炎症回復期に増加する新規炎症抑制性単球の同定

炎症回復期に増加する

新規炎症抑制性単球の同定

研究室 免 疫制御学研究室

第 １ 章 背 景

細 菌 感 染 や 組 織 傷 害 が 起 こ る と 、様 々 な 免 疫 細 胞 が 局 所 に 浸 潤 し 、急 性 炎 症 を 誘 発 す る 。 急 性 炎 症 に よ り 、微 生 物 や 組 織 傷 害 の 原 因 が 除 か れ る と 、速 や か に 組 織 修 復 が 行 わ れ 、組 織 の 恒 常 性 が 維 持 さ れ る 。炎 症 お よ び 組 織 修 復 の 長 期 化 や 調 節 不 全 は 、過 剰 な 線 維 化 や 組 織 の 機 能 不 全 の 原 因 と な る た め 1_{、 こ れ ら の 応 答 は 厳 密 に 制 御 さ れ て い る 。} 免 疫 細 胞 の 一 種 で あ る マ ク ロ フ ァ ー ジ は 急 性 炎 症 と 組 織 修 復 の 両 方 に 寄 与 す る こ と が 知 ら れ て お り 2_{、組 織 傷 害 時 の 治 療 タ ー ゲ ッ ト と し て 注 目 さ れ て い る 。組 織 傷 害 の 炎 症 期} で は 、組 織 常 在 マ ク ロ フ ァ ー ジ と 炎 症 部 位 に 浸 潤 し た 単 球 が 協 調 し て 、サ イ ト カ イ ン や ケ モ カ イ ン を 分 泌 し 、炎 症 を 惹 起 す る 。炎 症 初 期 に マ ク ロ フ ァ ー ジ を 消 去 す る と 、こ れ ら の サ イ ト カ イ ン 産 生 量 が 減 少 し 、 炎 症 が 大 幅 に 軽 減 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 3_{。 一 方 で 、}

回 復 期 に な る と 、マ ク ロ フ ァ ー ジ は 炎 症 を 収 束 し 、platelet derived growth factor（ PDGF） や transforming growth factor-b（TGF-b）、vascular endothelial growth factor-a（VEGF-a）な ど を 産 生 し 組 織 修 復 に 寄 与 す る 。回 復 期 に マ ク ロ フ ァ ー ジ を 消 去 す る と 、組 織 の 修 復 お よ び 再 生 が 遅 延 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 4_{。こ の よ う に 炎 症 期 と 回 復 期 で 、マ ク ロ フ ァ ー} ジ の 役 割 は 全 く 異 な る が 、 こ の マ ク ロ フ ァ ー ジ の 形 質 転 換 の メ カ ニ ズ ム は 明 ら か に な っ て い な い 。す な わ ち 、炎 症 型 の マ ク ロ フ ァ ー ジ が 、 局 所 の 状 況 に 応 じ て 回 復 期 に み ら れ る組 織 修 復 型 の マ ク ロ フ ァ ー ジ に形 質 を 変 化 さ せ る の か 、 あ る い は 骨 髄 で 異 な る 単 球 サ ブ セ ッ ト が 分 化 し 、 回 復 期 に 炎 症 型 に 代 わ っ て そ れ ら が 傷 害 部 位 に 浸 潤 す る の か 、 現 時 点 で は 不 明 で あ る （ 図 ）5_。

マ ウ ス 骨 髄 細 胞 を Macrophage-colony stimulating factor（ M-CSF） 存 在 下 で 培 養 す る と 、 骨 髄 由 来 マ ク ロ フ ァ ー ジ （bone marrow-derived macrophage :BMDM） と 呼 ば れ る 細 胞 を 誘 導 す る こ と が で き る 。BMDM を さ ら に異 な る サ イ ト カ イ ン の 組 み 合 わ せ に よ っ て 刺 激 す

る と 、M1 マ ク ロ フ ァ ー ジ 、 M2 マ ク ロ フ ァ ー ジ と 呼 ば れ る 形 質 の 異 な る 2 つ の 細 胞 を 誘

導 す る こ と が で き る 5 -7_{。Lipopolysaccharide（ LPS） と interferon-g（ IFN-g） の 刺 激 によ り}

誘 導 さ れ る M1 マ ク ロ フ ァ ー ジ は 、炎 症 促 進 性 サ イ ト カ イ ン（ interleukin（ IL）-6 や tumor

necrosis factor a（ TNFa） な ど ） や 活 性酸 素 の産 生 に よ り 、 炎 症 促進 や 抗 細 菌 活性 、 抗 腫

細 胞 で あ る が 、そ の 形 質 は 上 記 の 炎 症 期 、回 復 期 の マ ク ロ フ ァ ー ジ の も の と 合 致 す る こ と か ら 、マ ク ロ フ ァ ー ジ の 形 質 転 換 を 説 明 し う る モ デ ル と し て 広 く 認 め ら れ て い る 。一 方 で 、

こ の M1、 M２ マ ク ロ フ ァ ー ジ 分 類 は 、 生 体 に お け る マ ク ロ フ ァ ー ジ の 性 質 を 十 分 に 説 明

で き な い こ と も 分 か っ て き た 。こ れ ま で に 、M1 マ ー カ ー 遺 伝 子（ IL-6 や TNFa、nitric oxide

synthase 2（ NOS2） な ど ） や M2 マ ー カ ー 遺 伝 子 （ IL-10 や TGF-b、Ym1 な ど ） の 発 現 レ

第 ２ 章 実 験 方 法 お よ び 実 験 試 薬

Ym1-DTR マ ウ ス の 作 製

Ym1 遺 伝 子 を 含 む ゲ ノ ム ク ロ ー ン を 、BACPAC リ ソ ー ス CHORI か ら 得 た 。タ ー ゲ テ ィ ン グ ベ ク タ ー を 作 製 す る た め に 、Ym1 遺 伝 子 の 転 写 開 始 部 位 に 対 し て -4.0〜 +5.0 kbp の 領 域 を pBluescript II SK（ +）ベ ク タ ー（ Stratagene）に サ ブ ク ロ ー ニ ン グ し た 。次 い で 、BAC 組 換 え 技 術 に よ っ て 、 エ ク ソ ン 1 内 の ATG 開 始 部 位 を 含 む 15 bp の 断 片 を 、 ポ リ A 尾 部 を 含 む ヒ ト DTR（ HB-EGF）cDNA と 置 換 し た 。相 同 組 換 え 体 の 選 択 を 可 能 に す る た め に 、 FRT に 隣 接 す る Neo カ セ ッ ト を ヒ ト DTR 遺 伝 子 の 下 流 に ク ロ ー ニ ン グ し た 。チ ミ ジ ン キ ナ ー ゼ 遺 伝 子 を 5'ア ー ム の 上 流 に 挿 入 し 、ラ ン ダ ム な 組 換 え 体 を 排 除 し た 。 Ym1-DTR マ ウ ス を 作 製 す る た め に 、B6JN/1 ES 細 胞 に エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン に よ り 線 状 化 し た タ ー ゲ テ ィ ン グ ベ ク タ ー を ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し た 。G-418 お よ び ガ ン シ ク ロ ビ ル 耐 性 ク ロ ー ン を 選 別 し 、DIG DNA 標 識 キ ッ ト お よ び 検 出 キ ッ ト（ Roche）を 用 い て 、タ ー ゲ テ ィ ン グ ベ ク タ ー の 外 側 に 位 置 す る 284 bp DIG 標 識 DNA プ ロ ー ブ を 用 い た サ ザ ン ブ ロ ッ ト 解 析 に よ っ て ス ク リ ー ニ ン グ を 行 な っ た 。組 み 換 え の 起 こ っ た ES 細 胞 ク ロ ー ン を 用 い て 用 い て 、 凝 集 法 に よ り キ メ ラ マ ウ ス を 作 製 し た 。ES 細 胞 の 比 率 が 高 い キ メ ラ マ ウ ス を C57BL/6J マ ウ ス と 交 配 さ せ て +/Ym1D T R_{マ ウ ス を 作 製 し た 。 +/Ym1}D T R_{マ ウ ス を C57BL/6J} マ ウ ス に 4 世 代 以 上 戻 し 交 配 し 、野 生 型（ +/+）お よ び ヘ テ ロ 接 合 型 Ym1-DTR（ +/Ym1D T R_） の 同 腹 仔 を 解 析 に 用 い た 。Genotyping PCR に 用 い た プ ラ イ マ ー 配 列 は 表 1 に 示 す 。 Ym1-Venus マ ウ ス の 作 製

実 験 に 使 用 し た 試 薬 類 お よ び 購 入 し た メ ー カ ー は 、そ れ ぞ れ の「 方 法 」も し く は「 結 果 」 の 項 目 に 示 す 。 マ ウ ス に 投 与 し た LPS（ E.coli, O111:B4, Sigma） は 1x PBS（ Wako） で 懸 濁 し 、実 験 に 使 用 し た 。分 離 し た 細 胞 は 、デ ィ フ・ク イ ッ ク（Sysmex）を 用 い て 染 色 し た 。 染 色 方 法 は キ ッ ト 付 属 の プ ロ ト コ ル に 従 っ た 。

単 球 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ お よ び 樹 状 細 胞 の 単 離

マ ウ ス の リ ン パ 節 細 胞 を 調 製 す る た め 、 腋 窩 リ ン パ 節 と 膝 窩 リ ン パ 節 を 取 り 出 し 、10 µg/ml DNaseI（Worthington） お よ び 10 µg/ml Collagenase II（ Sigma-Aldrich）を 添 加 し た HBSS 内 で 37℃ 、 30 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 処 理 し た 組 織 を 70 µm の ナ イ ロ ン メ ッ シ ュ （AS ONE） に 通 し 、 FACS バ ッ フ ァ ー （ 1％ BSA（ Sigma-Aldrich） お よ び 2 mM EDTA （Dojindo） を 添 加 し た PBS） で 洗 浄 し 、 細 胞 は フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 解 析 に 使 用 し た 。 大 腸 の 粘 膜 固 有 層 か ら の 細 胞 を 調 製 す る た め 、大 腸 全 体 を 取 り 出 し 、PBS で 数 回 洗 浄 し て 糞 便 を 除 去 し て か ら ハ サ ミ で 縦 に 切 開 し た 。大 腸 を 2〜 3 cm の 長 さ で 切 り 、2％ FBS お よ び 20 mM EDTA（ pH 7.2） を 添 加 し た HBSS 内 で 、 37℃ 、 15 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 そ の 後 、 組 織 を PBS で 洗 浄 し て EDTA を 洗 い 流 し て か ら ピ ン セ ッ ト で 軽 く こ す り 、 残 り の 上 皮 層 を 除 去 し た 。次 に 組 織 を 5 mm 片 に 細 か く 刻 み 、2％ FCS、0.5 mg/mlCollagenase I（ Wako）、0.5 mg/ml DNase I（ Worthington）、1％ Dispase（ BD）お よ び 10％ HEPES（ Nacalai） を 添 加 し た RPMI 1640（ Wako）内 で 37℃ 、40 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。処 理 し た 断 片 を 70 µm Cell Strainer（ BD Biosciences） に 通 し 、 FACS バ ッ フ ァ ー で 洗 浄 し た 後 、 細 胞 は フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 解 析 も し く は セ ル ソ ー タ ー で 単 球 サ ブ セ ッ ト を 分 取 し た 後 、 遺 伝 子 発 現 解 析 に 使 用 し た 。

