博士論文

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(1)博士論文アルツハイマー病治療薬を指向した新規 γ-セクレターゼ調節薬のデザインと合成ならびに生物学的評価. 2016 年 9 月. 高井. 隆文.

(2) 目次略語表. 第一章. 2 序論. 4. 1-1 アルツハイマー病治療の現状と課題. 4. 1-2 アルツハイマー病とアミロイド β ペプチド（Aβ）. 5. 1-3 γ-セクレターゼおよびその阻害薬の現状と課題. 5. 1-4 γ-セクレターゼ調節薬. 7. 第二章. Aβ42 選択的低下作用を示す新規ピペラジン誘導体の合成研究. 9. 2-1 研究背景. 9. 2-2 分子設計戦略. 10. 2-3 化合物の合成. 10. 2-4 生物活性と考察. 14. 2-5 第二章のまとめ. 22. 第三章 5,6,7,8-テトラヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン骨格を有する新規γ-セクレターゼ調節薬の合成研究. 23. 3-1 研究背景. 23. 3-1-1 シード化合物 1,2,4-トリアゾール誘導体 42 の創出. 23. 3-1-2 Ligand-lipophilicity efficiency (LLE)を指標とした創薬研究. 23. 3-2 分子設計戦略. 24. 3-3 化合物の合成. 24. 3-4 生物活性と考察. 33. 3-5 第三章のまとめ. 46. 第四章総括. 47. 実験の部. 48. 参考文献. 91. 1.

(3) 略語表 Aβ. amyloid-beta. Ac. acetyl. ADDP. 1,1'-(azodicarbonyl)dipiperidine. Anal. elemental analysis. APCI. atmospheric pressure chemical ionization. APP. amyloid-beta precursor protein. Ar. aryl. AUC. area under the concentration-time curve. BA. bioavailability. Boc. tert-butoxycarbonyl. CDI. carbonyldiimidazole. CLtotal. total body clearance. Cmax. maximal drug concentration. CNS. central nervous system. dba. dibenzylideneacetone. DEAD. diethyl azodicarboxylate. DEPC. diethylphosphorocyanidate. DIPEA. ethyl N,N-diisopropylamine. DME. 1,2-dimethoxyethane. DMF. N,N-dimethylformamide. DMSO. dimethyl sulfoxide. ELISA. enzyme-linked immunosorbent assay. ESI. electronspray ionization. Et. ethyl. FBS. fetal bovine serum. HATU. O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate. HPLC. high performance liquid chromatography. IC50. half maximal (50%) inhibitory concentration. IP. inflection point. IPE. diisopropyl ether. i.v.. intravenous injection. LAH. lithium aluminium hydride. LC. liquid chromatography. LLE. ligand-lipophilicity efficiency 2.

(4) Me. methyl. MLM. mice liver microsome. MOE. molecular operating environment. MRT. mean residence time. Ms. mesyl, methanesulfonyl. MS. mass spectrometry. mp. melting point. NADP. nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. NCS. N-chlorosuccinimide. NMDA. N-methyl-D-aspartic acid. NMR. nuclear magnetic resonance. NORT. novel object recognition test. NSAID. nonsteroidal anti-inflammatory drug. Ph. phenyl. p.o.. per os. Py. pyridine. rt. room temperature. RT. retention time. SEM. standard error of the mean. TFA. trifluoroacetic acid. THF. tetrahydrofuran. Ts. tosyl, p-toluenesulfonyl. UV. ultraviolet. Vdss. steady state volume of distribution. WT. wild-type. 3.

