Title
蛋白質における光駆動プロトン移動と水素結合
Author(s)
石北, 央; 斉藤, 圭亮
Citation
生物物理 (2013), 53(4): 198-201
Issue Date
2013-07
URL
http://hdl.handle.net/2433/176483
Right
© 2013 by THE BIOPHYSICAL SOCIETY OF JAPAN; This
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Type
Journal Article
Textversion
author
Photo-driven proton transfers via hydrogen bonds in proteins
Hiroshi Ishikita1,2 and Keisuke Saito1,2
1
Career-Path Promotion Unit for Young Life Scientists, Kyoto University
2 JST, PRESTO
総説
蛋白質における光駆動プロトン移動と水素結合
石北 央
1,2, 斉藤圭亮
1,2 所属名 1. 大阪大学大学院理学研究科, 2. JST さきがけ Abstract:In a protein environment, proton transfer events can be initiated by configurational changes of pigments (e.g., trans-cis isomerization) or changes in the redox states of cofactors upon photoactivation. These changes lead to alteration of pKa of hydrogen-bond (H-bond) donor and acceptor moieties. In particular, when the pKa values of the two moieties match, a “symmetric H-bond” can be formed. Formation of an unusually short, symmetric H-bond appears to be essential for proton transfer events via H-bonds, and has been observed in photoreceptor proteins.
Key words:
hydrogen bond, proton-coupled electron transfer, rhodopsin, photoreceptor, photosystem II
１ . 水 素 結 合 と プ ロ ト ン 移 動 の 関 わ り
バ ク テ リ オ ロ ド プ シ ン （ bacteriorhodopsin, BR ） は光 受容部位 と し て レ チナール （ retinal ） を も ち光駆動プ
ロ ト ン ポ ン プ と し て機能す る ( 図 1)1). レ チナールは ,
Lys216 と シ ッ フ 塩基 (Schiff base) を 介 し て蛋白質 と 結合 し て い る . 初期状態では all-trans 型で あ り , 光 を 吸収 す る と , 13-cis 型へ と 異性化す る . こ の動 き が , 周辺 環境に伝播 し て ア ミ ノ 酸残基間の相互作用に変化 を も た ら し （ 後述 , 5 章 ） , 蛋白質内プ ロ ト ン 移動経路の 各部位の pKa値 を 変化 さ せ , プ ロ ト ン 移動 を 誘起す る . 一方 , ア ナベナ ・ セ ン サ リ ー ロ ド プ シ ン （ Anabaena
sensory rhodopsin, ASR ） は , 光セ ン サー 2)と し て機能
す る と 言われ て い る . ASR も , BR と 同 じ ロ ド プ シ ン 蛋
白質 フ ァ ミ リ ーに属す る . 実際 , BR (PDB ID: 1C3W3))
と ASR (1XIO4)) の結晶構造には相同性が見 ら れ る . 例
え ば , シ ッ フ 塩基 （ BR では Lys216, ASR では Lys210 ） 近傍には , W402 と 呼ばれ る 水分子が BR, ASR と も に水 素結合距離に保存 さ れ て い る （ 図 1 ） . さ ら に , W402 と 水素結合で き る 位置に , BR では Asp85, ASR では Asp75 が保存 さ れ て い る . なお , こ の Asp は （ シ ッ フ 塩基に対す る ） 対 イ オ ン （ counter ion ） と 呼ばれ て い る . 両者には こ の よ う な相同性が あ る に も か か わ ら ず , ASR では , （ BR で見 ら れ る よ う な ） 対 イ オ ン への プ ロ ト ン 移動反応は起 こ ら な い . こ の差は , W402…Asp 間の水素結合の強 さ の差に起因す る と 指摘 さ れ て い る 2). こ こ では , 私 た ち の研究成果か ら 蛋白質中の プ ロ ト ン 移動 と 水素結合の関係につい て述べてみ た い . 図 1 (a) BR と (b) ASR の レ チ ナ ー ル 周 辺 蛋 白 質 環 境 . ２ . 水 素 結 合 ド ナ ー ・ ア ク セ プ タ ー の pKa 二つの酸素原子間に形成 さ れ る 水素結合 O-H…O を 例 と し て説明す る . 水素結合には , 水素結合 ド ナー
