16 勾

M a n u s c r i p t  

1  Human  E q u i l i b r a t i v e   N u c l e o s i d e   T r a n s p o r t e r ‑ 1 (hENTl)  E x p r e s s i o n   i n   2  E n d o s c o p i c  U l t r a s o n o g r a p h y ‑ G u i d e d  F i n e ‑ N e e d l e  A s p i r a t i o n  B i o p s y   Samples  i s   a  3  S t r o n g   P r e d i c t o r   o f   C l i n i c a l   Response  and  S u r v i v a l   i n   t h e   P a t i e n t s   With  4  P a n c r e a t i c   D u c t a l   Adenocarcinoma  Undergoing  G e m c i t a b i n e ‑ B a s e d   5  Chemoradiotherapy 

6 

7  R e i k o  Yamada, MD 

8  G a s t r o e n t e r o l o g y  a n d  H e p a t o l o g y ,  Mie U n i v e r s i t y  G r a d u a t e  S c h o o l  o f  M e d i c i n e ,  M i e ,   9  J a p a n .  

10  Shugo Mi

no , MD 

1 1   H e p a t o b i l i a r y  P a n c r e a t i c  a n d  T r a n s p l a n t  S u r g e r y ,  Mie U n i v e r s i t y  G r a d u a t e  S c h o o l  o f   1 2   M e d i c i n e ,  Mie ,  J a p a n .  

1 3   K a t s u n o r i  U c h i d a ,  M D  

14  O n c o l o g i c  p a t h o l o g y ,  Mie U n i v e r s i t y  G r a d u a t e  S c h o o l  o f  M e d i c i n e ,  Mie ,  J a p a n .   15  Misao Yoneda , 

16  F a c u l t y  o f  H e a l t h  S c i e n c e ,  S u z u k a  U n i v e r s i t y  o f  M e d i c a l  S c i e n c e ,  M i e ,  J a p a n . 

1  K a z u k i  Kanayama, 

2  D e p a r t m e n t  o f  P a t h o l o g y ,  Mie U n i v e r s i t y  G r a d u a t e  S c h o o l  o f  M e d i c i n e ,  M i e ,  J a p a n .   3  H i r o y u k i  I n o u e ,  M D  

4  G a s t r o e n t e r o l o g y  a n d  H e p a t o l o g y ,  Mie U n i v e r s i t y  G r a d u a t e  S c h o o l  o f  M e d i c i n e ,  Mie ,  5  J a p a n .  

6  Y a s u h i r o  M u r a t a ,  M D  

7  H e p a t o b i l i a r y  P a n c r e a t i c  a n d  T r a n s p l a n t  S u r g e r y ,  Mie U n i v e r s i t y  G r a d u a t e  S c h o o l  o f   8  M e d i c i n e ,  M i e ,   J a p a n .  

9  N a o h i s a   K u r i y a m a ,  M D  

10  H e p a t o b i l i a r y  P a n c r e a t i c  a n d  T r a n s p l a n t  S u r g e r y ,  Mie U n i v e r s i t y  G r a d u a t e  S c h o o l  o f   1 1   M e d i c i n e ,  M i e ,  J a p a n .  

12  M a s a s h i  K i s h i w a d a ,  M D  

13  H e p a t o b i l i a r y  P a n c r e a t i c  a n d  T r a n s p l a n t  S u r g e r y ,  Mie U n i v e r s i t y  G r a d u a t e  S c h o o l  o f   14  M e d i c i n e ,  Mie ,  J a p a n .  

15  Masanobu U s u i ,  M D  

1  H e p a t o b i l i a r y  P a n c r e a t i c  a n d   T r a n s p l a n t  S u r g e r y ,  Mie U n i v e r s i t y  G r a d u a t e  S c h o o l  o f   2  M e d i c i n e ,   M i e ,   J a p a n .  

3  N o r i k o  I i ,  M D  

4  D e p a r t m e n t   o f   R a d i o l o g y ,  Mie U n i v e r s i t y   G r a d μ a t e   S c h o o l  o f  M e d i c i n e ,  Mie ,  J a p a n .   5  J u n y a  T s u b o i  

6  G a s t r o e n t e r o l o g y  a n d  H e p a t o l o g y ,  Mie  U n i v e r s i t y  G r a d u a t e  S c h o o l  o f  M e d i c i n e ,  Mie ,  7  J a p a n .  

8  S h u n s u k e   Tano 

9  D e p a r t m e n t   o f  Endoscopy ,  Mie U n i v e r s i t y  G r a d u a t e  S c h o o l  o f  M e d i c i n e ,  M i e ,  J a p a n .   10  Y a s u h i k o  Hamada 

11  D e p a r t m e n t   o f  E n d o s c o p y ,  Mie U n i v e r s i t y  G r a d u a t e  S c h o o l  o f  M e d i c i n e ,  Mie ,  J a p a n .   12  Kyosuke  T a n a k a  

13  D e p a r t m e n t   o f  E n d o s c o p y ,  Mie U n i v e r s i t y  G r a d u a t e  S c h o o l  o f  M e d i c i n e ,  M i e ,  J a p a n .  

LK 

O 

H  M 

−

n 

N 

A坐

15  D e p a r t m e n t   o f  E ndo s c o p y ,  Mie  U n i v e r s i t y  G r a d u a t e   S c h o o l   o f  M e d i c i n e ,  Mie ,  J a p a n .  

︒

p  o  m  o 

申l

n o  

可i

1  C l i n i c a l  R e s e a r c h  S u p p o r t  C e n t e r ,  Mie  U n i v e r s i t y   G r a d u a t e  H o s p i t a l ,  M i e ,  J a p a n .  

2  T a i z o  S h i r a i s h i ,  M D  

3  D e p a r t m e n t   o f  P a t h o l o g y ,   Mie  U n i v e r s i t y  G r a d u a t e   S c h o o l   o f   M e d i c i n e ,   M i e ,   J a p a n .  

4  Y o s h i y u k i  T a k e i ,   M D  

5  G a s t r o e n t e r o l o g y  a n d   H e p a t o l o g y ,  Mie  U n i v e r s i t y  G r a d u a t e   S c h o o l   o f   M e d i c i n e ,  Mie , 

6  J a p a n .  

7  Naoyuki Katayama ,  M D  

8  Hematology a n d  Oncology ,  Mie U n i v e r s i t y  G r a d u a t e  S c h o o l  o f  M e d i c i n e ,  M i e ,  J a p a n .  

9  Sh

i I s

i , M D

10  H e p a t o b i l i a r y  P a n c r e a t i c  and  T r a n s p l a n t  S u r g e r y ,  Mie U n i v e r s i t y  G r a d u a t e  S c h o o l  o f  

1 1   M e d i c i n e ,  M i e ,   J a p a n .  

12  13  14 

15 

16 

1 

2 

3  C o r r e s p o n d i n g  a u t h o r  and a d d r e s s  f o r  r e p r i n t  r e q u e s t s :  4  Sh

iI s

i , M. D .

5  H e p a t o b i l i a r y  P a n c r e a t i c  a n d  T r a n s p l a n t  S u r g e r y , 

6  Mie  U n i v e r s i t y  G r a d u a t e  S c h o o l  o f  M e d i c i n e ,  M i e ,  J a p a n . 2

1 7 4 E d o b a s h i ,  Tsu ,  Mi e ,  7  5 1 4

000 1 , J a p a n  

8  Te l :  + 8 1 ‑ 5 9 ‑ 2 3 2 ‑ 1 1 1 1  e x t .  6 4 7 0 ,  Fax :  + 8 1

5 9

232

8 0 9 5 9  E ‑ m a i l :  i s a j i

s @c l i n . m e d i c . m i e ‑ u . a c . j p

10 

11  R u n n i n g  t i t l e :  hENTl E x p r e s s i o n  by EUS‑FNAB i s  P r o g n o s t i c  Ma r k e r  12  F u n d i n g : 

13  T h i s  work was  s uppo

e di n   p a r t  b y  G r a n t s ‑ i n ‑ A i d  f o r  s c i e n t i f i c   r e s e a r c h

omJ a p a n   14  S o c i e t y  f o r  t h e  P r o m o t i o n  o f  S c i e n c e   ( 2 5 4 6 1 0 3 3 ) . 

15  D i s c l o s u r e :  The a u t h o r s  d e c l a r e  no c o n f l i c t  o f  i n t e r e s t .  

1  O b j e c t i v e s :  To  c l a r i

w h e t h e r   p r e t r e a t m e n t  human  e q u i l i b r a t i v e   n u c l e o s i d e   t r a n s p o r t e r  

2  (hENTl)  e x p r e s s i o n s  i n   e n d o s c o p i c   u l t r a s o n o g r a p h y ‑ g u i d e d   f i n e ‑ n e e d l e a s p i r a t i o n   3  b i o p s y  (EUS ‑ FNAB)  s p e c i m e n s  o b t a i n e d  f r o m  r e s e c t a b l e ,  b o r d e r l i n e  r e s e c t a b l e ,  a n d  

4  l o c a l l y   a d v a n c e d   u n r e s e c t a b l e   p a n c r e a t i c   d u c t a l  a d e n o c a r c i n o m a   (PDAC)  a r e  

5  c o n c o r d a n t   w i t h  t h o s e   i n   t h e   r e s e c t e d   s p e c i m e n   a

e r g e m c i t a b i n e ‑ b a s e d 

6  c h emora d i o t h e r a p y  (Gem‑CRT) ,  a n d   t o  v a l i d a t e  t h e   u t i l i t y  o f  hENTl e x p r e s s i o n   u s i n g  

7  EUS‑FNAB sam p l e s  a s  a  p r o g n o s t i c  m a r k e r .  

8  Methods :  We  e v a l u a t e d   t h e   r e l a t i o n s h i p   b e t w e e n  h ENTl e x p r e s s i o n s   a s s e s s e d   by 

9  i m m u n o h i s t o c h e m i c a l  s t a i n i n g  a n d   c l i n i c a l  o u t c o m e s  i n   t h e  5 1   o f  76 PDAC  p a t i e n t s  

10  w h o  we r e  d i a g n o s e d  b y  EUS‑FNA B  a n d   r e c e i v e d  p r e o p e r a t i v e   Gem ‑ CRT. 