(5) 第一章. 序論. 1-1 アルツハイマー病治療の現状と課題近年、認知症は拡がり続けており、公衆衛生上の重要課題として認識されている。2014 年、世界における認知症患者数は約 4400 万人に達し、2050 年までにその 3 倍近くに増加すると見られている。また、認知症のケア、治療等による社会的損失コストも 6040 億 US ドルと試算され、増加の一途を辿っている. 1. 。高齢化の進む日本においても、認知症患者数. は 2012 年で推計 460 万人を超えており、国を超えての認知症対策が急務である 2 。認知症にはいくつかの種類がある。脳の血管障害による脳血管性認知症や、脳にレビー小体という異常タンパク質が蓄積し、神経細胞が死滅するレビー小体型認知症などが知られているが、アルツハイマー型認知症（アルツマイマー病）の患者数が最も多く、認知症患者全体の 50‒75%を占めると言われている 1,. 2. 。アルツハイマー病は、記憶力が低下しは. じめる初期症状、行動障害を示すこともある中期症状、更にはコミュニケーション不能や運動機能の低下も伴う後期症状を示す進行性の神経変性疾患であり、病を抱える患者本人のみならず、家族をはじめ周囲への影響も非常に大きい 3 。現在、Figure 1 に示したとおり、アルツハイマー病の治療薬としてドネペジル 4 、ガランタミン 5 、リバスチグミン 6 、メマンチン 7 が承認されているが、いずれも対症療法薬（アルツハイマー病の症状に対する治療薬）である。ドネペジル、ガランタミン、リバスチグミンはいずれもアセチルコリンエステラーゼ阻害薬であり、脳内のアセチルコリン濃度を高めることにより、日常生活動作や認知機能の一時的な改善をもたらす。また、メマンチンは N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体拮抗作用により認知機能の改善を示す。しかしながら、これらの薬剤はあくまで対症療法薬であり、その効果が長期間持続することはなく、アルツハイマー病の進行そのものを止めることはできない。ドイツのアロイス・アルツハイマー博士により、アルツハイマー病が報告されてから 100 年以上が経過し、世界中の研究機関、医療機関による調査、研究、および数多くの臨床試験が行われてきたが、未だにアルツハイマー病の発症、進行のメカニズムは不明な点が多く、根本的な治療法は確立していないのが現状である 8 。. 4.

(6) Figure 1. アルツハイマー病治療薬として承認されている薬剤. 1-2 アルツハイマー病とアミロイド β ペプチド（Aβ）アルツハイマー病の特徴的な病理学的所見として、脳におけるアミロイド斑（老人斑）と神経原線維変化の形成が挙げられる 9 。これらは異常タンパク質の凝集・蓄積によるものであり、神経細胞の外側に形成されるアミロイド斑はアミロイド β ペプチド（Aβ）、内側に形成される神経原繊維変化は過剰リン酸化タウタンパク質によって、それぞれ構成されている。アルツハイマー病の約 10%を占める家族性アルツハイマー病の遺伝子解析において、 Aβ 前駆体タンパク質（APP）の遺伝子や、Aβ の産生に関わる酵素の遺伝子から原因遺伝子変異が同定されている。これらのことは、Aβ の脳への蓄積がアルツハイマー病の発症に関与している可能性を示しており、アミロイド仮説として広く提唱されている 10–12 。. 1-3 γ-セクレターゼおよびその阻害薬の現状と課題アミロイド斑の構成成分である Aβ は、APP が β-セクレターゼおよび γ-セクレターゼにより切断されることで生成する（Figure 2）。第一段階として、β-セクレターゼが APP を切断し、第二段階として、膜に残った 99 アミノ酸からなるフラグメント（C99）を γ-セクレターゼが切断し、種々の Aβ を産生する 13, 14 。Aβ として、40 アミノ酸からなる Aβ40 および、 Aβ40 よりもアミノ酸が 2 残基多く、神経毒性が強くて凝集性の高い Aβ42 等が知られている。. 5.

(7) Figure 2. β-セクレターゼおよび γ-セクレターゼのによる APP の切断機構. これらのことから、アミロイド仮説に基づき、Aβ の産生を抑えることを目的としたアルツハイマー病治療薬として、β-セクレターゼおよび γ-セクレターゼの阻害薬の研究が精力的に行われてきた 15–20。β-セクレターゼ阻害薬に先んじて、γ-セクレターゼ阻害薬の臨床開発が進められたが、γ-セクレターゼは細胞分化に関わる Notch など APP 以外の基質も切断することが知られており、γ-セクレターゼ阻害作用は副作用につながると考えられている 21 。実際 γ-セクレターゼ阻害薬であるセマガセスタット（Figure 3）は、アルツハイマー病の臨床試験第 III 相まで進んだが、Notch シグナルの阻害が原因と考えられる皮膚ガンのリスクや免疫細胞の減少といった深刻な副作用を示し、その開発は中止された. 22–24. 。さらにセマ. ガセスタットの臨床試験においては、認知機能の低下も報告され、C99 の膜内への蓄積が原因の一つとして考えられている. 25. 。副作用の低減を目的に、Notch の切断に対して APP の. 切断をより選択的に阻害する γ-セクレターゼ阻害薬の開発も進んでいるが、未だに臨床試験における種々の副作用の問題は解決していない 26, 27。. Figure 3. γ-セクレターゼ阻害薬セマガセスタット. 6.