(H-bond donor) と ア ク セ プ タ ー(acceptor)の両者が必要 で あ る . こ こ で , ド ナー と は プ ロ ト ン が よ り 強 く 結び つい て い る 側 , つ ま り （ 結合距離が短い ） O-H側 , ア ク セ プ タ ー と は （ 距離が長い ） H…O 側で あ る . し か し 、 結合距離には い ろ い ろ な要素が含 ま れ る た め, pKa が高い部位 （ ＝プ ロ ト ン ・ ア フ ィ ニ テ ィ ーが高い部位 ） が水素結合 ド ナー , 低い部位が水素結合 ア ク セ プ タ ー と 理解す る の が よ い . （ pKa を プ ロ ト ン ・ ア フ ィ ニ テ ィ ー と 言い換 え て も よ い . ） 例 え ばア ル コ ール -OH (pKa～ 16) と カ ルボ ン 酸 -COO - ( ～ 4) 間に生 じ る 水素
プロトン移動と水素結合 結合 -OH…-OOC- では , （ pK a よ り ） ド ナーは ア ル コ ール側 , ア ク セ プ タ ーは カ ルボ キ シ ル基側で あ る . 以上の話は水素結合の ポ テ ン シ ャ ル を み る と わか り やすい . プ ロ ト ン は pKa が高い側 を 好むの で , ド ナ ー側な ら エ ネ ル ギ ーは低 く て すむ . 従 っ て , 通常の水 素結合 （ standard H-bond ） の ポ テ ン シ ャ ルでは , （ ア ク セ プ タ ーに比べ て pKa が高い ） ド ナー側に深い谷が 存在 し , 左右非対称の形 と な る . つ ま り , 通常の水素 結合では ア ク セ プ タ ー側に プ ロ ト ン 移動す る には大 き な エ ネ ル ギ ーが要 る こ と がわか る ( 図 2 左). 図 2 典 型 的 な 水 素 結 合 ポ テ ン シ ャ ル ； （ 左 ） standard H-bond （ 通 常 の 水 素 結 合 ） , ( 中 )low-barrier H-bond (LBHB, 低 障 壁 水 素 結 合 ), ( 右 )single-well H-bond. 縦 軸 : energy が 下 が る 向 き
は 部 位 の pKa が 上 が る 向 き に 対 応 す る . LBHB, single well で は ド ナ ー と ア ク セ プ タ ー の 明 確 な 差 は も は や な い . さ て , も し ド ナー と ア ク セ プ タ ーの pKa値が ほぼ 一致す る と 水素結合は ど う な る だ ろ う か ? 当然ポ テ ン シ ャ ルは左右対称の形 と な り , 一般的に low-barrier H-bond (LBHB, 低障壁水素結合 , 図 2 中), あ る いは single-well H-bond （ 図 2 右 ） と 呼ばれ る 水素結合 と な る （ 両者 を 対称性水素結合 と 呼ぶ ） . 両者の区別は必 ず し も 絶対的では な いが , 対称性水素結合の条件 「 pKa 一致 」 ど の研究者 も 認め る 事項で あ る 5, 6). なお 誤解 さ れやすいが , single-well H-bond で も , 通常は H が ド ナー ・ ア ク セ プ タ ー O の中点に位置す る わ け では な い . 真ん中に存在す る な ら ばプ ロ ト ン 移動中の過渡 的で不安定 な状態で あ る . (1 分子に カ ル ボ キ シ ル基 2 個 を 持つ ) マ レ イ ン 酸の分子内 single-well 水素結合で す ら , H は結合の真ん中に は存在せず ( 実際の ポ テ ン シ ャ ルは完全に水平では な い ), O 原子に近い部位に よ り 分布 し やすい 7). ３ . 蛋 白 質 中 に お け る 水 素 結 合 の 解 析 手 法 そ れでは蛋白質中の水素結合の様子 を 調べ る には ど う すれば よ いだ ろ う か？ 例 え ば , FTIR (Fourier