肝 臓 の マ ク ロ フ ァ ー ジ を 調 製 す る た め 、肝 臓 を Liver Perfusion Medium（ Gibco）を 用 い て 3 ml/分 の 流 速 で 8 分 間 灌 流 し た 。次 い で 、 肝 臓 を 0.5 mg/ml Collagenase IV（ Gibco） を 添 加 し た 基 本 灌 流 溶 液（136 mM NaCl、5.4 mM KCl、5 mM CaCl2、0.5 mM NaH2PO32H2O、

0.42 mM Na2HPO312H2O、10 mM HEPES （ pH 7.5）、5 mMGlucose お よ び 4.2 mM NaHCO3）

を 流 速 3 ml/分 で 8 分 間 灌 流 し た 。 灌 流 し た 肝 臓 を non-coated 10 cm dish（ Corning） に 移 し 、D-MEM, high glucose（ Dulbecco's Modified Eagle Medium; Wako） 内 で メ ス を 用 い て 小 片 に 細 断 し た 。 ピ ペ ッ テ ィ ン グ に よ り 細 胞 を 70 µm Cell Strainer に 通 した 。 100 g で 2 分 間 遠 心 分 離 し た 後 、上 清 を 新 し い チ ュ ー ブ に 移 し 、細 胞 ペ レ ッ ト が 見 え な く な る ま で 遠 心 分 離 を 繰 り 返 し た 。最 終 上 清 を 300 g で 5 分 間 遠 心 分 離 し 、沈 殿 し た 細 胞 を 2 ml BD Pharm Lyse Buffer（ BD Biosciences） に サ ス ペ ン ド し 、 室 温 で 80 秒 間 イ ン キ ュ ベ ー ト 、 次 い で FACS バ ッ フ ァ ー で 等 張 に な る よ う に 希 釈 し た 。遠 心 分 離 後 、FACS バ ッ フ ァ ー で 洗 浄 し 、 細 胞 は フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 解 析 に 使 用 し た 。

45 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。

肺 細 胞 を 調 製 す る た め 、肺 を 摘 出 し 、メ ス で 1 mm の 長 さ の 断 片 に 細 か く 刻 み 、0.2 U/ml Liberase TL（ Roche）お よ び 10 µg/ml DNase I（Worthington）を 添 加 し た HBSS 内 で 、37 ℃ 、 25 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。

ッ フ ァ ー で 洗 浄 後 、 死 細 胞 除 去 の た め に 1 µg/ml DAPI（ Dojindo） を 添加 し た FACS バ ッ フ ァ ー に サ ス ペ ン ド し 、 セ ル ソ ー タ ー （SH800） で 単 球 あ る い は 好 中 球 を 分 離 し た 。 マ ウ ス か ら 好 中 球 前 駆 細 胞（GP）あ る い は 単 球 前 駆 細 胞（ MoP）を 分 離 す る た め 、マ ウ ス 骨 髄 細 胞 を Lin 抗 体 （ CD4、 CD8、 B220、 NK1.1、 Ter119、 Sca-1、 CD11b、 Gr-1 お よ び 7/4） を 添 加 し 、 以 降 は 上 記 と 同 様 に 自 動 磁 気 細 胞 分 離 装 置 に よ り Lin 陰 性 細 胞 を 得 た 。 そ し て 、Lin 陰 性 細 胞 を c-Kit、CD16/32、Ly6C お よ び CD115 抗 体 で 染 色 し 、FACS バ ッ フ ァ ー で 洗 浄 後 、 死 細 胞 除 去 の た め に 1 µg/ml DAPI を 添 加 し た FACS バ ッ フ ァ ー に サ ス ペ ン ド し 、 セ ル ソ ー タ ー （SH800） で GP あ る い は MoP を 分 離 し た 。

定 量 的 RT-PCR（qRT-PCR） お よ び RNAシ ー ケ ン ス に 用 い る total RNAの 抽 出

セ ル ソ ー タ ー で 単 離 し た 細 胞 か ら RNeasy Mini （ あ る い は Micro） Kit（ QIAGEN） ま た は TRIzol LS（ Thermo Fisher Scientific）を 用 い て 、キ ッ ト に 付 属 し た プ ロ ト コ ル に 従 っ て total RNA を 抽 出 し た 。qRT-PCR 用 の サ ン プ ル は 、ReverTra Ace（ TOYOBO）を 用 い て 、 抽 出 し た total RNA を cDNA に 逆 転 写 し た 。qRT-PCR は 、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix （TOYOBO）を 用 い て 合 成 し た cDNA に 対 し て 行 っ た 。発 現 レ ベ ル を 18s リ ボ ソ ー ム RNA （rRNA） に 対 し て 標 準 化 し た 。 qRT-PCR に 用 い た プ ラ イ マ ー は 表 3 に 示 す 。

RNAシ ー ケ ン ス （RNA-seq）

SureSelect Strand-Specific RNA Library Prep Kit for Illumina Multiplexed Sequencing （Agilent Technologies）を 用 い て 、40 ng の total RNA か ら RNA-seq 分 析 の た め の DNA ラ イ ブ ラ リ ー を 調 製 し た 。 配 列 決 定 は HiSeq 1500HiSeq 1500 sequencer（ Illumina） を 用 い て 行 い 、50-bp single-end read mode で 行 っ た 。読 み 込 ん だ デ ー タ の FPKM（ fragments per kilo base of exon per million reads） 値 を 利 用 し て デ ー タ 解 析 を 行 っ た 。

In vitro の 単 球 刺 激 実 験

抗 Ym1モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 作 製

293T 細 胞 に Ym1-FLAG（ Ym1 タ ン パ ク の 3’末 端 に FLAG ペ プ チ ド を 合 成 し た ）発 現 ベ ク タ ー を リ ン 酸 カ ル シ ウ ム 法 に よ り ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し た 。培 養 上 清 中 のYm1-FLAG タ ン パ ク を ANTI-FLAG M1 Agarose Affinity Gel（ Aldrich）と FLAG Peptides（ Sigma-Aldrich） を 用 い て 精 製 し た 。 精 製 し た Ym1-FLAG タ ン パ ク を ア ル メ ニ ア ハ ム ス タ ー の 足 底 に 免 疫 し た 。初 回 免 疫 時 に は TiterMax Gold（ TiterMax）も 投 与 し た 。PEG1500（ Roche） を 用 い て 、リ ン パ 節 細 胞 を NSOb c l 2_{ミ エ ロ ー マ 細 胞 と 細 胞 融 合 さ せ た 。ハ イ ブ リ ド ー マ 細}

胞 を 、10％ FBS 、 HAT（ Sigma-Aldrich） お よ び 1％ BM-Condimed（ Roche） を 添 加 し た DMEM で 選 択 し た 。ハ イ ブ リ ド ー マ の 培 養 上 清 を ELISA で ス ク リ ー ニ ン グ し 、Ym1-FLAG タ ン パ ク を 特 異 的 に 検 出 す る 抗 体 産 生 ハ イ ブ リ ド ー マ を 選 択 し た 。

Ym1 ELISAの 樹 立

好 中 球 前 駆 細 胞 （GP） お よ び 単 球 前 駆 細 胞 （MoP） の in vitro培 養 実 験

野 生 型 あ る い は Ym1-Venus マ ウ ス の 骨 髄 か ら 分 離 し た GP あ る い は MoP を 10% FBS、 1% ペ ニ シ リ ン /ス ト レ プ ト マ イ シ ン（ Wako）お よ び 10 mM HEPES（ Nacalai）を 添 加 し た D-MEM, high glucose に 懸 濁 し 、 96 穴 プ レ ー ト に 3000 cells/well で 播 種 し た 。 培 養 時 に は 10% M-CSF（ CMG14-12 culture medium）、50 ng/ml rG-CSF（ Chugai）、20 ng/ml Recombinant Mouse GM-CSF（ BioLegend） あ る い は 10 ng/ml Murine IL-3（ Pepro Tech） を 単 独 も し く は 混 合 し て 添 加 し た 。72 時 間 培 養 し た 後 、 フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー で 表 面 マ ー カ ー 発 現 お よ び 細 胞 数 を 解 析 し た 。

統 計 処 理

デ ー タ は 、Prism（ GraphPad Software）を 用 い て 分 散 分 析（ ANOVA）ま た は T 検 定 に よ り 統 計 処 理 し た 。p <0.05 の 値 を 有 意 と み な し た 。

表 1 Genotyping PCRに 用 い た プ ラ イ マ ー 配 列

WT (Ym1-Venus / DTR) Fwd TAAGTTTTTCATATCCTCCCATCTATTTCC Rev TGGATTTGAATCTGTATGTAAGTAGAGCAC Targeted (Ym1-Venus) Fwd TAAGTTTTTCATATCCTCCCATCTATTTCC

Rev TTCTGCTGGTAGTGGTCGGC

Targeted (Ym1-DTR) Fwd TAAGTTTTTCATATCCTCCCATCTATTTCC Rev ACAGATGACAGCACCACAGC

表 3 フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 解 析 に 用 い た 抗 体 お よ び 試 薬

CD16/32 2.4G2 BD Biosciences CD45.1 A20 BD Biosciences CD62L MEL-14 BD Biosciences MHCII AF6-120.1 BD Biosciences SiglecF E50-2440 BD Biosciences