11  R e s u l t s :  The  c o n c o r d a n c e   r a t e  of  hENTl  e x p r e s s i o n s  was 8 9 . 2 %  (K  =  0 . 6 8 1 ) .  Median 

1 2  s u r v i v a l  t i m e  ( m o n t h )  i n   t h e  5 1  whole  p a t i e n t s  a n d  37 w i t h  r e s e c t i o n  was s i g n i f i c a n t l y 

1 3  l o n g e r  i n  h ENTl  p o s i t i v e  t h a n  i n  n e g a t i v e :  2 5 . 0  and 3 0 . 0  v s .  9 . 0  and 9 . 0 ,  r e s p e c t i v e l y .  

14  A m u l t i v a r i a t e   a n a l y s i s   c o n f i r m e d   t h a t   hENTl  e x p r e s s i o n   was  an  i n d e p e n d e n t  

1 5  p r o g n o s t i c  f a c t o r  i n  b o t h   who l e  p a t i e n t s   and t h o s e  w i t h  r e s e c t i o n .  R e g a r d l e s s  of  T3  a nd 

1  T 4 ,  hENTl

p o s i t i v ep a t i e n t s   w i t h   r e s e c t i o n   h a d  s i g n i f i c a n t l y   b e t t e r   p r o g n o s i s   t h a n  

2  n e g a t i v e   p a t i e n t s ,  whose  p r o g n o s i s   was sim i l a r  t o  t h o s e  w i t h o u t  r e s e c t i o n . 

3  C o n c l u s i o n s :   The a s s e s s m e n t  o f  hENTl e x p r e s s i o n  u s i n g  EUS ‑ FNAB s a m p l e s  p r i o r  t o  

4  Gem‑CRT p r o v i d e s  i m p o r t a n t  i n f o r m a t i o n  on PDAC p a t i e n t s  who c a n  b e n e f i t  f r o m  

5  c u r a t i v e ‑ i n t e n t  r e s e c t i o n . 

6 

7  Key words: EUS

FNAB, h ENTl,  c h e m o r a d i o t h e r a p y ,  g e m c i t a b i n e ,  p a n c r e a t i c  d u c t a l   8  a d e n o c a r c i n o m a  

9 

1  INTRODUCTION 

2  Gemcitab i n e  (Gem) t h e r a p y   h a s  b e e n   t h e  s t a n d a r d  t r e a t m e n t  f o r  p a n c r e a t i c  d u c t a l  

3  a d e n o c a r c i n o m a  (PDAC)  s i n c e   B u r r i s  e t  a l .   [ 1 ]  r e p o r t e d  t h a t  Gem o f f e r e d  b e t t e r  o v e r a l l  

4  s u r v i v a l  (OS)  t h a n  f l u o r o u r a c i l .  However, i t s   e f f i c a c y  i s   l i m i t e d ;  o n l y  1 5 %  of  p a t i e n t s  

5  w i t h  r e c u r r e n t  and m e t a s t a t i c  PDAC [ 2 ]  a n d  up t o  30%  i n  g e n e r a l  [ 3 ]  c a n  b e   e x p e c t e d  t o  

6  r e s p o n d  t o   t r e a t m e n t .  B e c a u s e   Gem i s   s t r o n g l y  h y d r o p h i l i c ,  p a s s i v e  d i f f u s i o n  t h r o u g h  

7  h y d r o p h o b i c   c e l l u l a r   membranes i s   s l o w .   E f f i c i e n t   permea t i o n   of Gem  i n t o   c e l l s  

8  r e q u i r e s  s p e c i a l i z e d  i n t e g r a l  membrane t r a n s p o r t e r  p r o t e i n s   t o  c r o s s   p l asma  membranes 

9  [  4 ] .  Among t h e s e  t r a n s p o r t e r s ,  t h e  m

o rm e d i a t o r s   of Gem  u p t a k e  i n t o  human c e l l s  a r e  

10  t h e  human  e q u i l i b r a t i v e  n u c l e o s i d e  t r a n s p o r t e r  1  (hENTl)  and ,  t o   a  l e s s e r  d e g r e e ,  t h e  

11  human c o n c e n t r a t i v e  n u c l e o s i d e  t r a n s p o r t e r  3  (hCNT3) [ 5

7 ] .

12  The  hENTl h a s  b e e n  r e p o r t e d  a s  a n  i m p o r t a n t  p r e d i c t i v e  m a r k e r  o f  Gem ‑ b a s e d  

13  t h e r a p y   [ 8 ] .   I n   v i t r o   s t u d i e s   i n d i c a t e d   t h a t   hENTl g e n e  e x p r e s s i o n   was p o s i t i v e l y  

14  a s s o c i a t e d   w i t h   G e m ‑ c h e m o s e n s i t i v i t y   [ 9 ] .   High  hENTl  e x p r e s s i o n   i n   r e s e c t e d  

15  s p e c i m e n  was a l s o  r e p o r t e d  t o  b e  a s s o c i a t e d  w i t h  i n c r e a s e d  OS i n  PDAC p a t i e n t s  who 

16  r e c e i v e d  p o s t o p e r a t i v e  Gem‑based c h e m o t h e r a p y  [  1 0 ‑ 1 7 ] .   T h e s e  s t u d i e s  i n d i c a t e  t h a t  

1  hENT  1  e x p r e s s i o n  i s   i m p o r t a n t  i n   p r e d i c t i n g  t h e   s u r v i v a l   of PDAC p a t i e n t s   i n   t h e  

2  a d j u v a n t  s e t t i n g .   H o w e v e r ,  t h e r e  h a v e  b e e n  a  few r e p o

de s c r i b i n gt h e   i m p a c t  o f  

3  hENTl e x p r e s s i o n  on

eoutcome a f t e r  p r e o p e r a t i v e  Gem‑based c h e m o r a d i o t h e r a p y  

4  (Gem‑CRT)  i n  PDAC p a t i e n t s .  Our p r e v i o u s  s t u d y  showed  t h a t   hENTl e x p r e s s i o n  was  5  a n  i n d e p e n d e n t  p r e d i c t o r  of OS a f t e r  n e o a d j u v a n t  Gem‑CRT i n  t h e  p a t i e n t s  w i t h  Union 

6  I n t e r n a t i o n a l e  C o n t r e l e  C a n c e r  (UICC) T3 ‑ T4 [ 1 8 ] .   We  a l s o  r e p o r t e d  t h a t  p o s i t i v e  

7  e x p r e s s i o n  of  hENTl  i n  t h e  r e s e c t e d  s p e c i m e n  was t h e   s i g n i f i c a n t  p r o g n o s t i c  f a c t o r  

8  e s p e c i a l l y   f o r   t h e   t r e a t m e n t   o f  l o c a l l y   u n r e s e c t a b l e   (LUR) PDAC d e f i n e d   by t h e   9  Nat i o n a l   C o m p r e h e n s i v e   C a n c e r   Network (NCCN)

i d e l i n e s( 2 0 1 0 )  [ 1 9 ,  2 0 ] .  

10  Based on t h e s e  r e s u l t s ,  p r e t r e a t m e n t / p r e o p e r a t i v e  e v a l u a t i o n  o f  hENTl  e x p r e s s i o n  

11  i n   PDAC t i s s u e   c a n  be b e n e f i c i a l  i n   p r e d i c t i n g  t h e  e f f i c a c y  of Gem‑based t h e r a p y  

12  b e f o r e   i n i t i a l   t r e a t m e n t .   The s p e c i m e n s   o b t a i n e d   by e n d o s c o p i c  u l t r a s o u n d ‑ g u i d e d  

13  f i n e ‑ n e e d l e  a s p i r a t i o n  b i o p s y  (EUS‑FNAB) might b e  s u i t a b l e  f o r  e v a l u a t i n g  hENTl 

14  e x p r e s s i o n ;  h o w e v e r ,  t h e  immunohi s t o c h e m i c a l  ( I H C )  a n a l y s i s  of  hE NT l  e x p r e s s i o n  i n  

15  t h e  p a n c r e a t i c  t u m o r  t i s s u e  t a k e n  by  EUS ‑ F NAB  h a s  n o t  b e e n  e s t a b l i s h e d .  T h e r e  h a v e  

16  b e e n  s e v e r a l  s t u d i e s  w h i c h  examined g e n e   e x p r e s s i o n  i n c l u d i n g  hENTl i n  p r e ‑ t r e a t e d  

1  t i s s u e  b i o p s y   s a m p l e s  o b t a i n e d  by  EUS‑FNAB i n  t h e  p a t i e n t s  w i t h   u n r e s e c t a b l e  PDAC 

2  [ 2 1 ‑ 2 3 ] .  Based  on g e n e t i c  a n a l y s i s  of EUS‑FNAB  t i s s u e  samp l e s ,   i t   i s   s u g g e s t e d  t h a t  

3  hENTl mRNA e x p r e s s i o n  l e v e l s  m i g h t  b e  b i o m a r k e r s  f o r  p r e d i c t i n g  and m o n i t o r i n g   4  Gem s e n s i t i v i t y  i n   p a t i e n t s  w i t h  u n r e s e c t a b l e  PDAC  [ 2 3 ] .   The e x a m i n a t i o n  o f  t o t a l  

5  RNA  i s o l a t e d

om EUS ‑ FNAB t i s s u e  s a m p l e s  w i t h o u t   m i c r o ‑ d i s s e c t i o n  h a s  a  r i s k  of 

6  c o n t a m i n a t i n g  c e l l s  which c o u l d  l e a d  t o   f a l s e  r e s u l t s .   I n   c o n t r a s t ,  IHC a n a l y s i s  u s i n g  

7  EUS ‑ FNAB s a m p l e s   c a n   examine c a n c e r ‑ s p e c i f i c  e x p r e s s i o n  of  hENTl.  H o w e v e r ,   t h e r e  

8  h a v e  b e e n  no p r e v i o u s  r e p o r t s  pe r f o r

i i n g 田 C a n a l y s i s  of  hENTl  e x p r e s s i o n  i n  t h e  

9  p r e t r e a t m e n t  t i s s u e   t a k e n  by EUS‑FNAB and comparing t o   p o s t ‑ t r e a t m e n t  r e s e c t e d  

10  s p e c i m e n s  o f   PDAC.  One o f  t h e  r e a s o n s  why s u c h  s t u d i e s  were r a r e  i s   t h e   d i f f i c u l t y  i n 

11  o b t a i n i n g  s u f f i c i e n t  q u a n t i t y  o f  c a n c e r  c e l l s   f o r  IHC  a n a l y s i s ,  b e c a u s e  t h e  m a t e r i a l s 

12  a s p i r a t e d  f o r  a n a l y s i s  a r e  o f t e n  b l o o d y   a n d  c o n t a i n  c o n t a min a t i o n   f r o m   g a s t r o i n t e s t i n a l  13  t r a c t  e p i t h e l i u m   [ 2 4 ‑ 2 7 ] .  R e c e n t l y ,  Yamao e t  a l .   [ 2 4 ]  h a s   r e v e a l e d   t h a t   EUS ‑ FNAB  w i t h  

14  r a p i d  o n ‑ s i t e  e v a l u a t i o n  (ROSE) p r o v i d e s  more a c c u r a t e  d i a g n o s i s  t h a n  EUS‑FNAB  15  w i t h o u t  i t ,   b e c a u s e  a  c y t o p a

o l o g i s te n s u r e s  t h a t  t h e  s a m p l e s  t a k e n  by EUS‑FNAB a r e  

16  a d e q u a t e  f o r  a s s e s s m e n t .  B e c a u s e  s a m p l i n g  r a t e   o f  PDAC t i s s u e  i n   o u r  i n s t i t u t e  h a s  

1  b e e n  h i g h   owing t o  i n t r o d u c t i o n  o f   ROSE,  we c o u l d   r e t r o s p e c t i v e l y   e v a l u a t e  t h e  s t o r e d   2  c e l l  b l o c k  s p e c i m e n s  f o r  t h e  IHC a n a l y s i s   o f  hENTl e x p r e s s i o n .  

