１. は じ め に
アスコルビン酸 ( ビタ
ミン ) は水溶性のビタミンである｡ は グルコースから生合成される [１]｡ ヒト､ 霊長 類､ モルモットは グロノ γ ラクトン酸化酵素 の欠損により を合成することができない [２] (図１)｡ 細胞膜には還元型と酸化型 の両方のトランスポーターが存在する [３ ４]｡
1932年､ は
の結晶構造を報告し､ その生理作用が抗壊血病因 子であることを見い出した [５ ６]｡ 壊血病は 重篤な ｢ビタミン 欠乏症｣ で､ コラーゲンな どの細胞外マトリックス形成障害により毛細血管 や骨の脆弱化が起こり､ 出血や骨折さらに成長阻 止等を引き起こし､ 最後には死に至る｡ は コラーゲン合成過程において､ プロリンの水酸化 反応を促進するコファクターとして作用し､ 体内
両親媒性アスコルビン酸誘導体の抗酸化機能 田中 英彦
(平成16年11月30日受理)
( 30 2004)
( ) ( )
( )
( )
福岡大学理学部化学科
8 19 1 814 0180
のコラーゲン量を調節している｡
1970年､ は
の中で､ (１) 環境汚染物質やス トレスは肝臓や副腎での の消耗を増大させ る､ (２) を合成できる動物は１日に約10ｇ の を合成する､ (３) の吸収効率はヒ トが他の動物より格段に優れているとはいえない ということを根拠に､ の大量摂取 (数ｇ／
日) を提案した [７]｡ 大量に摂取された はシュウ酸に分解され､ 腎臓結石の原因との報告 があったが､ 水溶性である は短時間の内に のまま尿中に排泄されるため､ 害は無いと 考えられている｡ の提案は と壊血 病の関係だけに留まらない新しい の機能探 索のための出発点となった｡ また､ 今日､ 多くの
ビタミンやアミノ酸がサプリメントとして大量に 摂取されるようになった｡
1969年､ と によりスーパー オキシドジスムターゼ ( ) が見い出され､
生 体 内 で 生 じ る 活 性 酸 素 種 (
) の研究から､ が多くの疾患 の原因ではないかと考えられるようになった [８]｡
はミトコンドリアの電子伝達系や免疫防御 反応過程で､ 常に生体内で生成している｡ 健康な 状態では､ 生成する を やカタラーゼ 等の抗酸化酵素､ あるいは ､ グルタチオン､
ビタミン などの低分子抗酸化剤により消去し､
生成と消去のバランスが保たれている｡ しかし､
虚血や炎症等により､ このバランスが の生 成に傾くと､ 障害､ 脂質過酸化､ 酵素の失
図１ アスコルビン酸の生合成と代謝分解
図２ 活性酸素障害機構
活等により種々の疾患が起こると考えられている (図２)｡
はγ ラクトン環内にエンジオール基を持 ち､ 強い還元性を示す｡ 血漿中において は 最も重要な抗酸化剤である｡ さらに､ は膜 中で脂質ラジカルの消去に働くビタミン との 相乗効果により､ 様々な場において抗酸化作用を 示す [９ 10]｡
現代は大気汚染や様々なストレスにより ｢潜在 性ビタミン 欠乏症｣ の人口が増加しており､
長期化した場合､ 感染症､ 癌､ 動脈硬化等の生活 習慣病や老化の原因になっていると考えられてい る｡
２. の酸化と還元
の 値は約4 2で､ 生体内ではアニオ ン型として存在している｡ アニオンは酸素 や微量の遷移金属イオンにより容易に酸化され､
モノデヒドロアスコルビン酸 ( ) を経て デヒドロアスコルビン酸 ( ) となる｡ 生体 内では､ 生成した や はそれぞれの 還元酵素により ヘと還元される (図３)｡
では､ は加水分解により2 3 ジケトグ ロン酸になり､ さらに､ 溶液の ､ 酸素の有無 等 の 条 件 に よ り ､ 様 々 な 分 解 産 物 を 生 成 す る [11 12]｡