B220 RA3-6B2 Biolegend

CD106 (VCAM-1) 429 (MVCAM.A) Biolegend

CD115 AFS98 Biolegend CD117 (c-Kit) 2B8 Biolegend CD11b M1/70 Biolegend CD11c N418 Biolegend CD135 (Flt3) A2F10 Biolegend CD16/32 93 Biolegend CD19 6D5 Biolegend CD274 (PD-L1) 10F.9G2 Biolegend CD3 145-2C11 Biolegend CD34 HM34 Biolegend CD4 GK1.5 Biolegend CD45.2 104 Biolegend CD64 X54-5/7.1 Biolegend CD8 53-6.7 Biolegend CD88 (C5aR) 20/70 Biolegend F4/80 BM8 Biolegend Foxp3 150D Biolegend Gr-1 RB6-8C5 Biolegend Ly6C HK1.4 Biolegend

Ly6G 1A8 Biolegend

MHCII M5/114.15.2 Biolegend

NK1.1 PK136 Biolegend

Rat IgG2a, κ RTK2758 Biolegend Rat IgG2b, κ RTK4530 Biolegend

Sca-1 D7 Biolegend

SA-PerCP/Cy5.5 Biolegend Ter119 TER-119 Biolegend CD204 REA148 Miltenyi Biotec Ly6B.2 (7/4) REA115 Miltenyi Biotec REA Control REA293 Miltenyi Biotec CCR2 475301 R&D systems CXCR2 242216 R&D systems

第 ３ 章 結 果

１. 各 組 織 お よ び 末 梢 血 に お け る Ym1発 現 細 胞 の 同 定 Ym1 は 骨 髄 系 の 細 胞 に 発 現 す る こ と が 知 ら れ て お り 、 一 般 に 免 疫 抑 制 性 の 表 現 型 を 示 す M2 マ ク ロ フ ァ ー ジ の マ ー カ ー と し て 用 い ら れ る 。 と こ ろ が 、 生 体 内 に お け る Ym1 発 現 細 胞 お よ び 、 そ れ ら の 細 胞 に お け る Ym1 発 現 の 制 御 機 構 は 明 ら か に な っ て い な い 。 そ こ で 我 々 は 、生 体 内 で Ym1 発 現 細 胞 を 可 視 化 す る た め に 、Ym1 遺 伝 子 座 に 蛍 光 タ ン パ ク 質 の 一 つ で あ る Venus の 遺 伝 子 (cDNA)を 導 入 し た マ ウ ス （ Ym1-Venus マ ウ ス ） を 作 製 し た （ 図 1a、 b）。 ま ず 始 め に 、 こ の Ym1-Venus マ ウ ス を 用 い て 、 各 組 織 マ ク ロ フ ァ ー ジ お よ び 樹 状 細 胞 に お け る Ym1-Venus 発 現 細 胞 を 解 析 し た 。そ の 結 果 、図 1c に 示 す よ う に リ ン パ 節 、 脾 臓 、 大 腸 、 肝 臓 、 腹 腔 に 常 在 す る 組 織 マ ク ロ フ ァ ー ジ は Ym1-Venus 陰 性 で あ る こ と が 分 か っ た 。 一 方 で 、 肺 の 組 織 マ ク ロ フ ァ ー ジ に は Ym1-Venus 発 現 が み ら れ た 。 肺 の 組 織 マ ク ロ フ ァ ー ジ は 肺 胞 マ ク ロ フ ァ ー ジ （CD11c+_CD64+_{） と 間 質 マ ク ロ フ ァ ー ジ} （CD11b+_MHCII+_{）に 大 別 さ れ る が 、前 者 の み が Ym1-Venus 陽 性 だ っ た 。肺 胞 マ ク ロ フ ァ} ー ジ に Ym1 が 発 現 す る こ と は す で に 知 ら れ て お り 1 0_{、 既 報 と 一 致 し た 結 果 で あ っ た 。 続} い て 、 末 梢 血 細 胞 に お け る Ym1-Venus 陽 性 細 胞 の 有 無 を 解 析 し た 。 Ym1 が 好 中 球 に 発 現 す る こ と は す で に 報 告 さ れ て い る が11 , 12_{、こ れ ら の 既 報 と 一 致 し てLy6G}+_{の 好 中 球 は}

Ym1-Venus 陽 性 だ っ た （ 図 1d、 e）。 さ ら に 、 脾 臓 （ 図 1f） お よ び 骨 髄 （ 図 2a） の 好 中 球 で も Ym1-Venus 発 現 が み ら れ た 。 骨 髄 に お い て 、 好 中 球 は c-Kit+_Ly6G-_{の 好 中 球 前 駆 細 胞 か ら}

分 化 す る が 、そ の 分 化・成 熟 が 進 む に つ れ て 、c-Kit 発 現 が 減 少 し 、Ly6G 発 現 が 増 加 す る

1 3_{。Ym1-Venus マ ウ ス の 骨 髄 に お い て 、好 中 球 分 化 段 階 ご と の Ym1-Venus 発 現 を 解 析 し た}

と こ ろ 、図 2b に 示 す よ う に 成 熟 好 中 球（ 図 2b、第 5 分 画 ）の み な ら ず 、未 熟 好 中 球（ 図 2b、 第 2-4 分 画 ） に お い て も Ym1-Venus 発 現 が み ら れ た 。 Ym1 mRNA 発 現 を 定 量 的 RT-PCR に よ り 解 析 し た と こ ろ 、未 熟 好 中 球 の ほ う が 成 熟 好 中 球 よ り も Ym1 mRNA 発 現 が 高 い こ と が 分 か っ た（ 図 2c）。こ の こ と か ら 、Ym1 は 好 中 球 分 化 の 初 期 段 階 か ら 発 現 す る こ と が 示 さ れ た 。我 々 は さ ら に 、末 梢 血 、脾 臓 お よ び 骨 髄 の 好 酸 球 、リ ン パ 球（T、B 細 胞 ） お よ び NK 細 胞 の Ym1-Venus 発 現 を 解 析 し た が 、 こ れ ら の 細 胞 は 全 て Ym1-Venus 陰 性 だ っ た （ 図 1d、 e、 f、 2a）。 我 々 は 末 梢 血 に お い て 、好 中 球 以 外 に も CD115+_Ly6Ch i_{単 球 の 一 部（5%）が Ym1-Venus}

陽 性 で あ る こ と を 見 い だ し た（ 図 1d、e）。末 梢 血 の 単 球 は 、CD115+_Ly6Ch i_{と CD115}+_Ly6Cl o

単 球 の ２ つ の サ ブ セ ッ ト に よ り 構 成 さ れ て い る が 1 4_{、 定 常 状 態 で は CD115}+_Ly6Ch i _{サ ブ}

セ ッ ト に の み 、Ym1-Venus 陽 性 細 胞 が 存 在 す る こ と が 分 か っ た 。 こ の Ym1-Venus 陽 性 の CD115+_Ly6Ch i_{単 球 は 脾 臓 に お い て も み ら れ た （ 図 1f）。}

Ym1-Venus 陽 性 Ly6Ch i_{単 球 に お け る Ym1-Venus 発 現 が ど の 分 化 段 階 か ら み ら れ る か 明}

球 の Ym1-Venus 発 現 を 解 析 し た と こ ろ 、末 梢 血 と 同 様 に Ly6Ch i_{単 球 の 一 部（4%）が}

Ym1-Venus 陽 性 だ っ た（ 図 2a）。最 近 、Ly6Ch i_{単 球 は Flt3 と CD11c の 発 現 を 指 標 に 3 つ の サ ブ}

セ ッ ト に よ り 構 成 さ れ る こ と が 報 告 さ れ て い る 1 5_{。 こ の 報 告 に 従 っ て Ly6C}h i_{単 球 を 解 析}

し た と こ ろ 、Flt3-_CD11c-_{サ ブ セ ッ ト の み Ym1-Venus}+_{細 胞 が み ら れ た（ 図 2d）。Ly6C}hi_{単 球}

は マ ク ロ フ ァ ー ジ あ る い は 樹 状 細 胞 に 分 化 す る が 、Flt3-_CD11c-_{サ ブ セ ッ ト は マ ク ロ フ ァ ー}

ジ に 分 化 す る 細 胞 集 団 で あ る 1 5_{。 さ ら に 我 々 は 、 骨 髄 系 前 駆 細 胞 に お け る Ym1-Venus 発}

