵 素 活 性 低 下 が プ ロ ス タ グ ラ ンデ ィ ンH2の 蓄 積 を招 き,血 小 板 の 凝 集,血 栓 形 成 に 至 る 過 程 を推 測 させ る25,40).ヒ ト膵 管 腺 癌 で は,c-src チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ の チ ロ シ ン ニ トロ 化 に よ りチ ロ シ ン キ ナ ー ゼ 活 性,チ ロ シ ン リ ン酸 化 の 上 昇 を 認 め て い る41).鎌 状 赤 血 球 症 で は,細 胞 骨 格 蛋 白 質 で あ る ア ク チ ン に,パ ー キ ン ソ ン病 で は,発 症 に 関 与 し て い る と さ れ る蛋 白 質 の1つ で あ る シ ヌ ク レ イ ン(synuc1ein) に そ れ ぞ れ モ デ ル マ ウ ス 試 料 か ら の 分 析 で3-NTが 証 明 さ れ て い る が,機 能 と の 関 係 は 不 明 で あ る42,43). ま た,老 化 と共 に 増 加 す る ニ ト ロ化 蛋 白 質 も心 臓,骨 格 筋 で 証 明 さ れ て い る44・45). プ ロ テ オ ー ム 解 析 に よ り,炎 症,筋 委 縮 性 側 索 硬 化 症,喘 息,老 化 等 の 病 態 に お い て,多 くの チ ロ シ ンニ トロ化 蛋 白 質 が 報 告 さ れ て い る が,機 能 と の 関 連 は不 明 な もの が 多 い. チ ロ シ ン ニ トロ 化 蛋 白 質 の 処 理 チ ロ シ ン ニ トロ 化 蛋 白 質 は,細 胞 内 蛋 白 質 分 解 シ ス テ ム で 処 理 さ れ る こ と が 指 摘 さ れ て い る46,47).ま た, 生 体 内 チ ロ シ ン ニ トロ 化 蛋 白 質 の 処 理 酵 素 の 検 索 が, ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ トを 用 い 検 討 さ れ て い る.ニ トロ 化 し た ピ ス トン1.2の3-NT抗 体 との 反 応 蛋 白 質 バ ン ド が,LPS刺 激RAW264.7破 砕 細 胞 添 加 に よ り消 失 す る こ とや,ニ トロ 化 ヒ ス トンIIIの抗 体 と の 反 応 バ ン ド が 還 元 型 グ ル タ チ オ ン に グ ル タ チ オ ンS-ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ 又 は グ ル タ チ オ ンペ ル オ キ シ ダ ー ゼ を 添 加 す る こ と に よ り消 失 す る こ と を 認 め て い る が,「脱 ニ トロ 酵 素 」 と 呼 ば れ る 酵 素 の 存 在 は,証 明 さ れ て い な い48-50). し か し な が ら,遊 離 型 の3-NTや ニ ト ロ化DNAの ニ トロ 基 が リ ポ イ ル 脱 水 素 酵 素 に よ り ア ミ ノ基 に 還 元 さ れ る こ と は既 に報 告 さ れ て い る51). 3-ニ トロチ ロシ ン の定 量 免 疫 学 的 手 法 に よ る検 出 チ ロシ ンニ トロ化修 飾 を受 け た蛋 白質 の免 疫 学 的 定

3-ニ ト ロチ ロ シ ン の検 出:荻 野 景 規

量 は,ELISA法(enzyme-linked immunosorbent assay)に よ り行 わ れ て き た.モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 用 い た 場 合,ELISA法 のLOD(limit of detection)は, 10∼20nmol/Lで あ る52-55).さ ら に,ELISAで 放 射 性 同 位 元 素 を 用 い た 場 合,LODは0.2nmol/Lに 改 善 さ れ る56).液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー,ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 装 置 の 入 手 ・維 持 管 理 が 煩 雑 ・高 価 で あ る こ と も あ り,多 サ ン プ ル を 一 度 に 処 理 で き るELISA法 は 広 く 使 用 さ れ て い る.ELISA法 の 欠 点 と し て は,遊 離 型3-NTの 検 出 が で き な い こ と,蛋 白 質 表 面 の3-NT し か 検 出 で き な い こ と が 挙 げ ら れ る.実 際 は,蛋 白 質 内 部 に も 多 く の ニ ト ロ 化 さ れ た チ ロ シ ン 残 基 が 存 在 す る.ま た 濃 度 の 決 定 に は 正 確 性,お よ び 低 い 検 出 限 界 と 定 量 限 界 の 実 現 が 求 め ら れ る の で,ELISAは 蛋 白 質 内 チ ロ シ ン ニ ト ロ 化 の 半 定 量 的 検 出 法 と し て は 有 用 で あ ろ う. ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ る 検 出

