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(2) 舟崎真理子・吉川 健太・廣田 洋・龔 洵・黒田 智明・大崎 愛弓. 1 Eremophilane sesquiterpenoids of Ligularia species. Figure Figure 1 Eremophilane sesquiterpenoids of Ligularia species.. の多様性機構解明の一助となるべく，中国雲南省香格里. furanoeremophil-1(10)-en-9-one (5)12），6β-isobutyryloxy-. 拉県天池で採集された L. cyathiceps の根の化学成分の単 O 離・構造解析を行い，考察を加えた。 O 9 OR O O 1 また，キク科 LigulariaO属植物にはさまざまな生物活 2 12 10 8 8-10） O 性が報告されている。 今回は，抽出物および単離化 5. 1β,10β-epoxyfuranoeremophilane (6)5），6β-angeloyloxyO furanoeremophilan-10β-ol (7)13），6β-isobutyroyloxyfurano O O eremophilan-10β-olO(8)14），cacalol (9)15），14-ethoxycacalol. 合物の α- グルコシダーゼ阻害作用を評価した。α- グルコ 14 O O 13 OR シダーゼは糖質消化酵素であり，それを阻害することに 15. (Fig. 2)。. 3. 4. 6. 7. (10)16），cacalone (11)17），epicacalone (12)17） を単離した. 11. O O O O 以下に，化合物 1の構造解析の詳細を示す。. 1'. 化 合 物 1 は，HR-APCI-MS よ り 分 子 式 C21H30O6 (m/z. より，糖の吸収と続く血糖値の上昇を抑制することが可 2'. 3' 4' 能となる。これによって，糖尿病症例の 90％ を占める. 379.21214 [M + H]+，∆ + 0.08 mmu, calcd. for C21H31O6. ２型糖尿病治療薬としての可能性が評価される。これま 1 R=CH2CH3 2 R=Ang. 379.21206) であることが明らかとなった。比旋光度は 5 6. 4 R=Ac 用いられているが，服用後の腹部膨張や下痢といった副. より，エステル (1742 cm-1)，ラクトン (1774 cm-1) の存在. でに，アカルボースが食後過血糖治療薬として臨床的に 3 R=C(=O)CHMe2 13 R=H 作用が報告されており，薬用植物などを利用した副作用 OH の少ない糖尿病の治療・予防薬が期待されている。 OH O O. 2．結 果. [α]25D -31.5 (c 0.16, MeOH) であった。IR 吸収スペクトル. が示唆された。1H-NMR，13C-NMR，DEPT，HSQC よりメ O チル基 6，メチレン基 4，メチン基 4，4 級炭素 7 の存在が O 確 認 さ れ た。1H-1H COSY よ り H-1/2/3/4，H-4/15， H-2’/3’(4’)，H-1”/2” の結合が示された (Fig. 3)。HMBC 測. 2-1 成分の単離と同定 OR L. cyathiceps の根の EtOH 抽出物を各種クロマトグラ R. 定 に よ っ て，H-1/C-2, H-6/C-4, C-5, C-7，H-9/C-7, C-8, R1 R2 C-10 の 相 関 が 観 測 さ れ，C-1/2/3/4/5/10 お よ び. 1 フィーにより分離・精製し， H NMR,9 13R=H C NMR， 2 次元 (cacalol) 7 R=Ang. C-5/6/7/8/9/10 CH311 R =Me, Rのデカリン環の存在が示唆された。 =OH. NMR および高分解能マススペクトル測定し，文献記載 10 R=OCH2CH3 8 R=C(=O)CHMe2. 1. 2. 14/C-4, C-5, C-6,RC-10, C-15, CH3-15/C-3, C-4, C-5の相関か 12 R1=OH, 2=Me. . のスペクトルデータと比較することにより構造を決定し. ら，4 位，5 位にメチル基が結合していることが示唆された。さ. た。その結果，新規化合物 1 および 11 種の既知化合物. らに，C-7 (δC 154.4)，C-8 (δC 104.5)，C-12 (δC 170.9) から，. 1,10-epoxyadenostylone (2) ，2 6β-isobutyr Figure Isolated yloxy-1β,10βcompounds 11）. epoxyfuranoeremophil-9-one (3)5），6β-acethoxy-1β,10β11）. epoxyfuranoeremophil-9-one (4) ，6β -isobutyr yloxy（ 2 ）. . 位， 11 位で二重結合を有する α，β - 不飽和 γ - ラクトン環 from7 L. cyathiceps in this study. を形成していることが示された。以上より，化合物 1 が eremophil-7(11)-en-8,12-olide の構造を有することが推定. ─ 272 ─. 1 .