3  The  aim o f  o u r  s t u d y  was  t o  c l a r i f y  w h e t h e r   p r e t r e a t m e n t  hENTl  e x p r e s s i o n s  i n  

4  t h e  EUS‑FNAB  s p e c i m e n s  a r e  c o n c o r d a n t  w i t h  t h o s e  i n   t h e  r e s e c t e d  s p e c i m e n  a f t e r   5  Gem‑CRT,  and  t o  v a l i d a t e  t h e  u t i l i t y  o f   hENTl  e x p r e s s i o n   u s i n g   EUS‑FNAB s a m p l e s  

6  a s   a p r o g n o s t i c   m a r k e r   i n   t h e   l o c a l l y   a d v a n c e d   PDAC p a t i e n t s   who u n d e r w e n t   7  Gem‑CRT. 

8 

9  P a t i e n t s  and methods 

10  Between  F e b r u a r y  2005 a n d  November 2 0 1 1 ,  we  h a d   e n r o l l e d  1 1 7  p a t i e n t s  f o r  o u r  

1 1   Gem‑CRT  p r o t o c o l   r e p o r t e d   p r e v i o u s l y   [ 1 8 ,   1 9 ] ,   who  w e r e   c y t o l o g i c a l l y   o r  

12  h i s t o l o g i c a l l y  d i a g n o s e d   a s  PDAC  a n d   h a v i n g   UICC‑T3  a n d  ‑ T 4  t u m o r s  d e t e r m i n e d  by 

13  u s i n g   6 4 ‑ s l i c e   m u l t i ‑ d e t e c t o r   computed t o m o g r a p h y   (MDCT).  CT was p e r f o r m e d   14  a c c o r d i n g  t o   a  d e f i n e d  p a n c r e a s  p r o t o c o l  a s  4

p h a s i cc o n

s t ‑ e n h a n c e d MDCT w i t h  

15  t h i n   s l i c e s  a t   i n t e r v a l s  o f  1  mm. P a t i e n t s  were e x c l u d e d  when t h e y  showed e v i d e n t  

16  d i s t a n t   m e t a s t a t i c  l e s i o n s   a t  t h e   t i m e  o f  e n r o l l m e n t .  They  a l l  g a v e  t h e i r  w r i t t e n  i n f o r m e d  

1  c o n s e n t   f o r  i n c l u s i o n  i n  t h e  s t u d y .  Thes e  p a t i e n t s  were  a l s o  r e t r o s p e c t i v e l y  r e c l a s s i f i e d  

2  i n t o  t h e  t h r e e  r e s p e c t a b i l i t y   g r o u p s :   r e s e c t a b l e   ( R ) ,   b o r d e r l i n e  r e s e c t a b l e   ( B R ) ,  o r   l o c a l l y  

3  u n r e s e c t a b l e  ( L U R ) ,  a c c o r d i n g  t o

e NCCN  g u i d e l i n e s  ( 2 0 1 0 )  [  20  ]  . 

4  Out  of  t h e  1 1 7   p a t i e n t s ,   76 were  d i a g n o s e d   a s   PDAC by  c y t o l o g y   a n d / o r  h i s t o l o g y  

5  u s i n g  EUS

FNABs p e c i m e n  σ i g .  1 ) .   Among  76  c a s e s  9 4 . 7 %  ( 7 2 / 7 6 )  were  d i a g n o s e d  

6  by  c y t o l o g y ,  81.6% ( 6 2 / 7 6 )  were  d i a g n o s e d  by h i s t o l o g y ,  1 0 0 %  ( 7 6 / 7 6 )  were  d i a g n o s e d  

7  by e i t h e r   o f  two  methods .  We r e t r o s p e c t i v e l y   r e v i e w e d   t h e   f o r m a l i n   embedded 

8  s p e c i m e n s   o b t a i n e d  by  EUS‑FNAB f o r  t h e s e  76  p a t i e n t s ,  and t h e  a d e q u a t e  amount  of 

9  h i s t o l o g i c a l   s p e c i m e n s  r e q u i r e d  f o r  t h e  e x a m i n a t i o n  of hENTl e x p r e s s i o n  c o u l d  b e  

10  f o u n d   i n   52 p a t i e n t s   ( 6 8 . 4 % ) ,   a l l   o f  which c o u l d  h a v e  IHC s t a i n i n g   s u c c e s s

l l y

11  p e r f o r m e d .  Among  t h e s e  5 2  p a t i e n t s ,  hENTl p o s i t i v e  was f o u n d  i n   34 ( 6 5 . 4 % ) ,  of 

12  whom 29 ( 8 5 . 3 % )  c o u l d  r e c e i v e  r e s e c t i o n   and 5 ( 1 4 . 7 % )  c o u l d  n o t ,  w h i l e  hENTl 

13  n e g a t i v e  was f o u n d  i n   1 8   ( 3 4 . 6 % ) ,  of whom  o n e  was e x c l u d e d  due t o   r e f u s e d  of 

14  t r e a t m e n t ,   8  ( 4 7 . 0 % )  c o u l d  r e c e i v e  r e s e c t i o n  and 9  ( 5 3 . 0 % )   c o u l d  n o t .  

15  We  e v a l u a t e d   t h e   r e l a t i o n  b e t w e e n   hENTl  e x p r e s s i o n s   a n d   c l i n i c a l  c o u r s e s   i n  t h e s e  

16  5 1  p a t i e n t s .  The  s t u d y  measured  i n t r a t u m o r a l  hENT  1  e x p r e s s i o n ,  c o n c o r d a n c e  r a t e s  of 

1  hENTl e x p r e s s i o n s   of EUS‑FNAB s p e c i m e n s  w i t h   t h o s e   o f  r e s e c t e d   t u m o r s ,   a n d  

2  s u r v i v a l   a n a l y s i s  b a s e d  on  hENTl e x p r e s s i o n  ofEUS‑FNAB  s p e c i m e n .  

3 

4  EUS ・ FNAB procedure 

5  EUS was p e r f o

nedu s i n g   a  l i n e a r   aηay e n d o s c o p e   (GF‑UCP240;  Olympus 

6  M e d i c a l  S y s t e m s  C o . ,   L t d ,   Tokyo ,  J a p a n ) ,   c o n n e c t e d  t o   a  p r o c e s s o r  w i t h  a  c o l o r  

7  D o p p l e r  f u n c t i o n   (SSD

α 1 0 ;   H i t a c h i ‑ A l o k a  M e d i c a l . ,   L t d ,  T o k y o ,  J a p a n ) .   A f t e r  t h e  

8

morwas  i d e n t i f i e d  u s i n g   B  mode  i m a g i n g ,   we c o n f i r m e d  t h e  a b s e n c e  of v e s s e l s  i n  t h e   9  t a r g e t  a r e a  w i t h  t h e  c o l o r   D o p p l e r  m o d e .   A f t e r  we  p u n c t u r e d   an a s p i r a t i o n  n e e d l e   i n t o  

10  t h e

mor u n d e r  u l t r a s o n o g r a p h i c   g u i d a n c e ,  t h e  s t y l e t  was p u l l e d  o u t  a n d  t h e  s p e c i m e n  

11  was a s p i r a t e d  w i t h  a  20  ml  s y r i n g e

e nt h e   n e e d l e   moved  back  a n d  f o r t h  s e v e r a l  t i m e s  

12  w i t h i n   t h e

m o r . N e g a t i v e  p r e s s u r e  was r e l e a s e d  b e f o r e   t h e  n e e d l e   was removed  f r o m  

13  t h e

m o r .A c y t o l o g i s t  i m m e d i a t e l y  examined  t h e  s p e c i m e n  w i t h  ROSE  u s i n g  r a p i d  

14  s t a i n   ( D i f f ‑ Q u i k  s t a i n ;   I n t e r n a t i o n a l  R e a g e n t s ,  Kobe ,  J a p a n )  t o  v e r i f y  t h a t  s u f f i c i e n t  

15  s a m p l e  was o b t a i n e d .  When a  t e n t a t i v e  d i a g n o s i s  of m a l i g n a n c y  c o u l d  b e  made  by  t h e  

16  o n ‑ s i t e  e v a l u a t i o n ,  we f i n i s h e d  t h e  EUS

FNABp r o c e d u r e .   I f  n o t ,  we p e r f o r m e d  a n  

1  a d d i t i o n a l   one t o   two punc

r e st o   o b t a i n   t h e   d i a g n o s i s .   The  s p e c i m e n

ome a c h  

2  EUS‑FNAB p a s s   was f i x e d   i n   a l c o h o l   and  t h e n   s t a i n e d   u s i n g   t h e   P a p a n i c o l a o u  

3  m u l t i c h r o m a t i c  p r o c e d u r e .  The r e m a i n i n g  m a t e r i a l  was  f i x e d  i n   10% f o n n a l i n  and t h e n  

4  embedded i n   p

a f f i n f o r   t h e   c e l l   b l o c k   a n a l y s i s   t o   o b t a i n   h i s t o l o g i c a l   d i a g n o s i s  

5  ( h e m a t o x y l i n  and e o s i n ;   H&E). 