３. 5 メチル 3 4 ジヒドロキシテトロンの 生成と精製
を0 5 硫酸溶液中で90℃､ １時間加熱
すると､ から2 5 3
､ さらに､ 2 3 4
を経て5 メチル 3 4 ジヒドロキシテトロン ( ) が生成する (図４)｡ は と同 様に､ γ ラクトン環内にエンジオール基を持ち､
強い還元作用を示すと共に､ 5がメチル基であ ることから､ 有機溶媒にも可溶である｡ このこと は､ は水溶液中だけでなく､ 疎水的環境下 図３ アスコルビン酸の酸化と還元
図４ アスコルビン酸の分解と5 メチル 3 4 ジヒドロキシテトロンの生成
である膜内においても抗酸化作用を示す両親媒性 抗酸化剤として作用する可能性を示している｡
の精製過程を図５に示す｡ 加熱溶液中の を酢酸エチルで抽出した後､ 同時に抽出さ れる3 ヒドロキシ 2 ピロンとフロ酸を
10ゲルろ過と イオン交換ク
ロマトグラフィーにより除去し､ エーテル中で結 晶化した｡ 得られた結晶が であることを
13 スペクトルにより確認した [13]｡
４. の抗酸化作用
の水溶液中及び有機溶媒中でのフリーラジ カル消去能を測定した (図６)｡ ニトロキシ ( ) ラ ジ カ ル (3 2 2 5 5 3
1 ) を 10
7 4 ( ) に溶解した後､
あるいは を添加し､ ラジカルの電子ス ピン共鳴 ( ) シグナル強度の時間変化を測 定した｡ シグナル強度が50 減少する時間は､
中では､ は７分､ は15分であっ た｡ 同様に､ エタノール中では､ は17分､
は 25 分 と ､ い ず れ の 場 合 も に 比 べ は強い還元性を示した｡ 次に､ 脂肪酸の異 なった部位にニトロキシラジカルが結合したプ 図５ 5 メチル 3 4 ジヒドロキシテトロンの
精製過程
図６ 遊離ニトロキシラジカルの還元
●： ステアリン酸／エタノール､
■： ／エタノール､
▲：ビタミン ／エタノール､
○： ／ ､
□： ／
図７ リポソーム中のニトロキシラジカルの還元
○：5 ／ ､
□：5 ／ ､
●：16 ／ ､
■：16 ／
ロ ー ブ ､ ( 4 4 2 ) ( )をホスファチジルコリン ( ) リポソーム膜に取り込ませて様々な深さに スピンラベルし､ および による還元 作用を調べた (図７)｡ は膜表面にあるスピ ン プ ロ ー ブ (5 ) を わ ず か に 還 元 し た が ､
は 膜 表 面 の 部 位 だ け で な く ､ 膜 疎 水 部 (16 ) においても､ 強い還元作用を示した｡
さらに､ 脂溶性ラジカル発生剤2 2 (2 4 ) ( ) を リポソー ムに取り込ませ､ 膜内奥部で発生させた脂質ペル オキシラジカルを還元するかどうかを調べるため､
水溶液中に加えた と による脂質過酸 化抑制作用をチオバルビツール酸 ( ) 反応 により測定した (図８)｡ コントロールに比べ､
は強い脂質過酸化抑制作用を示したが､
は リポソームに取り込まれたビタミン と同程度の抑制作用を示した｡
スピンラベル法では､ が リポソーム 内奥部を標識した16 をほとんど還元しなかっ たのに対し､ による脂質過酸化誘導では 著しい抑制が見られた｡ これは､ リポソーム 内奥部の連鎖的な過酸化反応の過程で生じる脂質 ペルオキシラジカルのラジカル基が膜の表面近く 迄浮上するためと考えられている [14]｡