(3) Figure 1 Eremophilane sesquiterpenoids of Ligularia species. 中国横断山脈地域産キク科 Ligularia cyathiceps のセスキテルペノイド成分. O 2. 1. 3. 4. 15. OR. 9. 10. 8. 5. 6. 14. O. 7. O. O 12. O. O. O. O. O. O. O. 11. O. 13. O. OR. O. O. O. 1' 3'. 2'. 4'. 1 R=CH2CH3 13 R=H. OH. 2 R=Ang 3 R=C(=O)CHMe2 4 R=Ac. 5. OH. O. OR. O. O. O. R1 R2. R. 7 R=Ang 8 R=C(=O)CHMe2. 6. 11 R1=Me, R2=OH 12 R1=OH, R2=Me. 9 R=H (cacalol) 10 R=OCH2CH3. . Figure 2 Isolated compounds from L. cyathiceps in this study.. Figure 2 Isolated compounds from L. cyathiceps in this study. された。また，δH 2.12 の特徴的な septet (J=7.0) によって，. H-4/H-6 の NOESY 相関から cis デカリン環が non-steroidal. L. cyathiceps のセスキテルペノイドの置換基としてよく見. conformation を と り，8 位 の 置 換 基 ( 化 合 物 1 の 場 合，. 1 . られる isobutyryloxy 基 [-C(=O)CH(CH3)2] の存在が推測. ethoxy 基 ) が α 位になるとする見解と一致する。以上の. された。さらに詳細なNMR解析により，isobutyryloxy基. 結果から，新規化合物 1は 8α-ethoxy-6β-isobutyryloxy-1β,. (δH 2.12, H-2’, 0.94, 0.96, each d, J=5.2, H3-3’(4’), δC 176.2. 10β-epoxy-eremophil-7(11)-en-8,12-olide であると決定し. (C-1’), 34.7 (C-2’), 19.8 (C-3’), 19.1 (C-4’))，ethoxy 基 (δH. た。. 3.32, 3.40, each dq, J=9.2, 6.9, H-1”, δH 0.99, t, J=6, H-2”, δC. 2-2 LC-MS による EtOH 抽出液のプロファイル. 59.5 (C-1”), 15.8 (C-2”))，epoxy 基 (δH 2.92, d, J=4.0, H-1,. HPLC-ESI-MS によって，EtOH 抽出液のプロファイルを. δC 62.9 (C-1), 61.3 (C-10)) の存在が示唆された。HMBC. 調べたところ，化合物 6 (TR = 20.7 min)， 9 (TR = 17.9 min)， 5. 測定により，isobutyryloxy 基の位置は，H-6/C-1’ の相関. (TR = 16.3 min)，2 (TR = 15.1 min)，3 (TR = 13.3 min)，4 (TR =. から C-6 に結合していると決定した。また，H-1/C-2，. 11.2 min) が検出された (Fig. 4)。ピークの同定は，単離化. H-9/C-10 の HMBC 相関から，epoxy 基が C-1 および C-10. 合物の HPLC の経過時間，および m/z 値との比較により. に結合していると考えられた。一方，ethoxy 基の位置に. 行った。主要成分は，9-oxofuranoeremophilane型である2，. ついて HMBC 相関は観測されなかったが，C-8 (δc 104.5). 3，お よ び cacalol (9) で あ る こ と が わ か っ た (Fig. 4)。. が 4 級炭素で，かつ低磁場シフトしていることから，C-8. 9-oxofuranoeremophilane は cacalol の前駆体であると推. 位に結合していると推定した。以上より，化合物 1 の平. 19） 定されており， 生合成的にも関連した化合物である。. 面構造を決定した。立体構造については，NOESY 相関. また，異なる採集地で得られた L. cyathiceps の成分比と. H-1/H-9α, H-2β/H3-15, H-4/H-6, H-6/8-OCH2CH3, H-9β/. ほぼ同様であり，5），7），20） 最も含有量の多い化合物 3 は. H3-14, H3-14/H3-15 より，epoxy 基，H3-14，H3-15，および. EtOH 抽出物の 25% におよぶ。20） 塩基配列の解析におい. isobutyryloxy 基が β 位，ethoxy 基が α 位であると推定し. ても，L. cyathiceps は他の種と比べて比較的種内多様性. た (Fig. 3)。これは，菊池らによる cis デカリン環の立体. が少ないことが報告されている。5），7），20）. 配座と 8 位の立体配置の関係に関する報告 18）において， ─ 273 ─. （ 3 ）.