6 

7  IHC a n a l y s i s  and e v a l u a t i o n  o f  hENTl e x p r e s s i o n  

8  A f t e r  c y t o l o g i c a l  a n d / o r  h i s t o l o g i c a l  d i a g n o s i s  of  PDAC had been  c o n f i r m e d ,  we 

9  r e t r o s p e c t i v e l y  e v a l u a t e d   76  s t o r e d  c e l l  b l o c k   s p e c i m e n s  f o r   t h e  IHC  a n a l y s i s  o f   hENTl  10  e x p r e s s i o n :  IHC s t a i n i n g  was a b l e  t o  b e  p e r f o r m e d  s u c c e s s f u l l y  on 5 2  s p e c i m e n s ,  w h i l e  

11  t h e  r e m a i n i n g  24  f a i l e d .  The c a u s e s  of f a i l u r e  were  a s  f o l l o w s :  b l o o d   c l o t  a l o n e  i n  4 ,  

12  n o r m a l  p a n c r e a t i c  t i s s u e  i n  9 ,  and  a n  i n s u f f i c i e n t  q u a n t i t y  of  m a l i g n a n t   c e l l s  i n   1 1 .   F o r  

13  t h e   hENTl IHC  a n a l y s i s ,  we  u s e d   o n l y  c e l l  b l o c k  s a m p l e s ,  n e i t h e r  c o r e  b i o p s y  s a m p l e s  

14  n o r  c y t o l o g i c  s m e a r .  

15  The c e l l  b l o c k s  were  s l i c e d  i n t o  2‑μm p a r a f f i n  s e c t i o n s .  The  2

μms e c t i o n s  were 

16  u s e d   f o r  t h e  a s s e s s m e n t  of  i n t r a

m o r a l hENTl e x p r e s s i o n s  w i t h  i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y  

1  a s  w e l l  a s  b e i n g   s t a i n e d  w i t h   h e m a t o x y l i n   and e o s i n  (HE) .  I m r n u n o s t a i n i n g   p r o c e d u r e  

2  was done u s i n g  t h e  l a b e l e d   s t r e p t a v i d i n ‑ b i o t i n  p e r o x i d a s e  complex method w i t h  t h e  

3  Benchmark XT a u t o ‑ i r n m u n o s t a i n i n g   s y s t e m   ( V e n t a n a  J a p a n ,  Tokyo,  J a p a n ) .   The 

4  a n t i g e n  r e t r i e v a l   s t e p   was c a r r i e d  o u t  a t   9 0 ° C ,  30  m i n ,  and t h e n  t h e  s e c t i o n s  were 

5  i n c u b a t e d  i n   r a b b i t ‑ d e r i v e d  a n t i ‑ h E N T l  p o l y c l o n a l  a n t i b o d y  (Medica l  and  Bio l o g i c a l 

6  L a b o r a t o r i e s  C o . ,  L t d ,  Nagoya ,  J a p a n ) .  The  s e c t i o n s  were l a b e l e d  w i t h  an a u t o m a t e d  

7  i m r n u n o s t a i n i n g  s y s t e m  w i t h  I ‑ View d e t e c t i o n   k i t .   I m r n u n o s t a i n e d   s e c t i o n s  were l i g h t l y  

8  c o u n t e r s t a i n e d  w i t h

1 a y e r ' s h e m a t o x y l i n .  

9  The r e s e c t e d   s p e c i m e n s  were f i x e d  i n   a f o r m a l i n  s o l u t i o n ,  s l i c e d   i n t o   5

m m

10  s e c t i o n s  and embedded  i n  p a r a f f i n  b l o c k s .   A 3 , ‑ μm  s e c t i o n  was o b t a i n e d

ome a c h  

11  b l o c k   and s t a i n e d  w i t h  H&E. The s e c t i o n s  were r o u t i n e l y  examined f o r  p a t h o l o g i c a l  

12  d i f f e r e n t i a t i o n ,  and r e s e c t i o n   m a r g i n   s t a

s .The  h i s t o l o g i c a l   r e s p o n s e  o f  Gem‑CRT  was 

13  e v a l u a t e d  a c c o r d i n g  t o  E v a n s '   h i s t o p a

o l o g i c a l c r i t e r i a  [ 2 8 ] .  A c c o r d i n g   t o  t h e  r e s u l t  o f  

14  H&E  s t a i n i n g ,   t h e   most a p p r o p r i a t e   one s e c t i o n   which c o n t a i n e d

morc e l l s   r i c h  

15  e nou g h  f o r   immuno s t a i n i n g  was s t a i n e d  t o  a s s e s s   i n t r a t u m o r a l   hENTl e x p r e s s i o n  i n  t h e  

16  same manner a s

e EUS‑FNAB  s a m p l e s . 

1  Two p a t h o l og i s t s  ( T . S . ,  K . U . )   who  were  b l i n d e d  t o  t h e  c l i n i c a l  c h a r a c t e r i s t i c s  of 

2  t h e  p a t i e n t s  a s s e s s e d  EUS

FNABs a m p l e s  and  r e s e c t e d   s p e c i m e n s .  S c o r i n g   f o r   hENTl 

3  i m m u n o s t a i n i n g  was done on t h e  b a s i s  o f  t h e  r e l a t i v e  i n t e n s i t i e s   of s t a i n i n g  of  t h e  

4  c a n c e r  c e l l s ,  w i t h   r e f e r e n c e  t o  t h e  n o r m a l l y   s t r o n g  hENTl s t a i n i n g  o f  c y t o p l a s m  w i t h i n  

5  t h e  l ymphocytes i n  t h e   EUS ‑ FNAB samp l e s  and  o f   c e l l   membranes  w i t h i n   t h e   i s l e t s  o f  

6  L a n g e r h a n s  c e l l s  i n  t h e  r e s e c t e d  s p e c i m e n  a s   i n t e r n a l  con

o i s , r e s p e c t i v e l y .   The d e g r e e  

7  o f   hENTI  e x p r e s s i o n  i n  t h e  r e s e c t e d   s p e c i m e n  was  d e t e n n i n e d   by  t h e  i n t e n s i t y  a s  w e l l  

8  a s  e x t e n t  of  p o s i t i v e  s t a i n i n g  a c c o r d i n g  t o  o u r   p r e v i o u s  s t u d y  [  1 8 ] .  A  r e v i s e d  s c o r i n g  

9  s y s t e m  e x p r e s s i n g  t h e  d e g r e e  of  hENTJ e x p r e s s i o n  i n   t h e  EUS‑FNAB s a m p l e s  was 

1 0  d e v i s e d  b a s e d  on o u r  p r e v i o u s  s t u d y ;  t h e  s c o r i n g  s y s t e m  i s   r e p r e s e n t e d  a s  f o l l o w s :  a 

11  s c o r e   r a n g i n g  from  0  t o  3  was a s s i g n e d  b a s e d  on

e i n t e n s i t y   o f  s t a i n i n g ,  where 0  =  no 

12  s t a i n i n g ,  1  =  weakly p o s i t i v e ,   2  =  m o d e r a t e l y  p o s i t i v e  ( s

nei n t e n s i t y  a s   i n t e r n a l  

13  c o n t r o り ， and3  =  s t r o n g l y  p o s i t i v e .  The d e g r e e  of hENTl e x p r e s s i o n  was  d e f i n e d   a s  

14  h i g h  ( n e o p l a s t i c  c e l l s  w i t h  s c o r e  3  a c c o u n t i n g  f o r  more  t h a n  50 %  of t h e  t o t a l

mor

15  c e l l s ) ,  l ow ( n e o p l a s t i c  c e l l s  w i t h   s c o r e   0  o r   1  a c c o u n t i n g  f o r   more  t h a n  50 %  of t h e   t o t a l  

16  tumor c e l l s ) ,  and i n t e r m e d i a t e   ( a l l   o t h e r   n e o p l a s t i c   c e l l s ) .   We  d e f i n e d   h i g h   and 

1  i n t e r m e d i a t e  s t a i n i n g  a s  hENTl  p o s i t i v e ,  and  low  s t a i n i n g  a s  hENTl  n e g a t i v e  i n  b o t h  

2  EUS

FNABsamp l e s  and  r e s e c t e d  s p e c

i e n s ( F i g .  2 ) .  

3 

4  Treatment p r o t o c o l  

5  The  t r e a t m e n t   p r o t o c o l  o f   Gem‑CRT  was  d e s c r i b e d  by  o u r  p r e v i o u s  r e p o r t s  [ 1 8 , 

6  1 9 ) .   B r i e f l y ,   t h e   t o t a l   r a d i a t i o n   d o s e   was 45  Gy,  d e l i v e r e d   i n   25

a c t i o n s ( 5  

7

a c t i o n s / w e e k ) , and  t h e  p a t i e n t s  were  a d m i n i s t e r e d   a n   i n f u s i o n   of  Gem  a t  a  d o s e  of  800 

8  mg / m 2 on  d a y s  1 ,  8 ,  22 ,  and 29 f o r  one c y c l e .  The  p a t i e n t s  u n d e r w e n t  r e a s s e s s m e n t   a t  4 

9  t o  6  weeks a f t e r  t h e  c o m p l e t i o n   o f  Gem‑CRT; when we  d e t e r m i n e d

a t c u r a t i v e ‑ i n t e n t  

10  r e s e c t i o n  was  p o s s i b l e ,  t h e y  were  s c h e d u l e d  t o  u n d e r g o   p a n c r e a t e c t o m y .   At  t h e   t i m e  o f  

11  r e a s s e s s m e n t ,   e s p e c i a l l y   i n  t h e  c a s e  of LUR  p a t i e n t s ,  we  d e t e r m i n e d  t h a t   c u r a t i v e ‑ i n t e n t  

12  r e s e c t i o n  was p o s s i b l e  when t h e   f o l l o w i n g   f i n d i n g s   on MDCT were o b s e r v e d :   no 

13  s t e n o s i s  o r  change of s h a p e  i n   t h e  c e l i a c  t r u n k  and  SMA a s  w e l l  a s  t h e  a b s e n c e  o f  

14  m e t a s t a t i c  l e s i o n s  i n  o t h e r  d i s t a n t  o r g a n s .  Even a f t e r  we  d e c i d e d  t h a t  t h e  tumor was 

15  i n o p e r a b l e ,  we c o n t i n u e d  c h e m o t h e r a p y  m a i n l y  u s i n g  Gem.  P a n c r e a t i c o d u o d e n e c t o m y  

16  (PD) o r  d i s t a l  p a n c r e a t e c t o m y   (DP) was  p e r f o r m e d   a s  p r e v i o u s l y  d e s c r i b e d  [  1 8 ,  1 9 ) .  