NCIGC-MS/MS(negative chemical ionization gas chromatography-tandem mass spectrometry)が,

LC-MS/MSよ り も 高 感 度 で あ る こ と,か つ ア ー テ ィ フ ァ ク トの 生 成 が 無 視 で き る と い う 点 で 望 ま し い と さ れ,LODお よ びLOQ(limit of quantification)は そ れ ぞ れ3∼4pMお よ び30∼125pMで,健 常 者 の 遊 離 型 3-NT濃 度 は0.5∼2.9nMで あ る と 推 測 さ れ る.12人 の 健 常 者 か ら 得 ら れ た 血 漿 に お け る,蛋 白 質 結 合 型 3-NTは,0.6pmol/mg proteinと の 報 告 が あ る57-60). ヒ トの 尿 か ら も,NCIGC-MS/MSに よ る3-NTの 検 出 が 可 能 で あ る58).健 常 者 の 尿 に お け る3-NT濃 度 は8.4±10.4nM(mean±SD,測 定 値:1.6-33.2nM) で あ っ た. こ の 方 法 の 欠 点 と し て は,揮 発 性 を 改 善 す る た め 誘 導 体 化 が 必 要 と な り,そ の 処 理 過 程 に 酸 性 条 件 が あ り, 人 工 的 チ ロ シ ン ニ ト ロ 化 が 起 こ り う る.こ れ を 抑 制 す る 方 法 も い く つ か 考 案 さ れ て い る57,59). 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ る 検 出 3-NTは,350∼450nmに 吸 収 ピ ー ク を 持 つ こ と か ら,UVも し く は 蛍 光 検 出 器 を 用 い たHPLC測 定 法 が 可 能 で あ る61,62).し か し,HPLC-UV,HPLC-FL双 方 と も,ほ と ん ど の 生 体 サ ン プ ル の 低 濃 度3-NT検 体 の 測 定 が 難 し い こ と が 示 さ れ て い る. HPLCとECDと の 組 み 合 わ せ たHPLC-ECDは 高 い 感 度 と 選 択 性 を 有 し,そ のLODは0.2∼50nMで あ っ た63,64).生 体 サ ン プ ル 中 の3-NTは10μ1の 投 入 あ た り1pmol(5nM)以 下 で 検 出 可 能 で あ る65).我 々 は, pH2.5と い う強 酸 性 の 移 動 相 を 用 い る 過 去 に 前 例 の な い 方 法 を構 築 し,LPS投 与 群 ・非 投 与 群 に お け る 血 清 中 の 蛋 白 質 結 合 型3-NT濃 度 を,そ れ ぞ れ0.593± 0.053お よ び0.114±0.027pmol/mg proteinと 推 定 し た.我 々 の 実 験 手 法 は,面 倒 な サ ン プ ル 前 処 理 を必 要 と し な い こ と か ら,多 数 の 臨 床 サ ン プ ル を分 析 す る の に 適 し て い る と考 え る[未 発 表]. LC-MSは,こ こ数 年 で 急 速 に 発 展 した 方 法 で あ る. LC-MS/MS法 に お け るLODは そ れ ぞ れ0.442nM以 下 で あ り,HPLC-ECDに 比 して100倍 以 上 の 高 感 度 で あ る と 結 論 づ け ら れ て い る.一 方 で,LC-ESI (electrospray ionization)-MS/MS法 に 基 づ い た 新 規 の 高 感 度,特 異 的 な 測 定 法 が 報 告 さ れ て お り,LODお よ びLOQは そ れ ぞ れ0.43nMお よ び1.4nMで あ っ た66). HPLC-ECD,GC)MS(/MS),LC-MS(/MS)の 共 通 の 問 題 点 蛋 白 質 結 合 型3-NTの 測 定 に は,蛋 白 を ア ミ ノ 酸 レ ベ ル に ま で 分 解 す る 必 要 が あ り,通 常HCIに よ る 酸 性 条 件 で の 加 水 分 解 が 用 い られ て き た.し か し酸 性 条 件 下 で は,硝 酸 イ オ ン,亜 硝 酸 イ オ ン の 混 入 に よ り人 工 的 な チ ロ シ ンの ニ トロ化 が 起 こ る65).ス カ ベ ン ジ ャ ー で あ る フ ェ ノ ー ル の 添 加 に よ り,ア ー テ ィ フ ァ ク ト生 成 は 抑 制 さ れ る が,完 全 な 消 失 に は至 ら な い67).別 の 手 法 と して,気 相 で のHCl加 水 分 解68)お よ び ア ル カ リ 加 水 分 解69)が存 在 す る が 一 般 的 で は な い.ア ル カ リ加 水 分 解 の 弱 点 は,シ ス テ イ ン,セ リ ン,ア ル ギ ニ ン, ト レ オ ニ ン と い っ た ア ミ ノ 酸 が 部 分 的,あ る い は 完 全 に 分 解 さ れ る こ と で あ る.そ こ で,3-NTの 測 定 に は 酵 素 に よ る蛋 白 質 分 解 が 広 く用 い ら れ て き た.本 法 の 潜 在 的 欠 点 は,蛋 白 質 分 解 酵 素 自 身 の 消 化 に よ り,含 有 す る チ ロ シ ン と3-NTを 放 出 す る 点 に あ る. 3-ニ トロ チ ロ シ ン の 定 性 的 解 析 プ ロ テ オ ミ ク ス研 究 に お い て,質 量 分 析 装 置 へ の サ ン プ ル 導 入 法 へ は2つ の 方 法 が よ く知 られ て い る.