現 を 解 析 し た 1 6_{。 そ の 結 果 、 骨 髄 系 共 通 前 駆 細 胞 （CMP） お よ び 、 顆 粒 球 単 球 前 駆 細 胞}

（GMP）、 巨 核 球 赤 芽 球 前 駆 細 胞 （ MEP） に Ym1-Venus 発 現 は み ら れ な か っ た （ 図 2e）。 単 球 は GMP か ら 単 球 樹 状 細 胞 前 駆 細 胞（ MDP）、単 球 前 駆 細 胞（ MoP）を 経 て 分 化・成 熟 す る こ と が 知 ら れ て い る 17_{。MDP 以 降 の 分 化 段 階 に お け る Ym1-Venus 発 現 を 解 析 し た と} こ ろ 、c-Kit 発 現 の 低 下 し た 分 化 終 盤 の 単 球 か ら Ym1-Venus が 発 現 す る こ と が 分 か っ た （ 図 2f）。 こ れ ら の 結 果 か ら 、骨 髄 で は Ym1 は 単 球 前 駆 細 胞 に は 発 現 せ ず 、分 化 終 盤 の Ly6Chi_単 球 サ ブ セ ッ ト の ご く 一 部 に 発 現 す る こ と が 明 ら か に な っ た 。 ２. 敗 血 症 回 復 期 に お け る Ym1+_Ly6Ch i_{単 球 の 増 加} Ly6Chi _{単 球 は 血 中 か ら 炎 症 部 位 に 浸 潤 し 、 病 原 体 の 排 除 や 組 織 傷 害 に 伴 う 炎 症 の 制 御} に 寄 与 し て い る 。我 々 は 定 常 時 の 解 析 に 続 い て 、炎 症 時 の Ly6Ch i_{単 球 に お け る Ym1-Venus} 発 現 を 経 時 的 に 解 析 し た 。こ の 目 的 の た め に 、Ym1-Venus マ ウ ス に LPS を 静 脈 投 与 し た 。 LPS 投 与 に よ る 炎 症 の 惹 起 は 、敗 血 症 モ デ ル と し て 広 く 用 い ら れ て い る 18 , 1 9_{。炎 症 性 サ イ} ト カ イ ン で あ る TNFaや IL-6 の 血 清 中 濃 度は 、LPS 投 与 2 か ら 4 時 間 後 に ピー ク に 達 し 、 24 時 間 後 に は 定 常 時 の レ ベ ル ま で 減 少 す る （ 図 3a） こ と か ら 、 全 身 性 炎 症 が 急 激 に 惹 起 さ れ 、そ の 後 急 速 に 収 束 に 向 か う と 考 え ら れ る 。末 梢 血 中 の 好 中 球 の 割 合 は 、LPS 投 与 24 時 間 後 に 増 加（ 定 常 時 の 21.4%か ら 79.4%に 増 加 ）し 、72 時 間 後 に は 定 常 時 と 同 じ 割 合 ま で 減 少 し た（ 図 3b）。一 方 で 、Ly6Ch i_{単 球 の 割 合 は LPS 投 与 24 時 間 後（ 1.53%）に は 定 常} 時（1.10%）と 変 化 が な か っ た が 、LPS 投 与 48 時 間 後 に は そ の 割 合 が 増 加 し 、末 梢 血 白 血 球 中 の 6%を 占 め た（ 図 3b）。 興 味 深 い こ と に 、Ym1+_Ly6Ch i_{単 球 の 割 合 は 炎 症 回 復 期 に 劇} 的 に 増 加 し た 。す な わ ち 、Ly6Ch i_{単 球 の う ち 、Ym1}+_{細 胞 の 割 合 は LPS 投 与 24 時 間 後 に は} お よ そ 10%程 度 で あ っ た が 、炎 症 の 回 復 期 と 考 え ら れ る 48 時 間 後 に は お よ そ 50%ま で 増 加 し た （ 図 3b、 c）。 LPS 投 与 72 時 間 後 に は Ym1+_Ly6Ch i_{単 球 の 割 合 は 24%ま で 減 少 し た} が 、 定 常 状 態 や 炎 症 の 急 性 期 に は Ym1-Venus 発 現 が み ら れ な か っ た Ly6Clo _{単 球 の 一 部} （5.18%）に も Ym1-Venus 陽 性 細 胞 が み ら れ る よ う に な っ た 。Ly6Chi_{単 球 は 末 梢 に お い て 、} Ly6Clo _{単 球 に な る こ と が 報 告 さ れ て い る こ と か ら} 1 7 , 20 - 2 3_{、 LPS 投 与 72 時 間 後 に お け る}

Ym1+_Ly6Cl o_{単 球 の 出 現 は 、Ym1}+_Ly6Ch i_{単 球 が Ly6C}lo _{単 球 に な る 可 能 性 を 示 唆 し て い る 。}

末 梢 血 お よ び 脾 臓 の 解 析 結 果 と 同 様 に 、LPS 投 与 48 時 間 後 の 骨 髄 に お い て も Ym1+_Ly6Ch i_{単 球 の 割 合 が 増 加 し 、Ly6C}h i_{単 球 の お よ そ 40%が Ym1-Venus 陽 性 だ っ た （ 図}

3e）。 ま た 、 CD115+_Ly6Ch i_{単 球 の 3 つ の サ ブ セ ッ ト の う ち 、 Flt3}-_CD11c-_{サ ブ セ ッ ト で の み}

Ym1-Venus 陽 性 細 胞 が み ら れ た （ 図 3g）。 Ym1-Venus 陽 性 単 球 に お け る Ym1 mRNA の 高 発 現 は 、定 量 的 RT-PCR に よ っ て も 確 認 さ れ た（ 図 3f）。さ ら に 我 々 は 、LPS 投 与 48 時 間 後 の 骨 髄 前 駆 細 胞 に お け る Ym1-Venus 発 現 を 解 析 す る と 、MoP の ご く 一 部（ 6%程 度 ）に も Ym1-Venus 陽 性 細 胞 が み ら れ 、 そ の 割 合 は c-Kit 発 現 が 下 が る に つ れ て 増 加 し た （ 図 3h）。こ の こ と は 、炎 症 時 に お い て Ym1 陽 性 単 球 が 分 化 の 初 期 段 階 か ら 生 じ る こ と を 示 唆 し て い る 。 こ れ ら の 結 果 よ り 、炎 症 の 回 復 期 に お い て Ym1 を 発 現 す る Ly6Ch i_{単 球 サ ブ セ ッ ト が 劇} 的 に 増 加 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。 ３. Ym1+_Ly6Chi_{単 球 の 免 疫 抑 制 機 能} 我 々 は 、全 身 性 炎 症 の 回 復 期 に 増 加 す る Ym1+_Ly6Ch i_{単 球 の 機 能 を 明 ら か に す る た め に 、}

LPS 投 与 48 時 間 後 の Ym1-Venus マ ウ ス 骨 髄 か ら Ym1-Venus 陽 性 と 陰 性 の Ly6Chi_{単 球 を}

分 取 し て 、そ の 性 質 を 比 較 し た 。最 初 に サ イ ト ス ピ ン を し た 細 胞 を ギ ム ザ 染 色 に よ り 形 態 を 比 較 し た と こ ろ 、ど ち ら も 単 球 の 特 徴 で あ る 楕 円 形 の 核 を も ち 、明 ら か な 差 異 は み ら れ な か っ た（ 図 4a）。次 に 、細 胞 表 面 マ ー カ ー の 解 析 を 行 っ た 。そ の 結 果 、Ly6Ch i_{単 球 の マ} ー カ ー で あ る CD62L や CCR2、 CD204 は ど ち ら の 細 胞 集 団 に も 発 現 が み ら れ 、 そ れ ら の 発 現 強 度 に 差 は み ら れ な か っ た（ 図 4b）。そ の 他 に 、Ly6Ch i_{単 球 に 発 現 す る こ と が 知 ら れ} て い る CD11b や F4/80、PD-L1、C5aR、Ly6Cl o_{単 球 に 発 現 す る MHCII、一 部 の マ ク ロ フ ァ} ー ジ に 発 現 す る VCAM-1、 好 中 球 に 発 現 す る Ly6G や CXCR2 も 解 析 し た が 、 ど の マ ー カ ー も 両 者 の 間 に 差 は な か っ た（ 図 4b）。上 述 の よ う に 、末 梢 血 中 を 循 環 す る Ly6Ch i_{単 球 は} Ly6Cl o_{単 球 へ と 分 化 す る こ と が 知 ら れ て い る 。そ こ で 、我 々 は LPS 投 与 48 時 間 後 の}

Ym1-Venus マ ウ ス （ CD45.2） 骨 髄 の Ly6Ch i_{単 球 か ら Ym1-Venus 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 を 分 取 し}

て 、そ れ ぞ れ の 単 球 を CD45.1 コ ン ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス に 移 植 し た 。そ の 後 、経 時 的 に 末 梢 血 の CD45.2 陽 性 細 胞 （ Ym1-Venus マ ウ ス 由 来 ） の Ly6C 発 現 を フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー で 解 析 し 、Ly6Cl o_{単 球 へ の 分 化 能 を 検 討 し た 。そ の 結 果 、Ym1-Venus 陽 性 、陰 性 細 胞 と も に} 移 植 48 時 間 後 に は Ly6C 発 現 レ ベ ル が 低 下 し た こ と か ら 、 ど ち ら の 分 画 も Ly6C 陰 性 単 球 へ の 分 化 能 を 有 す る こ と が 分 か っ た（ 図 4c）。こ れ ら の 結 果 か ら 、Ym1-Venus 陽 性 単 球 と 陰 性 単 球 は 、Ly6Ch i_{単 球 に 特 徴 的 な 表 現 型 を 共 有 し て い る 明 ら か に な っ た 。} Ym1-Venus 陽 性 単 球 の 特 徴 を さ ら に 明 ら か に す る た め に 、 LPS 投 与 48 時 間 後 の マ ウ ス の 骨 髄 か ら 、Ym1-Venus 陽 性 と 陰 性 の Ly6Ch i _{単 球 を 分 取 し 、 そ れ ぞ れ の mRNA 発 現 を}

Ym1-Venus 陽 性 単 球 で 陰 性 単 球 よ り 発 現 が 高 い こ と を 確 認 し た が 、そ の 他 の M2 関 連 遺 伝 子 の 発 現 は 、両 者 の 間 で 差 が み ら れ な か っ た 。一 方 、好 中 球 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 比 較 す る と 、 Ym1-Venus 陽 性 単 球 で matrix metallopeptidase 9（ Mmp9） や lactotransferrin（ Ltf） と い っ た 好 中 球 顆 粒 遺 伝 子 の 一 部 の 発 現 が 高 く 、 そ の 他 の 好 中 球 関 連 遺 伝 子 で あ る lymphocyte antigen 6 family member G5B（ Ly6g5b） や resistin like gamma（ Retnlg） の 発 現 に は 差 が み ら れ な い こ と が 分 か っ た 。RNA-seq に よ り 発 現 に 差 が み ら れ た 遺 伝 子 に 関 し て は 定 量 的 RT-PCR で も 解 析 し 、 同 様 の 結 果 が 得 ら れ た （ 図 4g）。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 Ym1-Venus 陽 性 単 球 は 好 中 球 が 有 す る 特 徴 の 一 部 を 示 す こ と が 明 ら か に な っ た 。 さ ら に 、Ym1-Venus 陽 性 単 球 と 陰 性 単 球 の 機 能 的 な 差 異 を 検 討 す る た め 、LPS を 投 与 し た マ ウ ス の 脾 臓 か ら そ れ ぞ れ の 単 球 を 分 取 し 、ex vivo で 再 度 LPS 刺 激 を し た 。 培 養 上 清 中 の サ イ ト カ イ ン を 比 較 す る と 、 図 5a で 示 す よ う に 、 Ym1-Venus 陽 性 単 球 は 陰 性 単 球 よ り も 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン（IL-6 や TNFa、IL-12）産 生 能 が 低 く、抗 炎 症 性 サイ ト カ イ ン で あ る IL-10 の 産 生 能 が 高 か っ た 。Ym1-Venus 陽 性 単 球 は 炎 症 の 後 期 に 増 加 す る こ と 、そ し て 抗 炎 症 型 の サ イ ト カ イ ン 産 生 能 を 示 す こ と か ら 、 我 々 は 同 単 球 が 炎 症 に 対 し て 抑 制 的 な 機 能 を 持 つ の で は な い か と 仮 説 を 立 て た 。 こ の 仮 説 を 証 明 す る た め に 、 我 々 は LPS 処 置 を し た マ ウ ス の 骨 髄 か ら Ym1-Venus 陽 性 単 球 と 陰 性 単 球 を 分 取 し 、 そ れ ぞ れ の 単 球 を 定 常 状 態 の 野 生 型 マ ウ ス に 移 植 し た 後 、 こ れ ら の マ ウ ス に LPS を 投 与 し た 。 す る と 、 ex

vivo の 結 果 と 相 関 し て 、 Ym1-Venus 陽 性 単 球 を 移 植 す る こ と で LPS 投 与 に よ る IL-6 産 生

Ym1-Venus マ ウ ス に DSS を 5 日 間 飲 水 投 与 し 、そ の 後 普 通 水 に 戻 し て 飼 育 し た 。そ し て 、炎 症 を 誘 導 し た マ ウ ス の 末 梢 血 細 胞 に お け る Ym1-Venus 発 現 を 経 時 的 に 解 析 し た 。 図 6a、 b、 c で 示 さ れ る よ う に 、 炎 症 の 初 期 で あ る Day 3 で は Ym1+_Ly6Chi _{単 球 の 割 合 は 低 い ま ま だ}