1  From 6 weeks a f t e r  r e s e c t i o n ,   we  p l a n n e d  t o   s t a r t   t h e  p o s t o p e r a t i v e  chemotherapy 

2  r e g i m e n ,  c o n s i s t i n g   of  Gem  a t  a  d o s e  of 800 mg / m 2  b i w e e k l y  f o r  a t   l e a s t  6  m o n t h s .  

3  A f t e r  p a n c r e a t e c t o m y ,  a l l   p a t i e n t s  were e v a l u a t e d  a s   f o l l o w s :   p h y s i c a l   e x a m i n a t i o n  

4  e v e r y   month; l a b o r a t o r y  t e s t s  i n c l u d i n g   CEA  serum  l e v e l s   and CA19‑9  l e v e l s  e v e r y  2  o r  

5  3  m o n t h s ;  and MDCT  e v e r y  3  months  w i t h i n  2  y e a r s ,  and

e r e a f t e re v e r y   6  months  [  1 8 ,  

6  1 9 ) .  

7 

8  A n a l y s i s   of f a c t o r s  c o n t r i b u t i n g  t o  s u r v i v a l  

9  We  a n a l y z e d  v a r i o u s  c l i n i c o p a t h o l o g i c a l  f a c t o r s  i n   t h e  whole  p a t i e n t s  and t h o s e  

10  w i t h  r e s e c t i o n   i n   o r d e r   t o   c l a r i f y   t h e  s i g n i f i c a n t   p r o g n o s t i c   f a c t o r s ,   i n c l u d i n g   ( 1 )  

11  p r e ‑ t r e a t m e n t  f a c t o r s  s u c h  a s

morl o c a t i o n

mors i z e  b e f o r e  Gem‑CRT, UICC‑T 

12  c l a s s i f i c a t i o n ,  r e s p e c t a b i l i t y   a c c o r d i n g   t o   NCCN  g u i d e l i n e   2010 ,  and hENTl e x p r e s s i o n  

13  of EUS‑FNAB s a m p l e s ;   ( 2 )   p o s t ‑ t r e a t m e n t   c l i n i c a l   f a c t o r s ,  s u c h   a s   r e s p o n s e   t o  

14  Gem‑CRT  e v a l u a t e d  a c c o r d i n g  t o  t h e  Response E v a l u a t i o n  C r i t e r i a  i n   S o l i d  Tumors 

15 

CIST)[  29  ]  ,  r e d u c t i o n  r a t e   i n   serum c a r b o h y d r a t e  a n t i g e n  (CA)  1 9

9l e v e l   a s  

1  p r e v i o u s l y  d e s c r i b e d   [  1 9  ] ,  p r e s e n c e   of  d i s t a n t  m e t a s t a s i s  a f t e r   Gem‑CRT, and  hENTI 

2  e x p r e s s i o n  of  r e s e c t e d   s p e c i m e n . 

3 

4  S t a t i s t i c a l  a n a l y s e s  

5  The r e s u l t s   f o r  c o n t i n u o u s   v a r i a b l e s  were e x p r e s s e d  a s  mean  o r  median .  For  t h e  

6  c l i n i c o p a t h o l o g i c a l   f e a t u r e s   o f  t h e   p a t i e n t s ,  P v a l u e s  were c a l c u l a t e d   by χ t e s t   o r   7  F i s h e rs  e x a c t   t e s t ,  a s  a p p r o p r i a t e .   I n   t h e   whole p a t i e n t s ,  t h e  d a t e   of  t h e  i n i t i a l  t r e a t m e n t   8  was c h o s e n  a s  t h e  s t a r t i n g   p o i n t   f o r  t h e  measurement of s u r v i v a l   t i m e .  The day o f  f i n a l  

9  f o l l o w ‑ u p  was  December  3 1 ,  2013 ,  and t h e r e  was  no l o s s  o f  f o l l o w ‑ u p .  S u r v i v a l  t i m e  

10  was c a l c u l a t e d   u s i n g  t h e  K a p l a n ‑ M e i e r  method  and was compared between  t h e  g r o u p s  

11  u s i n g   t h e  Wilcoxons  t e s t .   The f a c t o r s  a f f e c t i n g  s u r v i v a l  t i m e  were a n a l y z e d  u s i n g  t h e   12  m u l t i v a r i a t e   Cox  p r o p o r t i o n a l  h a z a r d  m o d e l .  I n d i v i d u a l  v a r i a b l e s  w i t h  a  s i g n i f i c a n c e   o f  

13  P < 0 . 0 5   i n  t h e  u n i v a r i a t e   Cox  p r o p o r t i o n a l  h a z a r d  model were  s e l e c t e d  f o r  i n c l u s i o n  i n t o   14  t h e  m u l t i v a r i a t e  a n a l y s i s .  I n   t h e  m u l t i v a r i a t e  a n a l y s i s ,  v a r i a b l e s  w i t h  a  s i g n i f i c a n c e  o f  

15  p

0 . 0 5 were s e l e c t e d .  For a l l   s t a t i s t i c a l  t e s t s ,  a  P  v a l u e  l e s s  t h a n   0 . 0 5   was c o n s i d e r e d  

1  s t a t i s t i c a l l y  s i g n i f i c a n t .  A l l   s t a t i s t i c a l  a n a l y s e s  w e r e  p e r f o r m e d  u s i n g  SPSS v e r s i o n  2 0   2  (IBM I n c . ,  C h i c a g o ,  I L )  s o f t w a r e .  

3 

4  R e s u l t s  

5  Immunostaining and p a t i e n t  background 

6  P a t i e n t   c h a r a c t e r i s t i c s  a r e  s u m m a r i z e d   i n  T a b l e  1 .   Comparing  t o  t h e   whole  p a t i e n t s   7  a n d  t h o s e   w i t h  r e s e c t i o n ,  t h e   r e s e c t i o n  r a t e   a c c o r d i ng t o   t u m o r  l o c a t i o n ,  UICC ‑ T  8  c l a s s i f i c a t i o n ,  r e s e c t a b i l i t y   c l a s s i f i c a t i o n ,   a n d   hENTI"  e x p r e s s i o n   i n   EUS‑FNAB 

9  s a m p l e s   d i f f e r e d  s i g n i f i c a n t l y :  h e a d   v s .  body  I  t a i l  ( 8 5 . 3 %  v s .  4 7 . 1   %;  P=0 . 0 0 4 ) ,  T3 v s .  10  T4 ( 8 9 . 2%  v s .   5 2 . 2 % ;   P = 0 . 0 0 3 ) ,  r e s e c t a b l e   v s .   b o r d e r l i n e   r e s e c t a b l e   v s .   l o c a l l y  

11  u n r e s e c t a b l e  ( 4 0 . 0%  v s .   89.3% v s .   5 5 . 6 % ;  P = 0 . 0 1 ) ,  a n d  hENTl p o s i t i v e  v s .   hENTl 

12  n e g a t i v e   ( 8 5 . 3% v s .   4 7 . 1   %; P = 0 . 0 0 4 ) .  The p o s i t i v e   r a t e   o f  hENTl e x p r e s s i o n   i n   13  EUS‑FNAB s a m p l e s  was 6 6 . 7%  i n  t h e  w h o l e   5 1  p a t i e n t s  a n d   78.4%

t h e  3 7  p a t i e n t s   14  w i t h  r e s e c t i o n .  

15  We  e x a m i n e d   t h e  homology  o f  hENTl e x p r e s s i o n  b e t w e e n  p r e t r e a t m e n t  s a mple s 

16  o b t a i n e d   by EUS‑FNAB and r e s e c t e d   s p e c i m e n s   a f t e r   Gem ‑ CRT  i n   3 7   r e s e c t e d  

1 

( T a b l e   2 ) .  As  t h e   s t a

sof hENTl  e x p r e s s i o n  i n  t h e  r e s e c t e d   s p e c i m e n s  was 

2  d e t e r m i n e d   a s   c o n t r o l ,   s e n s i t i v i t y ,   s p e c i f i c i t y ,   p o s i t i v e   p r e d i c t i v e   v a l u e ,   n e g a t i v e  

3  p r e d i c t i v e  va l u e ,  and a c c u r a c y  of EUS‑FNAB s a m p l e s  were 9 3 . 1  %, 7 5 . 0 % ,  9 3 . 1   %, 

4  75.0%,  and  89.2% ,  r e s p e c t i v e l y .  T h e r e f o r e ,   t h e   r a t e   of  c o n c o r d a n c e   between 

5  EUS

FNABs a m p l e s  and r e s e c t e d  s p e c i m e n s  was 89.2%  (K  =  0 . 6 8 1 ) .  We  examined  t h e  

6  c h a r a c t e r i s t i c s  of t h e   4 p a t i e n t s   i n   whom hENTl  e x p r e s s i o n   d i f f e r e d   between 

7  EUS‑FNAB s a m p l e s   and r e s e c t e d   specimen ( T a b l e   3 ) .  I n   c a s e s   l  and 2 ,  hENTl 

8  e x p r e s s i o n  was  found  t o  be  n e g a t i v e  ( l o w )  i n   t h e  EUS‑FNAB s a m p l e s ,  w h i l e  p o s i t i v e  

9  ( i n t e n n e d i a t e )  i n   t h e  r e s e c t e d  s p e c i m e n .  On t h e  o t h e r   h a n d ,  i n  c a s e s  3  and 4 ,   i t   was 

10  p o s i t i v e  ( i n t e η n e d i a t e )  i n  t h e  EUS‑FNAB  s ample ,  w h i l e   n e g a t i v e   ( l o w )  i n  t h e   r e s e c t e d  

11  s p e c i m e n .  When w e  compared t h e   i n t e n s i t y  s c o r e s  of  hENTl s t a i n i n g   between t h e  

12  EUS

FNABs a m p l e s  and t h e  r e s e c t e d   s p e c i m e n  ( c o n t r o l )  a s   shown i n   T a b l e  3 ,   t h e  

13  i n t e n s i t y  s c o r e s  i n  t h e  r e s e c t e d  specimen  i n  a l l  of  4  c a s e s  c o n t a i n e d   more t h a n  two k i n d s  

14  of i n t e n s i t y  w i t h  v a r i o u s   dominant  a r e a ,  and t h o s e   i n  t h e   EUS

FNABs a m p l e s  c o n t a i n e d  

15  one o r  more s c o r e s  of t h e  r e s e c t e d  specimen w i t h  dominant a r e a  which was  d i

e r e n t

16  from t h e  r e s e c t e d  specim e n .   Thes e  f i n d i n g s  s u g g e s t e d  t h a t   t h e  d i s c r e p a n c y  between 

1  EUS‑FNAB s a m p l e s   a n d  r e s e c t e d  s p e c i m e n   o c c u r r e d  b e c a u s e  t h e  i n t e n s i t y  o f  s t a i n i n g  

2  and  i t s  a r e a   i n  t h e  r e s e c t e d   s p e c i m e n  v a r i e d  w i d e l y   i n  t h e s e  4  c a s e s .  