の実験において､ が十分な抗酸 化作用を発揮するためには､ 組織内に取り込まれ ることが必要となる｡ そこで､ マウスに を 腹腔内投与し､ 血漿と肝臓中に含まれる の 量を､ 逆相カラム ( 18) を用いる高速液体クロ マトグラフィーにより分離後､ 電気化学検出器に より測定した (図９)｡ 血漿中では､ 投与30分後 に と 濃度の上昇が見られ､ 90分後に はほぼ投与前の値に減少した｡ 肝臓では､
は投与30分後に投与前の約３倍の濃度迄上昇した 後､ 血漿中と同様に90分後にはほぼ投与前の値に 減少した｡ しかし､ は30分後でも濃度の上 昇は僅かであり､ 90分後にはほとんど検出されな くなった｡ これは､ が (１) 細胞内に取り 込まれなかった､ (２) 取り込まれたが細胞内で 分解された､ (３) 排泄が速い､ のいずれかによ るものと考えられる｡
５. 両親媒性 誘導体の合成
は両親媒性抗酸化剤として水溶液中だけ でなく､ 膜内部のラジカル消去作用を持つことを 示した｡ しかし､ は の酸化分解過程 で生成する物質であるために､ 分離精製に多くの 時間と操作が必要であった｡ また､ は生体
図８ リポソーム膜脂質過酸化抑制作用
○：コントロール､
●： ､
■： ､
▲：ビタミン
図９ マウスに投与したアスコルビン酸と 5 メチル 3 4 ジヒドロキシテトロン の濃度変化
●：肝臓／ ､
■：肝臓／ ､
○：血漿／ ､
□血漿／
内濃度が十分に上昇しないこともわかった｡
誘導体の開発研究はこれまで主に安定化 と脂溶化を目的に行われてきた｡ は光､ 熱､
酸化に対して最も不安定なビタミンであることか ら､ 安定に機能を発揮させる上で､ その安定化は 最も重要な課題とされてきた｡ また､ の体 内貯留性､ 吸収性の向上や食品の抗酸化のために 脂溶化が行われてきた｡ 現在､ 20種類以上の 誘導体が合成されており､ 様々な分野に利 用されている [15]｡
は様々な分解産物へと変化すると同時に､
褐変物質も生成する｡ 褐変物質は糖化反応を通し て､ 酵素や の機能を阻害する｡ また､ 水溶 性の誘導体では との生理作用の差異は期待
できないであろうし､ 脂溶性 誘導体は褐変 物質が長時間脂質内に留まり､ 生体にとって好ま しくないと考えられる｡ そこで､ 生体内に素早く 吸収され､ 比較的長時間安定に存在し､ 脂溶性 誘導体より速やかに対外へ排出される事が 期待できる両親媒性 誘導体の合成を行い､
その有用性を検討することとした｡
還元性を示すエンジオール基を保ち､ 脂溶性を 付加するために､ の 6に様々な長さのア シル基をエステル結合させた｡ と様々な鎖 長のビニル化合物を､ リパーゼを触媒として37℃
で３時間､ アセトン中で反応を行い､ 両親媒性 誘導体を得た (図10)｡ 合成した 誘導 体の構造式を図11に示す｡
図11 両親媒性アスコルビン酸の構造式 図10 両親媒性アスコルビン酸の合成反応
６. 両親媒性 誘導体の脂溶性
合成した 誘導体の脂溶性を調べるため､
逆相高速液体クロマトグラフィーによりそれぞれ の誘導体の を測定した (表１)｡
移動相には､ ５％あるいは15％メタノールを含む 0 05 リン酸緩衝液 6 0を用いた｡ 側鎖が長 くなるに従って､ も大きくなり､
脂溶性が大きくなったことを示している｡
は15％メタノールを用いた時も105分と著しく大 きな値を示した｡
７. 両親媒性 誘導体の抗酸化作用
赤血球ゴースト膜にスピンプローブ (5 と 16 ) をラベルし､ 両親媒性 誘導体によ る還元作用を測定した (図12)｡ 膜表面に存在す る5 をラベルした場合､ 誘導体の脂溶性 が大きくなるに従って､ スピンプローブの シ グ ナ ル 強 度 の 減 少 の 速 さ も 大 き く な っ た ｡