っ た 。 と こ ろ が 、DSS 投 与 を 中 止 し て 3 日 後 に あ た る Day 8 で は 、 Ym1+_Ly6Ch i_{単 球 の 割}

合 が 35%ま で 増 加 し 、 そ の 後 の 回 復 期 に お い て そ の 割 合 は 20%以 上 を 維 持 し て い た 。 こ れ ら と 相 関 し て 、脾 臓 と 骨 髄 に お い て も 炎 症 の 回 復 期 に Ym1+_Ly6Ch i_{単 球 の 著 明 な 増 加 が} み ら れ た（ 図 6d、e）。さ ら に 我 々 は 、炎 症 部 位 で あ る 大 腸 の 解 析 を 行 っ た（ 図 6f）。大 腸 お よ び 小 腸 の 粘 膜 固 有 層 に み ら れ る マ ク ロ フ ァ ー ジ は 、Ly6Cl o_CD64h i _{マ ク ロ フ ァ ー ジ と 、} Ly6Chi_CD64lo_{単 球 、 お よ び こ れ ら の 細 胞 の 中 間 体 で あ る Ly6C}in t_CD64in t_{細 胞 の 3 分 画 に 分} 類 さ れ る 。 炎 症 の 回 復 期 の 大 腸 に お い て 、Ym1-Venus 陽 性 細 胞 は Ly6Ch i_CD64lo _{単 球 に み} ら れ 、Ly6Ci nt_CD64in t_{と Ly6C}lo_CD64h i_{分 画 に は ほ と ん ど み ら れ な か っ た 。 大 腸 に 浸 潤 し た} Ly6Chi_CD64lo _{単 球 は Ly6C}l o_CD64hi _{マ ク ロ フ ァ ー ジ に 分 化 す る こ と が 知 ら れ て お り 、 こ の}

結 果 か ら 、Ym1+_Ly6Ch i_{単 球 の Ym1 発 現 は 大 腸 で マ ク ロ フ ァ ー ジ に 分 化 す る 過 程 で 徐 々 に}

Ym1-DTR マ ウ ス に DSS を 5 日 間 自 由 飲 水 に よ り 投 与 し 、 そ の 後 普 通 水 に 戻 し て 飼 育 し た 。 そ し て 、Day 8 お よ び Day 10（ DSS 投 与 中 止 3 お よ び 5 日 後 ）に DT を 投 与 す る こ と で 回 復 期 に 増 加 す る Ym1+_Ly6Ch i_{単 球 を 消 去 し 、同 単 球 の 腸 炎 の 回 復 期 に お け る 機 能 を 解} 析 し た 。す る と 、図 7e で 示 す よ う に 、炎 症 の 回 復 期 に Ym1 陽 性 細 胞 を 消 去 す る こ と で 体 重 の 回 復 が 遅 延 し た 。 組 織 学 的 な 所 見 に お い て も 、Ym1 陽 性 細 胞 の 消 去 に よ り 炎 症 細 胞 浸 潤 の 延 長 と 組 織 修 復 の 遅 延 が 観 察 さ れ た（ 図 7f）。回 復 の 遅 延 が 好 中 球 の 消 失 に よ る こ と で 起 き た 可 能 性 を 否 定 す る た め 、 同 様 の 条 件 で 腸 炎 を 誘 導 し た 野 生 型 マ ウ ス に 対 し 、 Day 8 お よ び Day 10 に 抗 Ly6G 抗 体 ま た は コ ン ト ロ ー ル 抗 体 を 投 与 し た 。そ の 結 果 、両 者 の 体 重 変 化 に 差 は み ら れ ず 、 こ の こ と か ら 好 中 球 の 消 去 は 腸 炎 の 回 復 に 影 響 し な い こ と が 分 か っ た （ 図 7g）。 こ れ ら の 結 果 よ り 、Ym1+_Ly6Ch i _{単 球 は 炎 症 の 局 所 に も み ら れ 、 炎 症 の 回 復 お よ び 組 織} 修 復 に 関 与 す る こ と が 示 さ れ た 。 ５. Ym1+_Ly6Chi_{単 球 は 単 球 前 駆 細 胞 か ら 分 化 す る} 定 常 時 に お い て 、好 中 球 は 好 中 球 前 駆 細 胞（GP）、単 球 は 単 球 前 駆 細 胞（ MoP）か ら 分 化 す る こ と が 知 ら れ て い る が 2 6_{、 炎 症 時 に お け る GP あ る い は MoP の 分 化 能 は 明 ら か に} な っ て い な い 。そ こ で 我 々 は 、LPS 投 与 に よ り 炎 症 を 誘 導 し た マ ウ ス に GP あ る い は MoP を 移 植 す る こ と で 、Ym1+_Ly6Chi _{単 球 の 前 駆 細 胞 を 明 ら か に し よ う と 考 え た 。 初 め に 、 野} 生 型 マ ウ ス（CD45.2）か ら 分 取 し た GP あ る い は MoP を 定 常 状 態 の CD45.1 コ ン ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス に 移 植 し た と こ ろ 、そ れ ぞ れ Ly6G+_CD115-_{の 好 中 球 、Ly6G}-_CD115+_{の 単 球 に 分 化} す る こ と を 確 認 し た（ 図 8a）。次 に 我 々 は 、Ym1-Venus マ ウ ス（ CD45.2）か ら 分 取 し た GP あ る い は MoP を 、 LPS を 投 与 し た CD45.1 コ ン ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス に 移 植 し 、 そ の 48 時 間 後 の 末 梢 血 細 胞 を 解 析 し た 。そ の 結 果 、図 8b に 示 す よ う に 、GP を 移 植 す る と 、そ の 85.4% が Ly6G 陽 性 の 好 中 球 に 分 化 し 、 CD115 陽 性 の 単 球 は ほ と ん ど み ら れ な か っ た 。 一 方 で MoP を 移 植 す る と 、 好 中 球 に は 分 化 せ ず 、 そ の 85.9%が CD115 陽 性 の 単 球 に 分 化 し た 。 さ ら に 、CD115 陽 性 単 球 の 55.6%が Ly6Ch i_{単 球 に な り 、 そ の う ち の 44.5% が Ym1-Venus} を 発 現 し た 。 ま た 、Ly6Cl o_{単 球 に Ym1-Venus 発 現 は ほ と ん ど み ら れ な か っ た 。 こ の こ と}

か ら 、Ym1+_Ly6Ch i_{単 球 は GP で は な く MoP か ら 分 化 す る こ と が 明 ら か に な っ た 。 さ ら に}

我 々 は 、Ym1-Venus 陰 性 単 球 が Ym1-Venus 陽 性 単 球 に そ の 表 現 型 を 変 化 す る 可 能 性 を 検 討 し た 。 そ の た め に 、 定 常 状 態 の Ym1-Venus マ ウ ス の 骨 髄 か ら Ly6Chi_{単 球 を 分 取 し 、 事}

前 に LPS 投 与 し た CD45.1 コ ン ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス に 移 植 し た 。そ の 結 果 、移 植 し た Ly6Chi

単 球 の Ym1-Venus 発 現 は 変 化 せ ず 、 こ の こ と か ら Ym1-Venus 陰 性 単 球 か ら 陽 性 単 球 に は そ の 表 現 型 が 変 化 し な い こ と が 示 さ れ た （ 図 8c）。

MoP か ら Ym1+_Ly6Ch i_{単 球 へ の 分 化 に 必 要 な 刺 激 を 明 ら か に す る た め 、Ym1-Venus マ ウ}

（ 図 8d）。 M-CSF 存 在 下 で は 、 MoP は 主 に Ly6Cl o_{あ る い は Ly6C}h i_{の F4/80}+_{骨 髄 系 細 胞 に}

分 化 す る が 、 こ れ ら の 細 胞 は Ym1-Venus を 発 現 し な か っ た 。 一 方 、 GM-CSF 存 在 下 で 培 養 す る と 、Ly6Clo _{あ る い は Ly6C}h i_{の F4/80}+_{細 胞 の み な ら ず Ly6C}h i_F4/80-_{細 胞 に も 分 化 し 、}

そ れ ら の 細 胞 に Ym1-Venus 発 現 が み ら れ た 。GM-CSF と M-CSF 共 存 下 で は 、よ り 多 く の 細 胞 が Ly6Chi_F4/80-_{細 胞 に 分 化 し 、 そ れ ら の 細 胞 に は Ym1-Venus 発 現 が み ら れ た 。 さ ら}