3  P a t i e n t  c h a r a c t e r i s t i c s  and e f f e c t  o f   gem ‑ CRT  a c c o r d i n g  t o  hENTl e x p r e s s i o n  

4  P r e ‑ t r e a t m e n t  c l i n i c a l   f a c t o r s   a n d  t h e   c l i n i c a l   r e s p o n s e  a f t e r  Gem‑CRT  i n   t h e  

5  whole p a t i e n t s   and t h o s e  w i t h   r e s e c t i o n   a r e   s u m m a r i z e d  i n   T a b l e  4 .  P r e ‑ t r e a t m e n t  

6  c l i n i c a l  f a c t o r s  i n  t h e  whole  p a t i e n t s  a s  w e l l  a s   i n   t h o s e  w i t h  r e s e c t i o n  d i d  n o t  d i f f e r  

7  b e t w e e n  hENTl  e x p r e s s i o n  p o s i t i v e  a n d   n e g a t i v e .  As f o r  RECIST  a f t e r  Gem‑CRT  i n  

8  t h e  whole  p a t i e n t s ,  t h e  p e r c e n t a g e   o f   t h e  p a t i e n t s  w i t h   p

r i a l r e s p o n s e  ( P R )   a n d   s t a b l e 

9  d i s e a s e  ( S D )  was s i g n i f i c a n t l y  h i g h e r  i n   hENTl p o s i t i v e  t h a n  i n  n e g a t i v e :  82.4%  v s .  

10  5 2 . 9% ( P = 0 . 0 4 7 ) .   D i s t a n t   m e t a s t a s i s   a

e r Gem‑CRT occuηed  s i g n i f i c a n t l y   l e s s  

1 1   f r e q u e n t l y   i n   hENTl p o s i t i v e   t h a n   i n   n e g a t i v e :  1 1 . 8 %  v s .   4 7 . 1   % ( P = 0 . 0 0 5 ) .  The 

1 2   i n c i d e n c e  o f   t h e  p a t i e n t s  w i t h  CA19

9 r e d u c t i o n  r a t e  o f  50%  o r   more  was s i g n i f i c a n t l y  

13  h i g h e r  i n  hENTl p o s i t i v e  t h a n  i n  n e g a t i v e :  64.7% v s .  24.5%  ( P = 0 . 0 0 6 ) .   I n   t h e  p a t i e n t s  

14  w i t h   r e s e c t i o n ,  t h e  i n c i d e n c e  o f  p a t i e n t s  w i t h  CA19

9r e d u c t i o n  r a t e  o f  50% o r  more 

15  was s i g n i f i c a n t l y   h i g h e r   i n  hENTl p o s i t i v e   t h a n   i n  n e g a t i v e :  75.9%  v s .  37.5%σ＝ 0 . 0 4 ) ,  

16  w h e r e a s  o t h e r  f a c t o r s   d i d  n o t  d i f f e r  b e t w e e n   t h e  two g r o u p s .  

1 

2  U n i v a r i a b l e   and m u l t i v a r i a b l e  a n a l y s i s  f o r  p r o g n o s t i c  f a c t o r s  

3  I n   t h e  whole p a t i e n t s ,   UICC ‑ T  c l a s s i f i c a t i o n  ( P   =  0 . 0 0 2 ) ,  hENTl e x p r e s s i o n  of 

4  EUS‑FNAB s a m p l e s  ( P

0 . 0 0I ) ,  r e s p o n s e  of Gem

CRT( P   <  0 . 0 0 1 ) ,  CA19

9r e d u c t i o n  

5  r a t e  ( P  

0 . 0 0 1 ) ,  and  d i s t a n t  m e t a s t a s i s  a

e r Gem ‑ CRT  ( P

0 . 0 0 1 )were  f o u n d  t o  be 

6  s i g n i f i c a n t ,  i n   t h e  u n i v a r i a t e  model ;  however ,  i n   t h e  m u l t i v a r i a t e  model ,  o n l y   hENTl 

7  e x p r e s s i o n   and  UICC‑T c l a s s i f i c a t i o n   were  found  t o   b e   s i g n i f i c a n t   i n d e p e n d e n t  

8  p r o g n o s i s   f a c t o r s   ( T a b l e   5 ) .  I n   t h e   p a t i e n t s   who u n d e r w e n t   r e s e c t i o n ,   UICC‑T 

9  c l a s s i f i c a t i o n  ( P   =  0 . 0 1 5 ) ,  hENTl  e x p r e s s i o n  of EUS

FNABs a m p l e s  ( P

0 . 0 0 1 ) and 

10  hENTI e x p r e s s i o n  of  r e s e c t e d  specimen  ( P  <  0 . 0 0 1 )   were f o u n d  t o   be s t a t i s t i c a l l y  

11  s i g n i f i c a n t  i n

eu n i v a r i a b l e  a n a l y s e s ;  h o w e v e r ,  once  a g a i n ,  i n  t h e   m u l t i v a r i a t e  mode l , 

12  o n l y   hENTl e x p r e s s i o n  and UICC‑T  c l a s s i f i c a t i o n  were  found  t o  b e   s i g n i f i c a n t  ( T a b l e  

13  5 ) .  

14  I n   t h e  5 1  whole p a t i e n t s  and 37  w i t h  r e s e c t i o n ,  s u r v i v a l  r a t e s  were  s i g n i f i c a n t l y  

15  h i g h e r  i n  hENTl  p o s i t i v e  t h a n  i n  hENTI n e g a t i v e   a s  shown i n  F i g u r e   3 .  F u r t h e r m o r e , 

16  we compared  s u r v i v a l  c u r v e s  a c c o r d i n g  t o  hENTl e x p r e s s i o n   i n  T3 ( F i g .  4a ,  b )  and T4 

1  p a t i e n t s   ( F i g .   S a ,   b  ) .   I n   T3 p a t i e n t s ,   t h e   s u r v i v a l  r a t e s  w e r e  s i g n i f i c a n t l y  h i g h e r  i n   2  hENTl p o s i t i v e   t h a n   i n   hENTl n e g a t i v e  i n   t h e  whole p a t i e n t s   a n d  i n   t h o s e  w i t h   3  r e s e c t i o n .   I n   T4 p a t i e n t s ,  t h e  s u r v i v a l   r a t e s  d i d  n o t  s i g n i f i c a n t l y   d i f f e r  b e t w e e n  hENTl  4  p o s i t i v e   a n d  n e g a t i v e   i n   t h e  w h o l e  p a t i e n t s ,  w h i l e  i n   t h e  p a t i e n t s  w i t h  r e s e c t i o n  t h e   5  s u r v i v a l   r a t e s   w e r e   s i g n i f i c a n t l y   h i g h e r   i n   hENTl  p o s i t i v e   t h a n   i n   n e g a t i v e .   6  I n t e r e s t i n g l y ,  s u r v i v a l  c u r v e s   i n  t h e  p a t i e n t s  w i t h o u t  r e s e c t i o n  ( 1 4  p a t i e n t s  i n  F i g .  3 b ,  3  7  i n   F i g .   4 b ,   a n d   1 1   i n   F i g . S b )  w e r e  v e r γ s i m i l a r  t o   t h o s e  of hENTl n e g a t i v e  w i t h   8  r e s e c t i o n  ( 8  i n  F i g .  3 b ,  6  i n  F i g  . 4 b ,  2  i n  F i g .  S b ) .  

9 

10  D i s c u s s i o n  

11  The hENT  1  e x p r e s s i o n  a s s e s s e d  i i t l m n u n o h i s t o c h e m i c a l l y   i n  t h e  r e s e c t e d  s p e c i m e n  

12  h a s  b e e n  p r o v e n  t o  b e  a  s i g n i f i c a n t  p r o g n o s t i c  m a r k e r  o f  PDAC  p a t i e n t s  u n d e r g o i n g  

13  Gem‑based a d j u v a n t  t h e r a p y  [ 1 0

1 8 ] ,a l t h o u g h  t h e  a s s e s s m e n t  method f o r  g r a d i n g  o f  

14  e x p r e s s i o n  a n d  r e f e r e n c e  c e l l s  ( L a n g e r h a n s  c e l l s  o r  l y m p h o c y t e s )  d i f f e r e d  among t h e  

15  s t u d i e s .   I n   o u r  p r e v i o u s  s t u d y  on t h e  5 5  p a t i e n t s  u s i n g  L a n g e r h a n s  c e l l s  a s  a  r e f e r e n c e  

16  [ 1 8 ] ,  s t a i n i n g  i n t e n s i t y  a n d  e x t e n s i o n  o f  s t a i n e d  t u m o r  c e l l s  ( I ‑ E )  w e r e  g r a d e d  a s  h i g h  

1  ( n = l 4 ,  2 5 . 5 % ) ,   i n t e r m e d i a t e   ( n = 2 5 ,  45 . 5 % ) ,   and  low  ( n = 1 6 ,   2 9 . 0 % ) .   High  and 

2  i n t e r m e d i a t e  were d e f i n e d  a s  p o s i t i v e  ( 7 1 . 0 % )  a n d   l o w  was d o n e   a s  n e g a t i v e  ( 2 9 . 0 % ) ,  

3  a n d  s u r v i v a l   r a t e   was s i g n i f i c a n t l y  h i g h e r  i n   t h e   hENTl p o s i t i v e  g r o u p  t h a n  i n   t h e  

4  n e g a t i v e  g r o u p .  Using l y m p h o c y t e s  a s  a  r e f e r e n c e ,  F a r r e l l  e t  a l .   ( 1 0 ]  r e p o r t e d  t h a t  I ‑ E 

5  was c a t e g o r i z e d  a s  h i g h  ( n = 3 4 ,  3 7 . 4 % ) ,  l o w  ( n = 3 9 ,  42.8%) ,  a n d  no s t a i n i n g  ( n = l 8 , 

6  1 9 . 8 % ) ,  i n  which  g r e a t e r  t h a n  50%  o f  c e l l s  showed no s t a i n i n g ,  and  t h a t  s u r v i v a l  r a t e  