transform infrared spectroscopy) 分光法や核磁気共鳴分 光法 （ Nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR ） を 利用す る と , 蛋白質中の水素結合の強度 を 調べ る こ と が で き る . 特に水分子が ド ナー と し て関与す る 水素結 合では , 重水置換の場合 , O-D 伸縮振動の大 き さ に よ っ て水素結合の状態 を 知 る こ と が で き る . 水分子間の 理想的 な水素結合にお け る O-O結合距離は 2.8Å 付 近 を 中 心 に 分 布 し , O-D 伸縮振動数は 2500 cm-1程度 と な る 8). 強い水素結合では , ド ナー O-D の D が よ り 強 く ア ク セ プ タ ーの O に引かれ る た め , O-D...O のO-Oは 短 く な り , 逆に O-D は伸び る . 強い水素結合にお け る こ の O-D の伸びは , 1H-NMR で大 き な化学 シ フ ト 値 と な っ て観測 さ れ る 9). ま た FTIR では , O-D 伸縮振動 数の低下 （ 例 2200 cm-1 ） と な っ て現れ る 8). 図 3 BR/ASR に お け る W402 の O-D 伸 縮 振 動 数 の 差 . ４ . 水 素 結 合 ポ テ ン シ ャ ル は 多 く を 語 る さ て , 重水置換後 （ BR, ASR に保存 さ れ て い る ） 水素結合W402 …Asp85 (BR) と W402…Asp75 (ASR) の様 子 を FTIR 分光法で解析 し た 結果に よ る と , 違いがみ ら れ た . ASR の W402 の O-D 伸縮振動数は 2500 cm-1以 上で あ っ た の に対 し 2), BR では 2200 cm-1程度10)で あ っ た . つ ま り , BR の W402…Asp 水素結合は , ASR の も の に比べ明 ら か に （ 300 cm-1 ほ ど ） 強い . 蛋白質全原子存在下におい て着目部位 を 量子化学的 に取 り 扱 え る QM/MM （ quantum mechanics/ molecular
mechanics ） 法 を 用い る と , 蛋白質結晶構造座標 を 利 用 し て O-D 伸縮振動数 を 計算す る こ と が で き る . そ の 結果 , W402…Asp におけ る O-D 伸縮振動は , BR の場合 2078 （ PDB: 1C3W ） ～ 2120 cm-1 (2NTU), ASR の場合 2376 cm-1 (1XIO) と 計算 さ れ た 11). （ 計算値が実験値 よ り 小 さ く 出て い る のは計算で の熱揺 ら ぎ の無視に起因 す る が , FTIR で得 ら れ た BR と ASR の差 300 cm-1 の原 因 を 明 ら か にす る た めの目的には十分 な質で あ る . ） BR と ASR の振動数の差が蛋白質中の ど の要因に起 因す る の か調べ る には , 例 え ば , 候補 と な る 部位特異 的変異体 を 作 り , 変異体構造毎に振動数 を 計算す る の も 一手で あ る . し か し , 水分子が水素結合に含 ま れ る 際は , 変異体構造では必ず し も 水分子の存在自体が保 存 さ れ て い る と も 限 ら ず , そ の場合 , 結果の解釈は難 し く な る . 私 た ち は こ の問題 を , よ り 簡単 な 「 BR ・ ASR の野生型の水素結合ポ テ ン シ ャ ル を 解析 し 比較 」 す る 単純作業に置 き 換 え た 11). 実際 , BR と ASR の W402…Asp 水素結合ポ テ ン シ ャ ル を 比較 し て み る と
様々な情報が わか り やす く 見え て く る ( 図 4).
図 4
水 分 子 W402 と 対 イ オ ン Asp 間 水 素 結 合 ポ テ ン シ ャ ル .
BR ( ◆ ): W402…Asp85, ASR (■): W402…Asp75. 比 較 の た め
W402 で の エ ネ ル ギ ー を そ ろ え て あ る .
① ア ク セ プ タ ー近傍の エ ネ ル ギー差は Asp85 (BR)
と Asp75 (ASR) の pKa差に対応 . プ ロ ト ン が Asp 近傍