図 1. 末 梢 血 お よ び 種 々 の 組 織 に お け る Ym1発 現 細 胞 の 同 定

（a）Ym1-Venus タ ー ゲ テ ィ ン グ コ ン ス ト ラ ク ト の 概 略 図 を 示 す 。Ym1（ Chi3l3）遺 伝 子 の エ キ ソ ン は 黒 塗 り の 四 角 形 で 示 す 。改 良 型 Venus の cDNA（ Venus）、ネ オ マ イ シ ン 耐 性 遺 伝 子（neo）、お よ び HSV-チ ミ ジ ン キ ナ ー ゼ（ TK）遺 伝 子 は 、白 抜 き の 四 角 形 で 示 す 。遺 伝 子 型 判 定 （Genotyping） の た め の PCR に 使 用 し た プ ラ イ マ ー は 、 プ ラ イ マ ー 名 （ a、 b お よ び c） と と も に 矢 印 で 示 し 、 予 想 さ れ る PCR 産 物 は 両 矢 印 で 示 す 。 （b）図 に 示 さ れ た プ ラ イ マ ー セ ッ ト を 用 い て Ym1-Venus（ +/Ym1Ve n u s_{）マ ウ ス お よ び 野 生} 型 （+/+） マ ウ ス の genotyping PCR を 行 っ た （ 野 生 型 配 列 の 検 出 に は a と b、 標 的 配 列 の 検 出 に は a と c の プ ラ イ マ ー セ ッ ト を 用 い た 。）。 （c-d） Ym1-Venus マ ウ ス お よ び 野 生 型 マ ウ ス の 各 臓 器 よ り 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ お よ び 樹 状 細 胞 を 調 製 し た 。 各 細 胞 集 団 に お け る Ym1-Venus 発 現 を フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー に よ り 解 析 し た 。 各 臓 器 常 在 マ ク ロ フ ァ ー ジ と 樹 状 細 胞 （c）、 お よ び 末 梢 血 （ d） の 白 血 球 の フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 解 析 結 果 を 示 す 。Mφ, マ ク ロ フ ァ ー ジ ; LPM, large peritoneal macrophages; SPM, small peritoneal macrophages; DC, 樹 状 細 胞

図 2（ 続 き ） Ly6 C CD115 Flt3 CD11c R1 93.2 R2 3.43 R2 CD11c-_Flt3+ R1 D11c-_Flt3 -Venus R3 1.40 R3 CD11c+_Flt3+ 4.06 0 0.36 13.7 SSC Lin + 7-AAD 54.7 CD16/32 CD34 R2 42.4 R1 14.7 R3 31.6 Venus R1 (CMP) CD16/32-_CD34+ 0 0.57 0.03 c-Ki t Sca-1 c-Ki t Lin + 7-AAD 15.8 8.09 R2 (GMP) CD16/32+_CD34+ _CD16/32R3 (MEP) -_CD34 -c-Ki t CD115 c-Ki t Flt3 Ly6 C Venus 34.5 _4.55R2 _0.79R1 R4 80.4 85.5 13.9 0.68 0 12.1 86.2 0.06 1.64 40.2 57.7 0.30 1.77 13.1 83.2 0.06 3.57 R3 6.19 AAD- _in -R1 (MDP)

c-Kit+_Flt3+ R2 (MoP) _c-Kit+_Flt3- R3 ( _c-Kitint_Flt3- ) R4 (_c-Kit-_Flt3- )

図 2. 骨 髄 細 胞 に お け る Ym1発 現 解 析

（a）骨 髄 細 胞 に お け る Ym1-Venus 発 現 解 析 の 結 果 を 示 す 。Ym1-Venus マ ウ ス の 骨 髄 細 胞 を CD115、 Ly6C、 Ly6G（ 上 ）、 CD19、 CD3、 NK1.1（ 中 ）、 CD115、 F4/80、 Gr-1（ 下 ） 抗 体 で 染 色 し 、 各 細 胞 集 団 に お け る Ym1-Venus 発 現 を フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー に よ り 解 析 し た 。Mφ, マ ク ロ フ ァ ー ジ

（b, c） 好 中 球 の 各 分 化 段 階 に お け る Ym1-Venus 発 現 （ b） お よ び 各 種 遺 伝 子 の mRNA 発 現 を 示 す （c）。

（b）骨 髄 細 胞 を Lin（ B220、CD11b、CD3e、Gr-1、NK1.1 お よ び Ter119）、c-Kit、Sca-1、 CD16/32 お よ び CD34 抗 体 で 染 色 し た 。 好 中 球 の 分 化 段 階 を c-Kit と Ly6G の 発 現 レ ベ ル で 5 つ の 細 胞 集 団 に 分 類 し 、 そ れ ぞ れ の Ym1-Venus 発 現 を 解 析 し た 。（ c）（ b） で 示 し た 1-5 の 細 胞 集 団 の 好 中 球 一 次 顆 粒 遺 伝 子（ Mpo、Ctsg）、二 次 顆 粒 遺 伝 子（ Lyz、Ltf）、三 次 顆 粒 遺 伝 子 （Mmp9）お よ び Ym1 遺 伝 子 発 現 を 定 量 的 RT-PCR 法 に よ り 解 析 し 、 細 胞 集 団

#1 を 基 準 と し た 遺 伝 子 発 現 比 を 示 す 。 エ ラ ー バ ー は SD。 n=3

（d） Ly6C 陽 性 単 球 の 3 つ の サ ブ セ ッ ト の Ym1-Venus 発 現 解 析 結 果 を 示 す 。 Lin（ B220、 CD19、 CD3、 Ly6G、 MHCII、 NK1.1 お よ び Ter119）。

（e） 骨 髄 系 前 駆 細 胞 の Ym1-Venus 発 現 解 析 結 果 を 示 す 。 Lin（ B220、 CD11b、 CD3、 Gr-1、 NK1.1 お よ び Ter119）。 CMP, common myeloid progenitor; GMP, granulocyte/macrophage progenitor; MEP, megakaryocyte-erythroid progenitor

（f）単 球 前 駆 細 胞 の Ym1-Venus 発 現 解 析 結 果 を 示 す 。Lin（ B220、CD3、Ly6G、NK1.1 お よ び Ter119）。 MDP, macrophage/dendritic cell progenitor; MoP, monocyte progenitor

図 3 naive Ly6Chi _(R1) CD115+_Ly6Chi 24 h 48 h 72h Ly6Clo (R2) CD115+_Ly6Clo (R3) Ly6G+ Venus CD115 Ly6G L y6 C 1.21 5.00 57.2 R3 21.4 R1 1.10 R2 2.45 0.36 10.4 50.8 79.4 1.53 0.76 2.04 47.3 60.8 33.8 5.86 6.69 5.18 24.1 67.0 25.4 3.48 6.10 0 20 40 60 0 24 48 72 96 ( ) Ym 1-V en u s (% ) n.s. **** **** ** Venus Ly6 C CD115 Ly6 C Ly6G 8 .0 54.4 R1 1.33 R2 7.96 R2 ( ) Ly6G+ R1 (Ly6Chi ) CD115+_Ly6Chi Venus Ly6 C CD115 Ly6 C Ly6G 89.8 37.0 R1 10.9 R2 30.0 R2 ( ) Ly6G+ R1 (Ly6Chi ₎ CD115+_Ly6Chi Ly6 C CD115 Flt3 CD11c R1 83.4 R2 8.67 R2 CD11c-_Flt3+ R1 D11c-_Flt3 -Venus R3 3.15 R3 CD11c+_Flt3+ 26.6 0.28 1.04 17.7 SSC Lin + 7-AAD 68.7 Venu s (+) Venu s (-) Ly6C (naï ve) Ym1 0 2 4 6 8 mRNA ( ) n.s. * c-Ki t c-Ki t Ly6 C 22.6 _5.00R2 _3.10R1 R4 65.5 74.7 24.5 0.11 0.68 22.8 70.9 0.35 5.96 5.68 78.0 0.19 16.2 0.49 79.5 0.06 19.9 R3 9.38 AAD- _in -R1 (MDP)

c-Kit+_Flt3+ R2 (MoP) _c-Kit+_Flt3- R3 ( _c-Kitint_Flt3- ) R4 (_c-Kit-_Flt3- )

図 3. 敗 血 症 の 回 復 期 に お け る Ym1+_Ly6Ch i_{単 球 の 増 加}

（a）野 生 型 マ ウ ス に LPS（ 50 µg/マ ウ ス ）を 尾静 脈 投 与 し た 後 、血 清 中 の サ イト カ イ ン 濃 度 を ELISA 法 に よ り 測 定 し た 。エ ラ ー バ ー は SD。naïve に 対 す る one-way ANOVA 検 定 を 行 っ た 。***P<0.001, ****P<0.0001, n.s., not significant, n=3

（b-h） Ym1-Venus マ ウ ス に LPS（ 100 µg/マ ウス ） を 尾 静 脈 投 与 した 。

（b, c） 末 梢 血 細 胞 に お け る Ym-1-Venus の 発 現 を LPS 投 与 前 か ら 投 与 後 （ 24、 48、 72 時 間 後 ） に か け て 経 時 的 に 解 析 し た 。（b） Ly6C 陽 性 単 球 、 Ly6C 陰 性 単 球 お よ び 好 中 球 の Ym1-Venus 発 現 を 示 す 。（ c）Ly6C 陽 性 単 球 に お け る Ym1-Venus 陽 性 率 の 経 時 的 変 化 を 示 す 。 エ ラ ー バ ー は SD 。 naïve に 対 す る one-way ANOVA 検 定 を 行 っ た 。 **P<0.01, ****P<0.0001, n.s., not significant, n=3

（d, e） LPS 投 与 48 時 間 後 の 脾 臓 （ d） お よ び 骨 髄 （ e） の Ym1-Venus 発 現 を 示 す 。 （f） 定 常 状 態 （ naïve） お よ び LPS 投 与 48 時 間 後 の Ym1-Venus マ ウ ス の 骨 髄 か ら Ly6C 陽 性 単 球 の Ym1-Venus 陽 性 分 画（ Venus (+)）と 陰 性 分 画（ Venus (-)）を セ ル ソ ー タ ー に よ り 分 取 し 、 そ れ ぞ れ の Ym1 mRNA 発 現 を 定 量 的 RT-PCR 法 に よ り 解 析 し た 。 エ ラ ー バ ー は SD。 naïve に 対 す る one-way ANOVA 検 定 を 行 っ た 。 *P<0.05, n.s., not significant, n=3 （g）骨 髄 に お け る Ly6C 陽 性 単 球 の 3 つ の サ ブ セ ッ ト の Ym1-Venus 発 現 を 示 す 。Lin（ B220、 CD19、 CD3、 Ly6G、 MHCII、 NK1.1 お よ び Ter119）。

図 4 Venus (+) Venus (-)

a

b

c

CD11b CD62L F4/80 CCR2 PD-L1 C5aR MHCII VCAM-1 Ly6G CXCR2

図 4. 敗 血 症 の 回 復 期 に 出 現 す る Ym1+_Ly6Ch i _{単 球 の 表 現 型 お よ び 遺 伝 子 発 現 解 析} Ym1-Venus マ ウ ス に LPS（ 100 µg/マ ウス ） を 尾静 脈 投 与 し 、 48 時 間後 の 骨 髄 細 胞お よ び 末 梢 血 細 胞 を 解 析 し た 。