7  was s i g n i f i c a n t l y   h i g h e r   i n   t h e   hENTl  h i g h / low t h a n   i n   t h e   no s t a i n i n g .  U s i n g  

8  L a n g e r h a n s  c e l l s  a s  a  r e f e r e n c e ,  Nakagawa e t  a l .   ( 1 6 ]  a l s o   r e p o r t e d  t h a t  I ‑ E  was  g r a d e d  

9  h i g h  ( n = 7 8 ,  7 1 . 6 % )  a n d  low ( n = 3 1 ,  2 8 . 4 % ) ,  and t h a t  s u r v i v a l  r a t e  was s i g n i f i c a n t l y  

10  h i g h e r   i n   t h e   hENTl h i g h

a ni n   t h e   l o w .   T h e r e f o r e ,   t h e   p r o p o r t i o n   o f  hENTl 

11  e x p r e s s i o n  was s i m i l a r  among t h e s e  p r e v i o u s  t h r e e  s t u d i e s ,   a l t h o u g h  t h e   a s s e s s m e n t  

12  method b a s e d  on I ‑ E   f o r  g r a d i n g  of  e x p r e s s i o n  s l i g h t l y  d i f f e r e d .  I n  c o n t r a s t ,   Kawada  e t  

13  a l .   ( 3 0 ]  r e v e a l e d  t h a t  hENTl e x p r e s s i o n  i n  t h e  r e s e c t e d  s p e c i m e n s   was  n o t   a s s o c i a t e d  

14  w i t h  p r o g n o s i s  i n   t h e  p a t i e n t s  who  u n d e r w e n t   r e s e c t i o n  a f t e r  p r e o p e r a t i v e  Gem‑CRT 

15  and  i m m e d i a t e l y   r e c e i v e d  p o s t o p e r a t i v e   l i v e r   p e r f u s i o n  c h e m o t h e r a p y  u s i n g  c o n t i n u o u s  

16  i n f u s i o n  o f   5

f l u o r o u r a c i l ( f o r  2 8   d a y s )  i n t o  t h e  h e p a t i c  a r t e r y   and p o r t a l   v e i n  t h r o u g h  a 

1  c a t h e t e r   i n s e r t e d   d u r i n g   t h e   s u r g i c a l   p r o c e d u r e .   They s ugge s t e d   t h a t   5

FU l i v e r  

2  p e r f u s i o n  h a d  a  n e g a t i v e  i m p a c t   on  t h e  r o l e  of  hENTl e x p r e s s i o n  i n  p r o g n o s i s .  

3  I f   p r e t r e a t m e n t  e v a l u a t i o n  o f   hENTl  e x p r e s s i o n  i n  PDAC s p e c i m e n  o b t a i n e d  by 

4  EUS

FNAB becomes p o s s i b l e  w i t h o u t  d i f f i c u l t y ,  i t   i s   v e r y   u s e

lt o  p r e d i c t   t h e  e f f i c a c y  

5  of Gem‑based t h e r a p y .   The IHC  a n a l y s i s   o f  hENTl e x p r e s s i o n  i n   t h e  EUS‑FNAB  6  s p e c i m e n s  h a s  n o t  b e e n  e s t a b l i s h e d  and t h u s  we f i r s t  examined w h e t h e r  p r e t r e a t m e n t  

7  hENTl  e x p r e s s i o n s  i n   t h e  EUS‑FNAB s p e c i m e n s  w e r e   c o n c o r d a n t  w i t h  t h o s e  i n   t h e  

8  r e s e c t e d  s p e c i m e n  a f t e r  Gem‑CRT. As a  r e s u l t ,  t h e  r a t e  o f   c o n c o r d a n c e   b e t w e e n  them 

9  was 8 9   . 2 % ,  which i s   h i g h e r

m

ep r e v i o u s  two  r e p o r t s  c o n c e r n i n g  t h e  o t h e r  

C

10  s t u d i e s :  86.5%

t h es t u d y  on SMAD4  p r o t e i n  and 73.9%  i n  t h e   s t u d y  on ZIP4 [ 3 1 ,  3 2 ] .  

11  The r e a s o n  why  t h e  c o n c o r d a n c e   r a t e  i n   t h e  t h r e e  s t u d i e s  i n c l u d i n g   o u r s  d i d  n o t  r e a c h  

12  I  00% i s  u n c l e a r .  

13  However we  c o u l d  i d e n t i f y  t h e  f e a t u r e s  of  t h e  4  p a t i e n t s  i n   whom  hENTl  e x p r e s s i o n  

14  d i f f e r e d   b e t w e e n   EUS ‑ FNAB s a m p l e s   and  r e s e c t e d   s p e c i m e n   by  c o m p a r i n g   t h e  

15  i n t e n s i t y  s c o r e s

di t s   a r e a  o f  hENTl s t a i n i n g  b e t w e e n  t h e  EUS

FNABs a m p l e s  a n d  

16  t h e  r e s e c t e d  s p e c i m e n :  t h e  i n t e n s i t y  of s t a i n i n g  and  i t . s  a r e a  i n   t h e  r e s e c t e d  s p e c i m e n  

1  v a r i e d   w i d e l y ,  i n d i c a t i n g   t h e  e x i s t e n c e  of  tumor h e t e r o g e n e i t y  i n  t h e s e  4  c a s e s .  A r e c e n t  

2  s t u d y  on t h e   e v a l u a t i o n   of K i ‑ 6 7  i n d e x   i n   p a n c r e a t i c   n e u r o e n d o c r i n e   t u m o r s   a l s o  

3  d e m o n s t r a t e d   i n t r a t u m o r a l   h e t e r o g e n e i t y   by  c o m p a r i n g   i t s   i n d e x   i n   EUS‑FNAB 

4  s p e c i m e n s  and  r e s e c t e d   s p e c i m e n s  a s  t h e  c r i t e r i o n  s t a n d a r d :  c o n c o r d a n c e  r a t e  r e m a i n e d  

5  7 4 . 0 %  u s i n g   t h e   mean K i ‑ 6 7  i n d e x   [ 3 3 ] .   I t   i s   however i n t e r e s t i n g   t o  n o t e   t h a t  Gem‑CRT 

6  d i d   n o t  a p p e

t oc h a n g e   t h e  p r e o p e r a t i v e / p o s t o p e r a t i v e  c o r r e l a t i o n  o f  hENT  1  s t a i n i n g .  

7  Using EUS

FNABs p e c i m e n s ,  o u r  hENT  1  IHC a n a l y s i s   c o u l d  be s u c c e s s

l l y

8  p e r f o r m e d   i n   68.4%  ( 5 2 / 7 6 )   among  t h e   c a s e s   d i a g n o s e d   c y t o l o g i c a l l y   a n d / o r  

9  h i s t o l o g i c a l l y  a s   PDAC, u n d e r   t h e  s i t u a t i o n s  t h a t  t h e  r e m a i n i n g  m a t e r i a l s  f o l l o w e d   by 

10  c y t o l o g i c / h i s t o l o g i c  d i a g n o s i s   were  u s e d  a n d

a tsome of a d e q u a t e  s a m p l e s   m i g h t   b e  

11  a l r e a d y  consumed  b e f o r e  t h e  IHC a n a l y s i s .   T h e s e   r e s u l t s   s u g g e s t e d  t h a t  EUS‑FNAB 

12  s p e c i m e n s  o b t a i n e d  from PDAC were  a p p r o p r i a t e  f o r  IHC  a n a l y s i s  of hENT

h t h e  

13  method  s i m i l a r  t o   o u r s  which  u s e d  t h e  r e m a i n i n g  s a m p l e s  a f t e r  d i a g n o s i s  t o   e v a l u a t e  

14  SMAD4 p r o t e i n ,  o n l y   44.4%  ( 5 2 / 1 1 7 )  c o u l d   b e   a n a l y z e d  [ 3 1 ] .  I t   i s   t h e r e f o r e  c o n s i d e r e d  

15  t h a t  t h e  s u c c e s s  r a t e  of IHC a n a l y s i s   u s i n g   EUS‑FNAB s a m p l e s  o b t a i n e d  from PDAC 

16  s p e c i m e n s  r e m a i n s   n o t   s o   h i g h .  C o n c e r n i n g  t h e  r e a s o n  why t h e  s u c c e s s  r a t e  r e m a i n s   low , 

1  Navina S ,   e t   a l .   [ 3 4 ]   r e c e n t l y   e v a l u a t e d   t h e   a d e q u a c y  of EUS‑FNAB s a m p l e s  o f  

2  p a n c r e a t i c  m a s s e s  f o r  t h e r a n o s t i c  s t u d i e s  by  a s s e s s i n g  c e l l u l a r i t y  of c y t o l o g y   m a t e r i a l .  

3  They  r e t r o s p e c t i v e l y  e v a l u a t e d  1 6 9  EUS‑FNAB s p e c i m e n s   w i t h  p o s i t i v e  d i a g n o s e s  o f   4  s o l i d  e p i t h e l i a l  p a n c r e a t i c  n e o p l a s m s  ( a d e n o c a r c i n o m a :  88%) f o r  s m e a r  and c e l l  b l o c k  

5  c e l l u l a r i t y .  C e l l u l a r i t y  o f  c e l l  b l o c k s   was s c o r e d  on a  s c a l e  of  1  t o  4  ( s c o r e  1  f o r  f e w e r  

6  t h a n  50 l e s i o n a l  c e l l s ,  s c o r e  2  f o r  5 0  t o   1 0 0 ,  s c o r e   3  f o r  1 0 0   t o  2 0 0 ,  a n d   s c o r e   4  f o r  more 

7  t h a n  2 0 0 ) ,  and  s c o r e s  o f   3  o r   4  w e r e   deemed  a d e q u a t e  f o r   a n c i l l a r y   s t u d i e s  s u c h  a s  IHC 

8  a n a l y s i s .  As a  r e s u l t ,  o n l y  1 2 . 4 %  o f   t h e  p o s i t i v e  c a s e s  h a d   a  c e l l  b l o c k   c e l l u l a r i t y  s c o r e  

9

a twas a d e q u a t e  f o r  t h e r a n o s t i c  s t u d i e s .  T h i s  s c o r e  was  n o t  a s s o c i a t e d  w i t h  ROSE,  1 0   n e e d l e  g a u g e ,  o r  number of p a s s e s .  Tumor  s i z e   a n d  f i b r o s i s  s c o r e  o f   r e s e c t e d  t u m o r s   1 1   c o r r e l a t e d  w i t h  c e l l u l a r i t y ,  b u t  o n l y   l a r g e r   s i z e  i n  p a n c r e a t i c   n e u r o e n d o c r i n e  t u m o r s  was 

1 2   s i g n i f i c a n t l y   a s s o c i a t e d   w i t h   a d e q u a c y .   F u r t h e r m o r e ,   7 5   PDAC  c a s e s   were  1 3  p r o s p e c t i v e l y  e v a l u a t e d  f o r  c e l l u l a r i t y  s c o r e :  s c o r e  0  i n  39%, s c o r e  1  t o  2  i n  49% ,  and 

14  s c o r e   3  i n   1 2 %.  Taking t h i s  c e l l u l a r i t y   s c o r e  1  t o  3  of 6 1  % a n d  o u r  r e s u l t  of y i e l d  68.4% 

1 5   f o r  hENTl IHC a n a l y s i s  t o g e

e r , t h e  c e l l u l a r i t y  s c o r e  1  o r   more  m i g h t  b e  enough f o r  

1 6   hENTl  IHC  a n a l y s i s .   C o n s e q u e n t l y ,   t o   e n h a n c e   t h e   c l i n i c a l   u t i l i t y   of 

1  p r e t r e a

i e n t / p r e o p e r a t i v eIHC  hENTl e x a m i n a t i o n ,  we  h a v e  t o  d e v e l o p  a  n o v e l  method 

2  t o   i m p r o v e  tumor c e l l  y i e l d ,  i n c l u d i n g  m o d i f i e d  c y t o l o g i c  t e c h n i q u e s  and  new n e e d l e  

3  d e s i g n s .  