MALDI(matrix-assisted laser desorption)に よ る イ オ ン化 とTOF(time of flight)に よ る 分 析 法,2つ 目 はESI(electrospray ionization)に よ る イ オ ン化 と, イ オ ン トラ ッ プ ・三 重 極/四 重 極/ハ イ ブ リ ッ ド四 重 極 型TOF分 析 法 の 組 み 合 わ せ 等 で あ る.た だ し, MALDI-TOFに よ る3-NT含 有 ペ プ チ ド解 析 に は,あ

る 問 題 点 が あ る.す な わ ち,MALDI-TOFに お い て, 3-NT含 有 ペ プ チ ドの ニ トロ 基 か ら 光 化 学 反 応 に よ り酸 素 が1つ 又 は2つ 消 失 す る こ と が あ る こ と で あ る.し か しな が ら,ど ち ら の 分 析 装 置 を 用 い て も,蛋 白 質 を含 む サ ン プ ル は 二 次 元 電 気 泳 動 に よ り供 さ れ, PVDF膜 へ の 転 写 後 の ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ トで 特 異 抗 体 と反 応 す る蛋 白 質 ス ポ ッ ト と 同 じ位 置 に あ る ゲ ル 上 の 蛋 白 質 ス ポ ッ トを分 析 に か け る こ と に な り,同 じ ス ポ ッ トに複 数 の 蛋 白 質 が 存 在 す る こ とや,疎 水 性 蛋 白 質 は 二 次 元 電 気 泳 動 で は 検 出 し に く い 等 の 問 題 が あ る. 3-NTの プ ロ テ オ ー ム で の 検 出 で 注 意 し な け れ ば な ら な い の は,チ ロ シ ン含 有 ペ プ チ ドが トリ プ ト フ ァ ン を含 ん で い る と き で あ る.ト リ プ トフ ァ ン も ニ トロ 化 す る こ とが 知 ら れ て い る70).ま た,プ ロ テ オ ー ム 解 析 で の3-NTの 検 出 は,蛋 白 質 に よ っ て は,全 て の ペ プ チ ドを検 出 す る わ け で は な い の で,3-NTが 検 出 さ れ な い か ら と い っ て3-NTが 標 的 蛋 白 質 に な い と は い え な い. 3-ニ トロ チ ロ シ ン の 予 防 医 学 的 応 用 と 最 近 の ト ピ ッ ク ス Beckmanら が,最 初 に ヒ ト動 脈 の 粥 状 硬 化 症 組 織 病 変 で3-NT抗 体 と反 応 す る 免 疫 組 織 化 学 的 局 在 を み とめ て 以 来,動 脈 硬 化 病 変 で3-NTの 増 加,iNOSの 発 現 プ ロ ス タ サ イ ク リ ン合 成 酵 素 の チ ロ シ ン の ニ ト ロ 化 等 が 証 明 さ れ,動 脈 硬 化 に よ る 血 栓 形 成 と の 関 連 性 が 説 明 さ れ て い る40,71,72).血清 中3-NT濃 度 の 上 昇 及 び 血 清 蛋 白 質apo Alの3-NT量 の 上 昇 が 心 血 管 疾 患 の リス ク を あ げ る こ と や,抗 酸 化 作 用 と コ レス テ ロ ー ル 合 成 阻 害 作 用 の あ る 治 療 薬 ス タ チ ン が 血 清 3-NT濃 度 を 低 下 さ せ る こ と が 報 告 さ れ て い る31,73,74).血清 中 の3-NT濃 度 の 上 昇 は,多 くの 心 疾 患37),糖 尿 病53),腹 部 大 動 脈 瘤75),肺 癌76),人 工 透 析 患 者77)等 に お い て 認 め ら れ て い る.