（a） 骨 髄 か ら Ym1-Venus 陽 性 （ Venus (+)） お よ び 陰 性 単 球 （ Venus (-)） を セ ル ソ ー タ ー に よ り 分 取 し 、 サ イ ト ス ピ ン に よ り 細 胞 を 回 収 し た 後 、 ギ ム ザ 染 色 に よ り 形 態 を 観 察 し た 。 ス ケ ー ル バ ー 、10 µm。 対 物 レ ンズ 、 100 倍 。

（b）末 梢 血 細 胞 を 各 種 表 面 マ ー カ ー で 染 色 し 、そ れ ぞ れ の 発 現 を Ym1-Venus 陽 性（ Venus (+)）と 陰 性 単 球（ Venus (-)）で 比 較 し た 。灰 色 の ヒ ス ト グ ラ ム は 各 抗 体 、白 抜 き の ヒ ス ト グ ラ ム は ア イ ソ タ イ プ コ ン ト ロ ー ル 抗 体 に よ る 染 色 強 度 を 示 す 。

（c） 骨 髄 か ら Ym1-Venus 陽 性 （ Venus (+)） お よ び 陰 性 単 球 （ Venus (-)）（ と も に CD45.2 陽 性 、4x105 _{cells）を セ ル ソ ー タ ー に よ り 分 取 し 、直 前 に LPS（ 10 µg/マ ウ ス ）を投 与 し た}

CD45.1 コ ン ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス に 移 植 し た 。移 植 48 時 間 後 の 末 梢 血 細 胞 を CD45.2、CD115 お よ び Ly6C で 染 色 し 、 移 植 し た 単 球 に お け る Ly6C 発 現 を 解 析 し た 。 Pre は 移 植 前 の そ れ ぞ れ の 単 球 に お け る Ly6C 発 現 を 示 す 。Ym1-Venus 陽 性 単 球 は 赤 色 、Ym1-Venus 陰 性 単 球 は 青 色 で 示 す 。

（d-g） 定 常 状 態 の Ym1-Venus マ ウ ス の 骨 髄 か ら 好 中 球 お よ び Ly6C 陽 性 単 球 、 LPS 投 与 を 投 与 し た Ym1-Venus マ ウ ス 骨 髄 か ら 好 中 球 、 Ym1-Venus 陽 性 （ Venus (+)） お よ び 陰 性 単 球 （Venus (-)） を セ ル ソ ー タ ー に よ り 分 取 し 、 そ れ ぞ れ の 遺 伝 子 発 現 を 比 較 し た 。 （d-f） RNA シ ー ケ ン ス に よ る 網 羅 的 な 発 現 解 析 結 果 。（ d） Venus (+)と Venus (-)を 比 較 し て 、 ２ 倍 以 上 差 が 見 ら れ た 遺 伝 子 を 散 布 図 で 示 す 。（e） 主 成 分 （ PCA） 解 析 の 解 析 結 果 を 示 す 。（f） 単 球 /マ ク ロ フ ァ ー ジ お よ び 、 好 中 球 、 M1 マ ー カ ー 、 M2 マ ー カ ー に お け る 代 表 的 な 遺 伝 子 の 発 現 を ヒ ー ト マ ッ プ で 示 す 。

図 5 * Venu s (+) Venu s (-) IL-6 0 10 20 30 ng / ml **** Venu s (+) Venu s (-) IL-12 0 50 100 150 pg / ml ** Venu s (+) Venu s (-) TNFα 0 3 4 5 ng / ml 1 2 * Venu s (+) Venu s (-) IL-10 0 100 150 200 pg / ml 50 **** Venu s (+) Venu s (-) Ym1 0 5 10 15 ng / ml * Venu s (+) Venu s (-) IL-6 0 10 20 30 ng / ml n.s. Venu s (+) Venu s (-) TNFα 0 0.4 0.6 0.8 ng / ml 0.2 72 h FACS CD3/28 (Venus(+) or Venus(-)) + (Control) or EMA Foxp3

Venus (+) Venus (-) Control Control (Iso)

図 5. Ym1+_Ly6Ch i _{単 球 は 免 疫 抑 制 性 の 表 現 型 を 示 す}

LPS 投 与（ 100 µg/マ ウ ス ）48 時 間後 の Ym1-Venus マ ウ ス の 脾 臓（ a）ま た は 骨髄（ b、c） か ら Ym1-Venus 陽 性（ Venus (+)）お よ び 陰 性 単 球（ Venus (-)）を セ ル ソ ー タ ー に よ り 分 取 し 、 そ れ ぞ れ の 機 能 を 比 較 し た 。 （a）脾 臓 か ら 分 取 し た そ れ ぞ れ の 単 球 を LPS（ 1 µg/ml）で 24 時 間 刺 激 し 、上 清中 の サ イ ト カ イ ン 濃 度 を ELISA 法 に よ り 解 析 し た 。 エ ラ ー バ ー は SD。 Unpaired-T 検 定 を 行 っ た 。 *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001, n.s., not significant, n=3 （b） そ れ ぞ れ の 単 球 （ 4x105 _{cells） を 、 直 前 に LPS（ 10 µg/マ ウ ス） を 投 与 した 野 生 型 マ} ウ ス に 移 植 し 、 そ の 4 時 間 後 に 血 清 を 回 収 し た 。 血 清 中 の サ イ ト カ イ ン 濃 度 を ELISA 法 に よ り 解 析 し た 。

エ ラ ー バ ー は SD。 Paired-T 検 定 を 行 っ た 。 *P<0.05, n.s., not significant, n=4

図 6

naive Day 3 Day 6 Day 8 Day 10 Day 12

-図 6. DSS 誘 導 腸 炎 の回 復 期 に Ym1+_Ly6Ch i_{単 球 が 増 加 す る}

Ym1-Venus マ ウ ス に 2％ DSS 水 溶 液 を 5 日 間 自 由 飲 水 に よ り 投 与 し 、 Ym1-Venus 陽 性 細 胞 を 解 析 し た 。

（ a-c）末 梢 血 細 胞 に お け る Ym-1-Venus の 発 現 を 経 時 的 に 解 析 し た 。（ a） Ly6C 陽 性 単

球 、Ly6C 陰 性 単 球 お よ び 好 中 球 の Ym1-Venus 発 現 を 示 す 。 Ly6C 陽 性 単 球 に お け る Ym1-Venus 陽 性 率 （ b） お よ び 細 胞 数 （ c） の 経 時 的 変 化 を 示 す 。 エ ラ ー バ ー は SD。 naïve（ Day 0） に 対 す る one-way ANOVA 検 定 を 行 っ た 。 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, n.s., not significant, n=3 （d-f）DSS 飲 水 開 始 9 日 後（ DSS 飲 水 中 止 ４ 日 後 ）の 脾 臓（ d）、骨 髄（ e）お よ び 大 腸（ f） の 各 細 胞 集 団 に お け る Ym1-Venus 発 現 を 示 す 。 フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 解 析 結 果 に お い て 、 赤 色 の ヒ ス ト グ ラ ム は Ym1-Venus マ ウ ス 、 青 色 の ヒ ス ト グ ラ ム は 野 生 型 マ ウ ス を 示 す 。 ゲ ー ト と と も に 示 さ れ た 数 字 は 全 体 に 対 す る 細 胞 集 団 の 割 合 お よ び フ ラ ク シ ョ ン 番 号 、 ヒ ス ト グ ラ ム の 数 字 は Ym1-Venus マ ウ ス に お け る Ym-1-Venus 陽 性 細 胞 の 割 合 を 示 す 。 （g）DSS 飲 水 開 始 9 日 後（ DSS 飲 水 中 止 ４ 日 後 ）に 、大 腸 に 浸 潤 し た 単 球（ Ly6Ch i_MHCII-_）

の Ym1-Venus 陽 性 分 画 （ Venus (+)） と 陰 性 分 画 （ Venus (-)） を セ ル ソ ー タ ー に よ り 分 取 し 、そ れ ぞ れ の 遺 伝 子 発 現 を 定 量 的 RT-PCR 法 に よ り 解 析 し た 。エ ラ ー バ ー は SD。 Paired-T 検 定 を 行 っ た 。 *P<0.05, **P<0.01, n.s., not significant, n=6-7

図 7. Ym1+_Ly6Ch i_{単 球 の 消 失 に よ り 腸 炎 の 回 復 が 遅 延 す る}

（a）Ym1-DTR タ ー ゲ テ ィ ン グ コ ン ス ト ラ ク ト の 概 略 図 を 示 す 。Ym1（ Chi3l3）遺 伝 子 の エ キ ソ ン は 黒 塗 り の 四 角 形 で 示 す 。ヒ ト ジ フ テ リ ア 毒 素 受 容 体 の cDNA（ hDTR）、ネ オ マ イ シ ン 耐 性 遺 伝 子（neo）、お よ び HSV-チ ミ ジ ン キ ナ ー ゼ（ TK）遺 伝 子 は 、白 抜 き の 四 角 形 で 示 す 。Genotyping PCR に 使 用 し た プ ラ イ マ ー は 、プ ラ イ マ ー 名（ a、b お よ び c）と と も に 矢 印 で 示 し 、 予 想 さ れ る PCR 産 物 は 両 矢 印 で 示 す 。 （b） 図 に 示 さ れ た プ ラ イ マ ー セ ッ ト を 用 い て Ym1-DTR（ +/Ym1D T R_{） マ ウ ス お よ び 野 生} 型 （+/+） マ ウ ス の genocyping PCR を 行 っ た （ 野 生 型 配 列 の 検 出 に は a と b、 標 的 配 列 の 検 出 に は a と c の プ ラ イ マ ー セ ッ ト を 用 い た 。）。 （c） Ym1-DTR マ ウ ス に ジ フ テ リ ア 毒 素 （ DT, 25 µg/kg/マ ウ ス ） を 腹腔 内 投 与 し 、 その 24 お よ び 72 時 間 後 の 骨 髄 細 胞 に お け る 好 中 球 、 未 熟 好 中 球 お よ び 単 球 の 割 合 を 解 析 し た 。 （d） Ym1-DTR マ ウ ス に LPS（ 100 µg/マ ウス ）を 尾 静 脈 投 与 し 、 その 24 時 間 後に DT （25 µg/kg/マウ ス ） を 腹 腔内 投 与 し た 。さ らに そ の 24 時 間 後 の末 梢 血 細 胞 に おけ る 好 中 球 、Ly6C 陽 性 単 球 お よ び Ly6C 陰 性 単 球 の 割 合 を 解 析 し た 。 フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 解 析 結 果 に お い て 、 ゲ ー ト と と も に 示 さ れ た 数 字 は 全 体 に 対 す る 細 胞 の 割 合 を 示 す 。 （ e, f） 野 生 型 マ ウ ス お よ び Ym1-DTR マ ウ ス に 2％ DSS 水 溶 液 を 5 日 間 自 由 飲 水 に よ り 投 与 し 、 そ の 体 重 変 化 を 示 す 。 DSS 飲 水 開 始 8、 10 日 後 に DT（25 µg/kg/マ ウ ス ）を 腹 腔