(4) 1. O. 2 3. 9. O. 10 4. 5. 14 15. O. 8. 12. 7. 6. H. O. H. O. 15. 13. 4' 1 2 3. 1. O. 4. 5. 6. EtO H. 12. 7. H O. 2". O H O 8. 10. 14. 1. 9. 4. 1" 2. 2'. COSY HMBC. O. H. H. 1'. 3'. 9. OCOCMe2 6 舟崎真理子・吉川 健太・廣田 洋・龔 洵・黒田 智明・大崎 愛弓. 11. O. O 14. NOESY O. . H H. 11. O. O. 15. 13. O. Figure 3 Key H- H COSY, HMBC and NOESY correlations of 1.H 1' 15. 9 6 4. EtO H H. OCOCMe2. H. 2. 2' 3'. O 14. H. 4'. COSY HMBC. NOESY. . Figure 3 Key 1H-1H COSY, HMBC and NOESY correlations of 1.. Figure 3 Key 1H-1H COSY, HMBC and NOESY correlations of 1. 多様性の比較的少ない種であると言える。化合物 1 は， C-8 位の抽出過程での hydroxy 体 (13) の artifact と考え られるが，これまでに天然物として 13 の単離報告はな い。また，本種としては初めてのラクトン体のエレモ フィランセスキテルペノイドであり，多様性の少ない種 から酸化様式の異なる化合物が得られたことは特筆に値 する。種分化の過程や化合物からの種内多様性に関する 研究において，新たに考慮すべき重要な化合物といえ る。横断山脈地域に広く分布するLigularia属の中にあっ て，L. cyathiceps は雲南省香格里拉県を中心として比較 Figure 4 LC profile for EtOH extract of L. cyathiceps.. 的狭い範囲にみられる種である。多様性の少なさは分布 範囲の狭さに関係していると考えられるが，雑種形成も 認められており，20）今回の結果と併せ，将来は多様化に. 2-3 生物活性試験. 向かう可能性もあると思われる。. 血糖値上昇等に関与する α- グリコシダーゼ阻害活性に ついて検討した。α- グルコシダーゼ阻害活性は，パン酵母. 4．実 験. 由来 α-D-glucopyranoside hydrolase を酵素，p-nitrophenyl. 4-1 使用した機器. glucopyranoside (pNPG) を基質として，酵素反応の結果. NMR スペクトルは，テトラメチルシラン (TMS) を. 生成する p-nitrophenol の 405 nm での吸光度の変化を測. 内 部 標 準 と し，CDCl3 を 溶 媒 と し て 日 本 電 子 JNM-. 定することにより評価した。ポジティブコントロールと. ECA500 型により測定した (1H NMR: 500 MHz; 13C NMR:. しては，食後過血糖治療薬として臨床的に服用されてい. 125 MHz)。 質 量 ス ペ ク ト ル は 日 本 電 子 JMS-T100LP. るアカルボースを使用した。その結果，アカルボースは. AccuTOF LC-plus (LC-APCI-HRMS) を用いた。旋光度は，. IC50 = 1.43 µM の阻害能を示したが，L. cyathiceps の根の. 日 本 分 光 DIP-370 を 用 い た。 赤 外 吸 収 ス ペ ク ト ル は，. EtOH 抽出液，および化合物 3 についての阻害活性は認. JASCO FT-IR460plus を用いた。シリカゲルクロマトグラ. められなかった。. フィーは，Wako-gel C-200 および C-300 を用いた。順相. 2 . HPLC は Cosmosil 5SL-II (φ4.6 x 250 mm)，YMC-Pack SIL. 3．考 察. (φ4.6 x 250 mm)，および Inetrsil Diol (φ4.6 x 250 mm)，ま. 今回の L. cyathiceps の根の EtOH 抽出液から得られた. た， 逆 相 HPLC は Cosmosil 5C18 ARII (φ10.0 x 250 mm). セスキテルペノイド化合物は，これまでの L. cyathiceps. を使用した。TLC は Si60 F254 (Merck) を用い，アニスア. の報告と同様の傾向が見られた。すなわち，本種は種内. ルデヒド，エールリッヒ試薬を発色試薬とした。. 2 （ 4 ）. . ─ 274 ─.