糖 尿 病 に お け る 血 清 3-NT上 昇 は,ス タ チ ン に よ り低 下 す る こ とが 指 摘 さ れ て い る78).疾 患 ま で に は 至 ら な い が,喫 煙 者 や 肥 満 者 で は,血 清 中3-NTの 上 昇 が 見 ら れ る79,80).こ の こ と は,3-NTの 測 定 値 が メ タ ボ リ ッ ク症 候 群 等 の 生 活 習 慣 病 予 備 軍 で 上 昇 し始 め る 可 能 性 が あ り,疾 病 予 防 の た め の バ イ オ マ ー カ ー と な る 可 能 性 を示 し て い る. し か し な が ら,心 血 管 疾 患 の 一 部 の 研 究 はGC-MS/ MS又 はLC-MS/MSで 測 定 き れ て い る が31,73,74),ほと ん ど は ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 又 はELISAに よ る もの で あ り,今 後,疾 患 に お け る リ ス ク評 価 に はMS に よ る測 定 値 と の 比 較 が 必 要 に な る. 最 近,3-NT又 は3-NT含 有 ペ プ チ ドが,2価 の 銅 イ オ ン と チ ト ク ロ ー ムP450還 元 酵 素 存 在 下,DNA を 酸 化 修 飾 し8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxygua-nosine(8-OHdG)を 生 成 す る こ と が 報 告 さ れ た81). す な わ ち,3-NTよ りH2O2の 産 生 が 生 じ,3-NTが 発 が ん に 関 与 し て い る こ と を推 測 し て い る.ま た,ド ー パ ミ ン産 生 神 経 培 養 細 胞 は ,遊 離 型3-NTを 添 加 す る と こ れ を取 り込 み,ド ー パ ミ ン代 謝 を 阻 害 し,ア ポ トー シ ス を 起 こ す こ と が 報 告 さ れ て い る.遊 離 型 の 3-NTが 神 経 細 胞 毒 性 を引 き起 こ す こ と か ら,パ ー キ ン ソ ン 病 へ の 関 与 が 示 唆 さ れ て い る82).一 般 的 に は, ニ トロ化 蛋 白 質 は,蛋 白 質 分 解 を ふ くむ 処 理 機構 に よ り分 解 さ れ る が,特 定 の 条 件 下 で,も し ニ トロ 化 さ れ た 蛋 白 質 が 存 在 し続 け る と,自 己 の 抗 原 認 識 反 応 を 誘 導 し,自 己 免 疫 疾 患 を も た らす 可 能 性 が あ る.実 際 に, 自 己 の ペ プ チ ドに 反 応 性 を持 た な い トラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス に お い て,ニ トロ化 さ れ た ペ プ チ ドは 強 い 免 疫 反 応 を惹 起 す る こ とが 明 ら か に な っ て い る83). お わ り に 3-NTの 生 成 か ら測 定 法,さ ら に バ イ オ マ ー カ ー と し て の 可 能 性 に つ い て 述 べ た.翻 訳 後 修 飾 の 一 つ と し て 蛋 白 質 ア ミ ノ 酸 チ ロ シ ン の ニ ト ロ化 は,よ り正 確 な 測 定 法 の 確 立 に よ り メ タ ボ リ ッ ク シ ン ドロ ー ム 等 の 生 活 習 慣 病 の リ ス ク 評 価 と抗 酸 化 剤 に よ る 疾 病 予 防 に 重 要 な 意 味 を有 し て く る と思 わ れ る. 文 献

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