に来 た 場合 , そ の エ ネ ル ギ ーは BR ＜ ASR で あ っ た ( 図 4). エ ネ ル ギ ーが下が る 向 き は pKa が大 き く な る 方 き に対応 し て い る の で , Asp85 (BR) の pKaは Asp75 (ASR) に比べ て高い こ と に な る . つ ま り , W402 か ら Asp への プ ロ ト ン 移動は , BR の ほ う が ASR に比べて エ ネ ル ギー的に楽で あ り , 起 こ り やすい . ② pKa差は , 谷幅の差 を 生 じ る ( 図 4). ア ク セ プ タ ーの pKa が高ければ ド ナー O-D の D は よ り ア ク セ プ タ ー側に引 き つ け ら れ る た め , 谷幅は広 く な る （ ア ク セ プ タ ーに向か う 障壁が低 く な る ） . つ ま り O-D の伸 びは , W402 の O-D 伸縮振動数の低下に対応す る （ わか り に く ければ , 振動数の次元 cm-1は距離の次元 cm の 逆数で と な る こ と を 考 え てみ る と よ い ） . ③ポ テ ン シ ャ ル全体幅の差はO-O距離差に対応す る . 谷幅が広 く な る ほ ど , ド ナー側の O-D は伸びて い る が , それは同時に , ア ク セ プ タ ーが強 く D を 引 き つ け て い る こ と の裏返 し で も あ る . そ う な る と O-O距離 （ 全体幅 ） は短 く な る . つ ま り , ア ク セ プ タ ー Asp の pKaが大 き いほ ど O-O距離は短い . 実際 , W402…Asp のO-O距離は , BR3, 11) ＜ ASR4, 11) と な っ て い る . 以上 , ア ク セ プ タ ー側の pKaが高 く ド ナー側の pKaに近づ く ほ ど , O-O 水素結合距離は短 く な り , プ ロ ト ン 移動は起 こ り やす く な る 様子が う か が え る . ５ . プ ロ ト ン 移 動 が 起 こ る 際 の 水 素 結 合 の 様 子 こ の よ う な議論か ら , ア ク セ プ タ ー側の pKa が上昇 し , ド ナー側の pKa と ほぼ同 じ に な っ た 際 , 水素結合は最 短 と な る こ と が理解で き る . そ れは両部位の カ ッ プ リ ン グ が最大 と な る か ら で あ り , 水素結合内で の プ ロ ト ン 移動が最 も 容易 と な る12, 13). こ の よ う に , 対称性水素 結合はプ ロ ト ン 移動 と 関係が深い . 例 え ば , 蛋白質中 の水分子 ク ラ ス タ ーでは , プ ロ ト ン が外部か ら 来 る と , ド ナー も ア ク セ プ タ ー も 水分子な の で pKa の一致が容 易に行 え （ ＝ ド ナーH3O +の脱プ ロ ト ン 化 と ア ク セ プ タ ー H2O の プ ロ ト ン 化 ） , 対称性水素結合 （ H2O …H-OH2+ ） が生 じ プ ロ ト ン 移動経路に な り やすい . 図 5
PYP に お け る Glu46 ・ pCA 間 の プ ロ ト ン 移 動 . ( 左 ) 初
期 状 態 . ( 右 ) 励 起 後 , pCA 光 異 性 化 に よ り Tyr42 の 水 素 結 合 が 消 失 し Glu46 ・ pCA は 対 称 性 水 素 結 合 と な る . 一方で , 水素結合内 （ pKa: ド ナー＞ア ク セ プ タ ー ） の プ ロ ト ン が ア ク セ プ タ ー側へ移動す る た めには, pKa を 変 え る の に十分 な構造変化 , 酸化状態変化等が必要 で あ る . 例 え ば BR の場合は , レ チナールのtrans-cis 光異性化が プ ロ ト ン 移動の き っ か け と な る . 光受容体 photoactive yellow protein (PYP) におい て も p-coumaric
acid (pCA) の trans-cis 光異性化反応 が水素結合 Glu46…pCA 内プ ロ ト ン 移動の き っ か け と な る . 初期 状態では , pCA の フ ェ ノ ール O は （ Glu46 の他に ）
Tyr42 か ら の水素結合 も 受け て い る た め pKa は低 く ,
Glu46…pCA 水素結合内で プ ロ ト ン は Glu46 側に あ り ,
standard H-bond （ O-O: ～ 2.6 Å ） を 生 じ て い る 14)
( 図 5 左 ). pCA の光異性化に伴い Tyr42 か ら の水素結 合が外れ る と ( 図 5 右 ), pCA の pKaは上昇 し て Glu46 の pKaに近づ く . そ の結果 , 対称性水素結合 （ ～ 2.5 Å, pR 状態15) ） が生 じ , Glu46 か らpCA へのプ ロ ト ン 移 動が容易 と な る 16). そ し て , こ の先の pB 状態に至 る 過程で Glu46 ・ pCA 間水素結合は崩壊す る . （ なお , pB 状態の結晶構造15)は溶液中の状態 と 異 な る と 言わ