(8) 1-4 γ-セクレターゼ調節薬 γ-セクレターゼ阻害薬とは異なる薬剤クラスで、病原性の Aβ 生成を抑える薬剤として、 γ-セクレターゼ調節薬が知られている。Tarenflurbil に代表される非ステロイド性抗炎症薬（Nonsteroidal anti-inflammatory drug, NSAID）系の γ-セクレターゼ調節薬、および E-2012 に代表される non-NSAID 系の γ-セクレターゼ調節薬の二系統が報告されている（Figure 4）28– 32. 。γ-セクレターゼ調節薬は直接的に γ-セクレターゼを阻害せず、Notch 切断に影響しない. ことから、γ-セクレターゼ阻害薬と比較して、副作用の低減が期待されるアルツハイマー病治療薬として注目されている。. Figure 4. 代表的な γ-セクレターゼ調節薬. γ-セクレターゼ調節薬は γ-セクレターゼのアロステリックサイトに結合し、γ-セクレターゼの構造変化による C99 の切断パターンの変化を引き起こすことで、病原性が低いと考えられている Aβ37、Aβ38 や Aβ39 の生成を増やし、同時に病原性の Aβ40 や Aβ42 の生成を抑えると考えられている. 33–39. 。Non-NSAID 系の γ-セクレターゼ調節薬からデザインされた種々. の光親和性標識プローブが報告されており（Figure 5）、これらのプローブを用いた実験により、γ-セクレターゼ調節薬が γ-セクレターゼの構成成分であるプレセニリンの N 末端側部位に結合することが示されている。. Figure 5. γ-セクレターゼ調節薬の光親和性標識プローブ 7.

(9) 本博士論文では、アンメットメディカルニーズの非常に高いアルツハイマー病治療薬を指向した新規な γ-セクレターゼ調節薬の創薬研究について記述する。第二章で Aβ42 とアルツハイマー病との関わりを検証できる薬理ツールの創出を目的とした Aβ42 選択的な阻害作用を示すピペラジン誘導体の合成研究について述べ、第三章では、γ-セクレターゼ調節薬の創薬研究における新規な活性向上戦略の創出を目的に、ligand-lipophilicity efficiency (LLE) を指標とした 5,6,7,8-テトラヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン系 γ-セクレターゼ調節薬の合成研究について論じる。. 8.

(10) 第二章. Aβ42 選択的低下作用を示す新規ピペラジン誘導体の合成研究. 2-1 研究背景新規 γ-セクレターゼ調節薬の創出を目的として、ラット初代培養神経細胞における Aβ 低下作用を指標に、自社化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニング、およびヒット化合物からの誘導体合成を行った 40。その結果、Aβ42 の低下作用を示す新規ピペラジン誘導体 1 が見出され、興味深いことに、1 は NSAID 系の γ-セクレターゼ調節薬と同様に、 Aβ40 に対しては低下作用を示さなかった。種々の Aβ の中でも、Aβ42 およびそのオリゴマーは特に強い神経毒性を示すことから、Aβ42 はアルツハイマー病の病態に深く関わっていると考えられている。既存の γ-セクレターゼ調節薬の中にも選択的な Aβ42 低下作用を示す化合物はあるものの、in vivo 試験において、Aβ42 とアルツハイマー病との関わりを検証するのに十分な動態、中枢移行性を示す化合物は少ない 41, 42 。また、化合物 1 も in vivo 試験においては、わずかな脳内 Aβ42 低下作用（4% reduction after 3 h at a dose of 100 mg/kg p.o.）を示すに留まり、アルツハイマー病における Aβ42 選択的低下作用の効果を検証するには in vivo での Aβ42 低下作用を増強させる必要があった。この原因として、化合物 1 の不十分な in vitro 活性および経口吸収性が考えられたため、化合物 1 をシード化合物として、Aβ42 選択的低下作用を維持したまま、活性の向上、および代謝安定性の改善による経口吸収性の向上を目的とした最適化研究を開始した。. Figure 6. シード化合物（新規ピペラジン誘導体 1）. 9.