は急激な還元 (10分間で約50％の減少) の 後､ シグナルの減少は緩やかになった｡ 膜 内奥部にある16 の場合､ によるスピン プ ロ ー ブ の 還 元 は ほ と ん ど み ら れ な か っ た ｡
は5 の場合と異なり､ ほぼ直線的に シグナル強度が減少した｡ これらの結果は､
以外の 誘導体は時間と共にゆっくり と膜内奥部へと浸透して行くのに対し､ は ある深さまで急激に浸透した後､ さらに奥部へと 徐々に進むものと考えられる｡
次に､ 誘導体とビタミン の相乗作用を 調べた (図13)｡ リポソーム調製時にビタミ ン を取り込ませ､ 紫外線照射をして膜中のビ タミン を酸化した｡ その後､ 誘導体を加 えてビタミン を還元した後､ 再び紫外線照射
図12 両親媒性アスコルビン酸による赤血球ゴースト膜中のスピンプローブの還元 㪇
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㪘㫊㪘 㪘㪚㪘 㪚㪩㪘 㪧㪩㪘 㪙㪬㪘 㪟㪜㪘 表１ 両親媒性アスコルビン酸の
を行った｡ 紫外線照射16分と32分後におけるリポ ソームの脂質過酸化を 反応により測定した｡
ビタミン のみを含むコントロールよりも や を加えた場合､ 反応物質の生成が 抑制された｡ はこれらよりさらに強い抑制 作用を示した｡
膜内奥部で生成した脂質ペルオキシラジカルは 膜表面方向に移行してビタミン と反応する｡
この反応によりビタミン は酸化され､ その極 性 部 は 膜 表 面 に 露 出 し ､ バ ル ク 相 に 存 在 す る と膜表面で還元され､ 再び脂質ペルオキシ ラジカルの還元を行うと考えられている (図14) [16]｡
以上の事から､ は膜表面に移行してきた 脂質ペルオキシラジカルやのビタミン ラジカ ルを還元するだけでなく､ 膜内奥部で生成した脂 質ペルオキシラジカルを直接捕足して連鎖反応を 停止する可能性が考えられる｡
８. お わ り に
は多くの生理機能を持つことが知られる ようになり､ の生体内における重要性が益々 大きくなってきた｡ の効果はその還元性に よるものである｡ では､ の関与す る反応は２､ ３の連鎖反応で終了するため､ 反応
過程での の働きは分かりやすい｡ しかし､
においては､ 多くの反応が生体の恒常性 維持に密接に関係しており､ 投与された や その誘導体が､ と同じ効果を発揮すると は限らないために､ 予想と反した結果が得られる 場合もある｡ 生命維持､ 恒常性維持のための の働きを知るためには､ 生体内で起こる生 化学反応の詳細なネットワークを知る必要がある であろう｡
９. 謝 辞
ここで述べた研究は多くの卒業生の協力の結果 であり､ 特に荒木優子さん､ 久保田克弘君､ 鶴丸 武彦君､ 矢野杏子さん､ 扇洋子さんに感謝します｡
本稿は福岡大学理学部化学科談話会 (平成16年４ 月24日) において講演した内容をまとめたもので ある｡
文 献
１.
( )
( )
２. ( )
図13 両親媒性アスコルビン酸とビタミン に よるリポソーム膜脂質過酸化抑制 㪇㪅㪇
㪇㪅㪈 㪇㪅㪉
㪇 㪉㪇 㪫㫀㫄㪼㪆㫄㫀㫅 㪋㪇 㪍㪇
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Control Vitamin E
BUA HEA
AsA
図14 ビタミン の膜内分布とその脂質ペルオ キシラジカルの捕足ならびにアスコルビン 酸によるビタミン 再生のダイナミクスの 模式図
３.
( ) ４
( ) ５.
( ) ６
( ) ７.
( ) ８.
( ) ９.
( )
.
( ) .
( ) .
( ) .
( ) .
( ) . 山本 格 ビタミン ( ) . 福沢健治 ビタミン ( )