内 投 与 し た 。エ ラ ー バ ー は SEM。 two-way ANOVA 検 定 を 行 い 、 2 群 間 比 較 し た 。

図 8（ 続 き ） 72 h FACS MP (Ym1-Venus, 3000 cells) + M-C SF GM-C SF M-C SF + M-C SF _IL-3 IL-3 + M-C SF G-C SF 0 30000 20000 40000 10000 ( ) 16.3 30.0 F4/80 Ly6C Venus 5.52 0.51 40.9 38.3 32.3 44.6 0.47 4.24 20.5 19.8 2.78 34.2 0.79 0 12.7 59.1 6.44 82.6 3.28 0.10 11.9 9.56 R1 0.76 R3 86.7 0.52 0.02 1.92 R2 11.2 R1

Ly6Chi_F4/80- _Ly6CR2 hi_F4/80+ _Ly6CR3 lo_F4/80+

図 8. Ym1+_Ly6Ch i_{単 球 は 単 球 前 駆 細 胞 よ り 分 化 す る}

（a, b） 好 中 球 前 駆 細 胞 （ GP: Lin-_c-Kit+_CD16/32+_Ly6C+_CD115-_、2x104 _{cells） お よ び 単 球 前}

駆 細 胞（MoP: Lin-_c-Kit+_CD16/32+_Ly6C+_CD115+_、1x105 _{cells）を 野 生 型 あ る い は Ym1-Venus}

マ ウ ス（ と も に CD45.2）か ら セ ル ソ ー タ ー に よ り 分 取 し 、CD45.1 コ ン ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス に 移 植 し た 。Lin（ CD4、CD8、B220、NK1.1、Ter119、Sca-1、CD11b、Gr-1 お よ び 7/4）。 （a） 野 生 型 マ ウ ス の GP あ る い は MoP を CD45.1 コ ン ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス に 移 植 し た 。 移 植 48 時 間 後 の 末 梢 血 細 胞 を CD45.1、CD45.2、CD115 お よ び Ly6C で 染 色 し 、移 植 し た 前 駆 細 胞 の 分 化 能 を 解 析 し た 。 （b） CD45.1 コ ン ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス に LPS（ 10 µg/マ ウ ス ） を 尾 静脈 投 与 し 、 その 6 時 間 後 に Ym1-Venus マ ウ ス の GP（ 4x104 _{cells） あ る い は MoP（ 1.7x10}5 _{cells）を 移 植 し た 。 移}

植 48 時 間 後 の 末 梢 血 細 胞 を CD45.1、CD45.2、CD115 お よ び Ly6C で 染 色 し 、移 植 し た 前 駆 細 胞 の Ym1-Venus 発 現 を 解 析 し た 。

（c） CD45.1 コ ン ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス に LPS（ 10 µg/マ ウ ス ） を 尾 静脈 投 与 し 、 その 6 時 間 後 に 定 常 状 態 の Ym1-Venus マ ウ ス の 骨 髄 か ら 分 取 し た Ly6C 陽 性 単 球 （ 5x105 _{cells） を 移}

植 し た 。移 植 14、24、48 時 間 後 の 末 梢 血 細 胞 を CD45.1、CD45.2、CD115 お よ び Ly6C で 染 色 し 、 移 植 し た Ly6C 陽 性 単 球 の Ym1-Venus 発 現 を 解 析 し た 。

第 ４ 章 考 察

一 般 に 、 組 織 傷 害 部 位 に 動 員 さ れ た Ly6Chi _{単 球 は 炎 症 促 進 性 の 表 現 型 を 示 し 、 炎 症 の} 増 悪 に 寄 与 す る と 考 え ら れ て い る 。例 え ば 、炎 症 性 腸 疾 患 モ デ ル に お い て 、ケ モ カ イ ン レ セ プ タ ー の 一 つ で あ る CCR2 を 阻 害 す る と 、炎 症 部 位 へ の Ly6Chi_{単 球 の 浸 潤 が 抑 制 さ れ 、} 腸 炎 が 改 善 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 25_{。腎 臓 傷 害 モ デ ル で は 、CCR2 欠 損 マ ウ ス に お い} て 、組 織 傷 害 お よ び 線 維 化 が 抑 制 さ れ る こ と が 報 告 さ れ て い る 2 7_{。こ れ ら の 知 見 は 、組 織} 傷 害 の 初 期 に 局 所 に 浸 潤 す る Ly6Ch i _{単 球 が 炎 症 誘 発 性 の 機 能 を も つ こ と を 明 確 に 示 し て} い る 。一 方 で 近 年 、単 球 が 炎 症 の 収 束 や 組 織 修 復 に も 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る こ と が 報 告 さ れ て い る 。Lucas ら は 、皮 膚 損 傷 モ デ ル に お い て 、マ ク ロ フ ァ ー ジ お よ び 単 球 を 炎 症 初 期 で の み 消 去 す る と 、炎 症 が 軽 減 し 瘢 痕 形 成 が 抑 制 さ れ る 一 方 で 、回 復 期 限 定 的 に マ ク ロ フ ァ ー ジ お よ び 単 球 を 消 去 す る と 、創 傷 組 織 に 重 度 の 出 血 が 起 こ り 、再 生 の 停 滞 が 生 じ る こ と を 示 し た 28_{。ま た 、Grainger ら は 、Toxoplasma gondii 感 染 に よ り 大 腸 に 浸 潤 し た Ly6c}h i

動 員 も 誘 導 す る 3 2 , 33_{。Petit ら は 、G-CSF が 骨 髄 に お け る stromal cell–derived factor 1}

(SDF-1) 産 生 を 減 少 し 、 CXCR4 発 現 を 増 加 す る こ と で 、 末 梢 血 中 へ の HSC 動 員 を 誘 導 す る こ と を 示 し た 34_{。ま た 、定 常 時 の 好 中 球 産 生 は C/EBPα に よ り 制 御 さ れ る が 、C. albicans 感}

染 モ デ ル で の 好 中 球 産 生 の 増 加 は C/EBPβ が 制 御 す る こ と が 示 さ れ て い る 3 5。 一 方 で 、L. monocytogenes 感 染 モ デ ル で は 、 骨 髄 で の 単 球 産 生 の 増 加 が 誘 発 さ れ る こ と が 知 ら れ て い

る 3 6_{。Serbina ら は 、こ の 感 染 モ デ ル に お い て myeloid differentiation primary response protein}

88 （ MyD88 ） 欠 損 マ ウ ス で は 、 骨 髄 で の 単 球 産 生 が 減 少 す る こ と を 明 ら か に し 、 L. monocytogenes 感 染 時 の 骨 髄 に お け る 単 球 の 増 加 に は TLR シ グ ナ ル が 重 要 で あ る こ と を 示 し た 3 7_{。こ れ ら の 知 見 は 、炎 症 時 に 局 所 で 産 生 さ れ た サ イ ト カ イ ン や 微 生 物 由 来 因 子 が} 骨 髄 に 作 用 し 、血 球 分 化 や 炎 症 部 位 へ の 細 胞 動 員 に 影 響 を 与 え る こ と を 示 し て い る 。本 研 究 で 我 々 は 、 炎 症 の 急 性 期 で は な く 、 回 復 期 に な っ て か ら Ym1 陽 性 単 球 の 増 加 が み ら れ る こ と を 明 ら か に し た 。 こ の こ と は 、 敗 血 症 誘 導 モ デ ル お よ び DSS 腸 炎 モ デ ル の 回 復 期 に 局 所 で 生 じ た 何 ら か の 因 子 が 、 骨 髄 で の Ym1 陽 性 単 球 へ の 分 化 を 誘 導 し て い る 可 能 性 を 示 唆 し て い る 。本 研 究 の in vitro で の 単 球 前 駆 細 胞 実 験 か ら 、IL-3 あ る い は GM-CSF 添

明 ら か に す る こ と が 重 要 で あ る 。 本 研 究 で 我 々 が 同 定 し た Ym1 陽 性 単 球 と 類 似 の 形 質 を 有 す る 細 胞 と し て 、 骨 髄 由 来 免 疫 抑 制 細 胞 （MDSCs） が 知 ら れ て い る 41_{。 マ ウ ス の MDSCs は CD11b}+_Gr-1+_{細 胞 と し て 定} 義 さ れ 、 さ ら に CD11b+_Ly6Cl o_Ly6G+_{の 好 中 球 様 の 表 現 型 を 示 す G-MDSCs と 、} CD11b+_Ly6Ch i_Ly6G–_{の 単 球 様 の 表 現 型 を 示 す M-MDSCs の 二 つ に 大 別 さ れ る 。G-MDSCs は} ROS、M-MDSCs は NO を 産 生 し 、T 細 胞 の 増 殖 を 抑 制 す る こ と で 免 疫 抑 制 作 用 を 示 す 4 2_。 MDSCs は 担 癌 マ ウ ス や 感 染 モ デ ル マ ウ ス で み ら れ 、 免 疫 細 胞 に よ る 癌 細 胞 へ の 攻 撃 を 抑 制 す る こ と で 癌 細 胞 の 増 殖 を 助 け る と 考 え ら れ て き た 。そ の た め 、こ れ ま で MDSCs は 癌 の 治 療 タ ー ゲ ッ ト と し て 注 目 さ れ て き た が 、 マ ー カ ー が 乏 し い こ と か ら そ の 研 究 は 難 航 し て い た 。 本 研 究 よ り 、CD11b+_Ly6Ch i_Ly6G–_{サ ブ セ ッ ト の 中 で も CD115}+_{Ym1 陽 性 細 胞 が}

参 考 文 献

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