(11) 2-2 分子設計戦略 γ-セクレターゼ調節薬の合成研究において左側ビアリール部分は変換の余地が少ないことが知られているため、この部分の変換としては、イミダゾール環の代替として、より高極性の 5 員ヘテロ環の導入により代謝安定性を向上させることを計画した (Figure 7) 。また、ピペラジン環および 1-ナフチルエチルウレア部分に関しては、構造変換による代謝部位の特定および代謝部位のブロックによる代謝安定性の改善を計画した。. Figure 7. 新規ピペラジン誘導体 1 からの分子設計戦略. 2-3 化合物の合成種々のビアリールハライド 4a‒d の合成を Scheme 1 に示した。アニリン 2 を酸性条件下、亜硝酸ナトリウムと反応させジアゾニウム塩とした後に、塩化スズで還元してヒドラジン 3 を調製した。続いて 3 とメチル＝エタンイミドチオアートとを縮合させた後に、オルトギ酸トリメチルとピリジン存在下、加熱することで、1,2,4-トリアゾール 4a を得た。ブロミド 5 を 1-メチルピラゾール-4-ボロン酸ピナコールエステルとのカップリングにより、ビアリール体 6 へ導いた後に、ナトリウム＝メトキシドと反応させることで、ピラゾール誘導体 4b を得た。アニリン 7 と α,α-ジクロロアセトン＝トシルヒドラゾン 43 とを反応させて、1,2,3 トリアゾール 8 を調製後、求核反応によりメトキシ基を導入し、目的の 4c を得た。既知反応 44 を応用し、ケトン 9 をオキサゾール 10 へと導いた後に、メトキシ基を導入し、4d を合成した。. 10.

(12) Scheme 1. Reagents and conditions: (a) NaNO2, conc. HCl, H2O, ‒20 ºC to 0 ºC, then SnCl 2, ‒20 ºC to rt, 90%; (b) i) methyl ethanimidothioate hydroiodide, MeOH, rt; ii) CH(OMe) 3, toluene, pyridine, 100 ºC, 61%; (c) 1-methyl-4-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)-1H-pyrazole, Pd(PPh3)4, 2. M. Na2CO3, toluene, EtOH, 80 ºC, 62%; (d) 28% NaOMe/MeOH, DMF, 100 ºC, 88‒100%; (e). α,α-dichloroacetone tosylhydrazone, MeOH, 0 ºC to reflux, 14%; (f) PhI(OAc)2, CF3SO3H, MeCN, rt to reflux, 75%.. 得られたウレア誘導体の合成を Scheme 2 に示した。ビアリールハライド 4a‒d を原料に、 Buchwald 反応により 1-Boc-ピペラジンを導入し、Boc 基の脱保護、ウレア化を順次行い、 12‒16 を得た。. Scheme 2. Reagents and conditions: (a) 1-Boc-piperazine, Pd2(dba)3, DavePhos, t-BuONa, toluene, 90 ºC, 62‒82%; (b) 4 M HCl/EtOAc; (c) isocyanate or amine, CDI, 43‒81%.. 11.

(13) 次に中央のピペラジン環を変換した化合物群を Scheme 3 の通り合成した。ホモピペラジン 20、メチルピペラジン 21 および 22 は Scheme 2 と同様の方法で合成した。ブロミド 4d と N-Boc-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン-4-ボロン酸ピナコールエステルとのカップリング、続く Boc 基の脱保護により、テトラヒドロピリジン 23 を得た。続いてウレア化、二重結合の還元により、目的のピペリジン 24 を合成した。. Scheme 3. Reagents and conditions: (a) cyclic amines, Pd2(dba)3, DavePhos, t-BuONa or t-BuOK, toluene, 90 ºC, 48‒88%; (b) i) 4 Et3N. or. DIPEA,. M. HCl/EtOAc, EtOAc, rt; ii) (S)-1-(1-naphthyl)ethyl isocyanate, DMF,. rt,. 32‒95%;. (c). tert-butyl. 4-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)-5,6-dihydropyridine-1(2H)-carboxylate, Pd(PPh3)4, 2 M Na2CO3, DME, 80 ºC, 100%; (d) 4 M HCl/EtOAc, EtOAc, rt, 66%; (e) i) (S)-1-(1-naphthyl)ethyl isocyanate, THF, 0 ºC to rt, 53%; ii) H2, Pd/C, MeOH, rt, 58%.. 12.