4  Serum l e v e l s  of  CAI  9 ‑ 9  h a v e  b e e n  a c c e p t e d  a s  a  m e a s u r e  o f  p a n c r e a t i c  c a n c e r  

5  b u r d e n  and t h e  r o l e  of CA  1 9

9h a s  b e e n  r e c e n t l y  u n d e r s c o r e d  f o r  t h e  e v a l u a t i o n  of 

6  p a t i e n t s  w i t h  p r e t r e a t m e n t / p r e o p e r a t i v e  t h e r a p y   b e f o r e  p l a n n e d   s u r g i c a l  r e s e c t i o n .  Our 

7  p r e v i o u s  two s t u d i e s ,  which  e v a l u a t e d  t h e  c l i n i c a l  r e s p o n s e  a f t e r  Gem‑CRT f o r  PDAC 

8  a c c o r d i n g  t o   t h e  hENTl e x p r e s s i o n  i n   t h e  r e s e c t e d  s p e c i m e n ,  r e v e a l e d  t h a t  hENTl 

9  p o s i t i v e   g r o u p   had  s i g n i f i c a n t l y  h i g h e r  r e d u c t i o n  r a t e  of  CA  1 9 ‑ 9  t h a n  hENTl n e g a t i v e , 

10  a l t h o u g h  RECIST  d i d   n o t   d i f f e r  b e t w e e n  t h e  two g r o u p s  [ 1 8 ,  1 9 ] .   I n   o u r  p r e s e n t   s t u d y  

11  u s i n g  p r e t r e a t m e n t / p r e o p e r a t i v e   EUS‑FNAB 

n p l e si n  t h e   whole  p a t i e n t s ,  i n c i d e n c e   of 

12  t h e  p a t i e n t s  w i t h  CAI  9 ‑ 9  r e d u c t i o n  r a t e  of 50%  o r  more was  s i g n i f i c a n t l y  h i g h e r  i n  

13  hENTl p o s i t i v e  t h a n  i n  n e g a t i v e ,  a n d  p e r c e n t a g e  o f   t h e  p a t i e n t s  w i t h  PR  and SD i n  

14  RECIST  a f t e r  Gem ‑ CRT  was s i g n i f i c a n t l y  h i g h e r  i n  hENTl p o s i t i v e  t h a n  i n  n e g a t i v e .  

15  I n   t h e  p a t i e n t s  w i t h   r e s e c t i o n ,  h o w e v e r ,   RECIST  d i d  n o t  d i f f e r  between  t h e  two g r o u p s .  

16  C o n c e r n i n g   t h e  r e a s o n  why RECIST  r e s u l t s  d i f f e r e d  b e t w e e n  t h e  whole  p a t i e n t s  and 

1  t h o s e   w i t h   r e s e c t i o n ,  4 7 . 1   % ( 8 / 1 7 )  o f  hENTI  n e g a t i v e   showed  PD  a f t e r  Gem‑CRT a n d   2  a l l   o f   them c o u l d  n o t  r e c e i v e  p a n c r e a t e c t o m y ,   w h i l e  o n l y  18.6% ( 6 / 3 4 )  o f   hENTl  3  p o s i t i v e  showed  PD  a n d  o n e  o f   them  c o u l d  r e c e i v e  p a n c r e a t e c t o m y .  I t   was t h e r e f o r e   4  c o n s i d e r e d   t h a t  hENTl  e x p r e s s i o n  was  n o t   a s s o c i a t e d   w i t h  RECIST  i n  t h e  p a t i e n t s  w i t h   5  r e s e c t i o n .   O t h e r  t h a n  o u r  s t u d i e s   c o m p a r i n g  t h e   c l i n i c a l   r e s p o n s e   b e t w e e n  hENTl 

6  p o s i t i v e  and n e g a t i v e ,   P o p l i n   e t  a l .   [ 3 5 ]  e v a l u a t e d  c l i n i c a l  r e s p o n s e  u s i n g   RECIST a n d  

7  s u r

v i v a li n  m e t a s t a t i c  PDAC p a t i e n t s ,  a n d   hENTl  s t a

s had no i n f l u e n c e  o n  RECIST 

8  a n d  s u r v i v a l  ( M S T ) :  t h e  p e r c e n t a g e  o f   PR/CR  was 15.5% ( 9 / 5 8 )  and MST was 5 . 2  

9  m o n t h s  i n  hENTl h i g h ,  w h e r e a s  26.3% ( 3 0 / 1 1 8 )  a n d  6 . 1  months  i n  hENTl  l o w .  They 

10  c o n s i d e r e d  t h a t  t h e  r o l e  o f  hENTl was l e s s  i m p o r t a n t  i n  m e t a s t a t i c  d i s e a s e  t h a n  a f t e r  

1 1   s

g e r yw i t h  a  presumed m i c r o m e t a s t a t i c  s t a t e .   I n   c o n t r a s t ,   o u r  s t u d y  i n c l u d e d  t h e  

12  l o c a l l y   a d v a n c e d  ( T 3 / T 4 )  PDAC p a t i e n t s   w i t h o u t  d i s t a n t   m e t a s t a s i s   a t   t h e   t i m e   o f  

13  e n r o l l m e n t ,  and a t  t h e  t i m e  o f  r e a s s e s s m e n t  ( a b o u t  2

3 m o n t h s   a f t e r  e n r o l l m e n t )  d i s t a n t  

14  m e t a s t a s i s  became  a p p a r e n t   i n  23.5% ( 1 2 / 5 1 )  o f  t h e   p a t i e n t s :  hENTl p o s i t i v e  ( n = 4 )   a n d  

15  n e g a t i v e   ( n = 8 ) .   T h e s e   1 2   p a t i e n t s   d i e d   w i t h i n   1 2   months r e g a r d l e s s   o f  hENTl 

16  e x p r e s s i o n .  

1  As f o r  Gem ‑ b a s e d  p r e t r e a t m e n t   s t u d i e s  on hENTl  e x p r e s s i o n  i n  PDAC,  t o  t h e  b e s t  

2  of  o u r  k n o w l e d g e ,  t h e r e   h a v e  b e e n   f o u r   s

d i e si n c l u d i n g   o u r  s t u d y :  t h e   c l i n i c a l  

3  o u t c o m e s  o f   p a t i e n t s  u n d e r g o i n g  Gem‑CRT c o u l d  b e  p r e d i c t e d  by  IH C a n a l y s i s  of 

4  hENTl i n   EUS

FNABs a m p l e s  o b t a i n e d  from T3

4(R

R

UR)PDAC.  The o n e  

5  s t u d y ,   which  e v a l u a t e d   mRNA e x p r e s s i o n   l e v e l s  of hENTl  u s i n g   EUS‑FNAB 

6  s p e c i m e n s  o b t a i n e d  f r o m  s t a g e  I I I / I V  i n o p e r a b l e  (LUR and  m e t a s t a t i c )   PDAC p a t i e n t s ,  

7  d i d  n o t  show t h a t  i t s   e x p r e s s i o n  l e v e l s   i n f l u e n c e d  s u r v i v a l   [ 2 3 ] .   The r e m a i n i n g  two 

8  s t u d i e s  on  IHC hENTl e v a l u a t i o n  i n  PDAC,  o f  which one  u s e d  b i o p s y  s p e c i m e n s  of  9  m e t a s t a t i c  l e s i o n s   [ 3 4 ]   and t h e   o t h e r  u s e d  b i o p s y  s p e c i m e n s

omt h e   p r i m a r y  a n d  

10  m e t a s t a t i c  l e s i o n s  i n  s t a g e  I I I / I V  i n o p e r a b l e  (LUR and  m e t a s t a t i c )  p a t i e n t s  [ 3 6 ] ,   d i d   n o t  

11  demon s t r a t e  any s i g n i f i c a n t  d i f f e r e n c e s  i n  p r o g n o s i s  b e t w e e n   t h e  h i g h  a n d   low  hENTl 

12  s u b g r o u p s  e i t h e r .  The r e a s o n  f o r  c o n f l i c t i n g  r e s u l t s  b e t w e e n  o u r  s t u d y  and t h e  o t h e r  

13  t h r e e  p r o b a b l y   i s   t h a t  t h e  o t h e r   t h r e e  s t u d i e s  i n c l u d e d  o n l y  i n o p e r a b l e   p a t i e n t s  who  h a d  

14  b a s i c a l l y   p o o r  p r o g n o s i s  i n   i t s e l f ,   w h i l e  o u r s  i n c l u d e d  t h e  l o c a l l y  a d v a n c e d  ( T 3 / T 4 )  

15  PDAC p a t i e n t s   w i t h o u t  d i s t a n t   m e t a s t a s i s .   I t   i s   c o n s i d e r e d   t h a t   t u m o r  p r o g r e s s i o n  

16  i n f l u e n c e s  t h e  r o l e  of  hENTl e x p r e s s i o n  i n  c l i n i c a l  r e s p o n s e  a s  w e l l  a s  p r o g n o s i s  i n