(5) 中国横断山脈地域産キク科 Ligularia cyathiceps のセスキテルペノイド成分. 4-3-1 8α-ethoxy-6β-isobutyryloxy-1β,10β-epoxy-. 4-2 植物原料. eremophil-7(11)-en-8,12-olide (1) . L. cyathiceps は，2016 年に中国雲南省香格里拉県天池. Oil; [α]25D -31.5 (c 0.16, MeOH); IR (KBr) ν max 1774,. （北緯 27.3825º，東経 99.3817º）標高 3844 m で採集され， Xun Gong 教授（共著者）によって同定された (Voucher. 1742 cm-1; HR-APCI-MS m/z 379.21214 [M + H]+ (∆ + 0.08. specimen no. 2016-223)。. mmu, calcd. for C21H31O6 379.21206); 1H-NMR (500 MHz,. 4-3 L. cyathiceps の根の抽出と分離. C6D6) δH 5.80 (1H, d, 1.7, H-6), 3.40 and 3.32 (each 1H, dq,. 乾燥した L. cyathiceps の根 27.8 g を EtOH にて 2 回抽出. 9.2. 6.9, H-1”), 2.92 (1H, d, 4.0, H-1), 2.15 (1H, d, 13.2,. した。得られた抽出液をろ過した後，減圧下で濃縮し，. H-9β), 2.12 (1H, sept, 7.0, H-2’), 1.80 (1H, d, 13.2, H-9α),. EtOH 抽出物 2.49 g を得た。. 1.77 (3H, d, 1.7, H3-13), 1,44-1.52 (1H, m, H-4), 1,43-1.72. 得られた抽出物 2.42 g をシリカゲルカラムクロマトグ. (1H, m, H-2), 1,10-1.44 (1H, m, H-3), 1.01 (3H, d, 7.5, H3-. ラフィー (SiO2 CC) (Hexane-EtOAc 100:0 → 0:100) によ. 15), 0.99 (3H, t, 6.9, H-2”), 0.96 (3H, d, 5.2, H-4’), 0.94 (3H,. り 10 の 画 分 に 分 け た (Fr. 1 ～ 10)。Fr.2 を 再 度 SiO2 CC. d, 5.2, H-3’), 0.93 (3H, s, H3-14); 13C-NMR (125 MHz, C6D6). (Hexane-EtOA) にて分画を行い (Fr.2-1 ～ 2-13)，そのう. δC 176.2 (C-1’), 170.9 (C-12), 154.4 (C-7), 127.0 (C-11),. ち の Fr.2-3 お よ び Fr.2-4 を ま と め， さ ら に 順 相 HPLC. 104.5 (C-8), 74.4 (C-6), 62.9 (C-1), 61.3 (C-10), 59.5 (C-1”),. (YMC-Pack SIL, 4.6 x 150 mm, Hexane/EtOAc) を用いて. 44.5 (C-9), 34.7 (C-2’), 33.5 (C-4), 33.5 (C-4), 24.7 (C-3),. 分画することにより 6 (3.7 mg) を得た。Fr.2-10 をさらに. 21.1 (C-2), 19.8 (C-3’), 19.1 (C-4’), 16.8 (C-15), 15.8 (C-2”),. ODS CC (MeOH/H2O) を用いて分画することにより，9. 15.2 (C-14), 9.0 (C-13).. (13.0 mg) を 得 た。 ま た Fr.3 を 再 度 SiO2 CC (Hexane-. 4-4 LC-MS 分析. EtOA) にて分画をし (Fr. 3-1 ～ 3-13)，Fr. 3-2 より 9 (3.3. EtOH 抽 出 物 の LC-MS 分 析 に は， 日 本 電 子 JMS-. mg) を 得 た。Fr.3-3 ～ Fr.3-5 を ODS HPLC (Cosmosil. T100LP AccuTOF LC-plus (LC-ESI-MS) を用いた。HPLC. 5C18 ARII, 10 x 250 mm, MeOH/H2O) により分画を行. は，カラム Capcell Pak C18 AQ (φ3.0 x 150 mm) を用い，. い，Fr.3-3 よ. り 7 (0.7 mg), 9 (0.3 mg), 1 (0.2 mg) を，. グラジエント条件 MeOH/H2O (7 : 3) → 20 min → (10 : 0). Fr.3-4 よ り 7 (0.6 mg), 1 (0.3 mg) を，Fr.3-5 よ り 7 (0.9. → 5 min → (10 : 0)，流速 0.2 ml/min，検出波長 220 nm. mg), 8 (1.4 mg), 10 (1.2 mg), 1 (1.1 mg) を 得 た。