プロトン移動と水素結合 れ て い る . 一方 , pR 状態に対応す る 結晶構造15)は分光 測定結果の特徴 を よ く 表 し て い る 16 ） . ） ド ナー と ア ク セ プ タ ーの pKa一致は対称性水素結 合の条件 5, 6) で あ る が , 同時に プ ロ ト ン 移動が最 も 起 こ り やすい条件で も あ る12). pK aの一致で カ ッ プ リ ン グ は最大 と な る た め13), 対称性水素結合は ２ つの分子種 が取 り 得 る 最短の水素結合で あ る . PYP 初期状態で既 に LBHB が存在 , 光励起後には通常の水素結合 と な る 17)と の解釈 も あ る が , それでは初期状態の ほ う が プ ロ ト ン 移動中の過渡的な状態 よ り も 不安定 と な っ て し ま う し , pR 状態で更に短い水素結合が生成で き る （ = こ こ で初め て pKa が一致 ） 事実 と も 矛盾す る . 対称性水 素結合では カ ッ プ リ ン グ は稼げ る が salt-bridge 性 と は 相反す る た め安定 と は限 ら ず , ま た pR 状態は Tyr42 ・ pCA 間水素結合 を 切断 = 犠牲に し て 作 ら れ て お り , 系全体では エ ネ ル ギ ーは高 く 不安定で あ る . 酸素発生 を 行 う 光合成蛋白質 Photosystem II (PSII) の キ ノ ン 分子 QB は , 反応中心部位に あ る ク ロ ロ フ ィ ル分子の光励起に よ っ て開始 さ れ る 2 回の電子移動 と , そ れに伴 っ て起 こ る 2 回の プ ロ ト ン 移動に よ り QB●−, QBH● 状態を経て最終的に QBH2 と な る . こ こ で の プ ロ ト ン 移動の き っ か け は , 電子移動に よ る QB の還元 （ 負電荷 ） に よ る QB カ ルボ ニ ル基の pKa変化で あ る 18). PYPの場合 と 同様 , プ ロ ト ン 移動が起 こ る 際は , 水 素結合 ド ナーの ア ミ ノ 酸 と QB 間に非常に短い対称性 水素結合が生 じ る 19). いずれの例 も , 水素結合内で プ ロ ト ン 移動が起 こ る 過渡的 な状況で , 短い対称性水素結合が生 じ る . ド ナー ・ ア ク セ プ タ ー間で pKaが等 し い対称性水素結合 では ド ナー ・ ア ク セ プ タ ーの性格の差 を 薄め る こ と に な る の で , （ 通常起 こ り に く い ） ド ナーか ら プ ロ ト ン を 放出 し やす く す る の には都合が よ い . 逆に , （ 本来 の pKaが大 き く 異 な る 部位同士の場合は特に ） 対称性 水素結合 を 初期 ・ 定常状態等で維持 し 続け る こ と はエ ネ ル ギー的には得策では な い 7). 多 く の場合 , 対称性 水素結合は励起 （ 例 PYP ） や電子移動 （ 例 PSII ） の エ ネ ル ギー を 用い る こ と で初め て 過渡的に作 り 出せ る . それが証拠に , 対称性水素結合の出現 ・ プ ロ ト ン 移動後に は , PYP では水素結合崩壊 と 蛋白質構造変化 , PSII で も 水素結合崩壊 と QBH2 の蛋白質結合サ イ ト か ら の遊離 と い っ た 構造変化に絡ん だ大 き な イ ベ ン ト が 共通に待 ち受け て い る . 謝 辞 FTIR 及び水素結合に関す る 議論におい て神取秀樹教 授 ( 名古屋工業大学 ) に深 く 感謝い た し ま す . 文 献
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石 北 央 （ い し き た ひ ろ し ） 大 阪 大 学 大 学 院 理 学 研 究 科 教 授
略 歴 東 京 大 学 工 学 部 化 学 生 命 工 学 科 卒 , 同 院 修 了 （ 修 士 ） , Free University of Berlin に て Ph.D. 取 得 . Penn State と USC に て postdoc 及 び JSPS 海 外 特 別 研 究 員 , 東 京 大 学 助 教 、 京 都 大 学 キ ャ リ ア パ ス 形 成 ユ ニ ッ ト 特 定 助 教 ( ～ 2013.3), 講 師 ( ～ 13.6) を 経 て 現 職 .
研 究 内 容 蛋 白 質 に お け る H+ ・ 電 子 移 動
連 絡 先 〒 560-0043 豊 中 市 待 兼 山 1-1 E-mail hiro ＠ bio.sci.osaka-u.ac.jp 研 究 室 の HP URL http://www.bio.sci.osaka-u.ac.jp/dbs01/re-p aper-temp.php?id=87 斉 藤 圭 亮 （ さ い と う け い す け ） 現 在 の 役 職 JST さ き が け 研 究 者 , 大 阪 大 学 大 学 院 理 学 研 究 科 招 へ い 研 究 員 略 歴 筑 波 大 学 大 学 院 数 理 物 質 科 学 研 究 科 修 了 , 博 士 ( 工 学 ) ． 大 阪 市 立 大 学 博 士 研 究 員 ， 京 都 大 学 キ ャ リ ア パ ス 形 成 ユ ニ ッ ト 特 定 研 究 員 を 経 て 現 職 ． 研 究 内 容 蛋 白 質 H+・ 電 子 ・ 励 起 移 動