Fr.3-7,. とした。. Fr.3-11 を. 4-5 生物活性試験. 順. 相 HPLC (Inertsil Diol, 4.6 x 250 mm,. Hexane/EtOAc) を用いて分画を行うことにより，Fr.3-7. α- グルコシダーゼ阻害活性. から 5 (2.3 mg)，Fr.3-11 から 2 (5.4 mg)，3 (16.8 mg) を得. 検体溶液 (1 ～ 1000 µg/mL) 1 mL に対して α- グルコシ. た。Fr.3-8 を 順 相 HPLC (Cosmosil 5SL-II, 4.6 x 250 mm,. ダーゼ溶液 (0.02 U/mL) 0.5 mL を添加し，37 度で 5 分間. Hexane/ EtOAc) を 用 い て 分 画 す る こ と に よ り 5 (0.8. イ ン キ ュ ベ ー ト し た。 さ ら に pNPG 溶 液 (20 mM) 0.5. mg) を得た。Fr.4 を順相 HPLC (YMC-Pack SIL, 10 x 250. mL を添加し，15 分後に Na2CO3 溶液 (0.2 M) 2 mL を添加. mm, Hexane/EtOAc) を用いて分画することにより，2. することによって反応停止とし，405 nm における吸光度. (5.2 mg), 3 (55.7 mg), 4 (4.1 mg), 11 (5.5 mg), 12 (3.7. 21） を測定した 。. mg) を得た。. 引用文献 1) H. Gutzeit, J. Ludwig-Muller, Plant natural Products: Synthesis, Biological Functions and Practical Applications, Wiley-VCH, Weinheim (2014). 2) S. W. Liu, & I. D. Illarionova, Ligularia Cassini. In: Z. Y. Wu, & P. H. Raven, (Eds.) Flora of China, vol. 20–21. Science Press, Beijing & Missouri Botanical Garden Press, St. Louis, pp. 376–415 (2011). 3) M. Tori, K. Honda, H. Nakamizo, Y. Okamoto, M. Sakaoku, Takaoka S., Gong X., Shen Y. M., Kuroda C., Hanai R., Tetrahedron, 62, 4988-4995 (2006). 4) M. Tori, Y. Okamoto, K. Tachikawa, K. Mihara, A. Watanabe, M. Sakaoku, S. Takaoka, M. Tanaka, X. Gong, ─ 275 ─. 5). 6). 7) 8). C. Kuroda, M. Hattori, R. Hanai, Tetrahedron, 64, 91369142 (2008). H. Nagano, A. Torihata, M. Matsushima, R. Hanai, Y. Saito, M. Baba, Y. Tanio, Y. Okamoto, Y. Takashima, M. Ichihara, X. Gong, C. Kuroda, M. Tori, Helv. Chim. Acta, 92, 2071-2081 (2009). Y. Saito, M. Hattori, Y. Iwamoto, Y. Takashima, K. Mihara, Y. Sasaki, M. Fujiwara, M. Sakaoku, A. Shimizu, X. Chao, C. Kuroda, X. Gong, R. Hanai, M. Tori, Tetrahedron, 67, 2220-2231 (2011). Y. Saito, Yakugaku Zasshi, 132, 1451-1459 (2012). C. L. Cantrell, S. O. Duke, F. R. Fronczek, W. L. Osbrink, （ 5 ）.
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