(14) Scheme 4 にアミド誘導体の合成を示した。原料となる 11d および 18 の Boc 基を脱保護した後に、25 のクロロアセチル化、続く求核置換反応により 28 を得た。類縁体 33 および 34 も同様の方法で合成した。アミド体 29 は 1H-インダゾール-1-イル酢酸との縮合により調製した。同様の反応条件で、対応するカルボン酸からアミド体 35‒37 を合成した。ピペラジン 25 または 26 と N-アリールグリシン 30 とを縮合させ、オルトギ酸トリメチルおよびギ酸存在下、ニトロ基を還元することでベンゾイミダゾール誘導体 31 または 32 を得た。類縁のベンゾイミダゾール誘導体 38‒40 も同様の方法で合成した。. Scheme 4. Reagents and conditions: (a) 4. M. HCl/EtOAc, EtOAc, rt, 93‒97%; (b) chloroacetyl. chloride, Et3N, DMF, rt, 62%; (c) dihydroisoindole, DIPEA, NaI, DMF, 70 ºC, 38%; (d) (1H-indazol-1-yl)acetic acid, DEPC, Et3N, DMF, rt, 73%; (e) i) 30, DEPC or HATU; ii) H2, Pd/C, CH(OMe)3, HCO2H, rt, 26‒31%.. 13.

(15) 2-4 生物活性と考察ラット初代培養大脳皮質神経細胞を用いて、合成した化合物を 3 日間処置し、ELISA により Aβ42 量を測定した（Table 1）。一連のピペラジン誘導体は、パーシャルな Aβ42 低下作用を示したため、変曲点（inflection point, IP）および最大阻害活性値にて Aβ42 低下作用を記載した。また in vitro の代謝安定性はマウスの肝ミクロソームを用いた代謝安定性試験で測定した。なお、本研究におけるアッセイ全般は共同研究者により実施された。一般的に、化合物の極性を増すと酸化代謝に対する安定性は向上すると言われているため 45 、まずは化合物 1 のイミダゾール環を、より高極性の 1,2,4-トリアゾール（12）、ピラゾール（13）、1,2,3-トリアゾール（14）およびオキサゾール（15）へと置換したものの、高極性の 12 および 15 において、わずかな代謝安定性の改善を示すにとどまり、1,2,3-トリアゾール誘導体 14 においては、大きく代謝安定性が低下した。この結果は、一連のピペラジン誘導体において、代謝安定性に対する化合物の極性の寄与は限定的であり、1 のピペラジン環、または 1-ナフチルエチルウレア部分が酸化代謝を受けていることが推測される。活性面に関しては、オキサゾール誘導体 15 が最も強い Aβ 低下作用を示した。一方で、1,2,3トリアゾール誘導体 14 において大幅な活性の低下が確認された。これら誘導体の活性差とコンフォメーションの考察から、γ-セクレターゼ調節薬において広く保存されている左側ビアリール構造の活性コンフォメーションを推察するために、 Molecular Operating Environment (MOE) software46 を用いて、1, 14 および 15 のビアリール部分フラグメントである 1', 14’および 15’の最安定配座を計算した。その結果、いずれのフラグメントでもねじれ配座が最安定となり、これには、それぞれのヘテロ環上の水素原子とメトキシ基との分子内水素結合が寄与していると考えられた（Figure 8）。14’の 1,2,3-トリアゾール環は 1’および 15’のイミダゾール環およびオキサゾール環と比較して、180 度フリップした配座で安定化されている。また 14’の 1,2,3-トリアゾール環を 180 度フリップさせるためには 1.4 kcal/mol のエネルギーが必要であるとの計算結果を得た（Figure 9）。この回転障壁は、先に述べた 14’の最安定配座における分子内水素結合、および最安定配座から 180 度フリップする際の 1,2,3-トリアゾール環 2 位の窒素原子とメトキシ基の反発によるものと推測される。これらのことから、1’や 15’で固定化されている末端ヘテロ環の窒素原子とメチル基の両方、またはいずれか一方の位置が γ-セクレターゼ調節薬としての活性発現に重要であると考えられる。. 14.

(16) Table 1 Aβ42-lowering effects of 1, 12‒15 their clog P values, and their in vitro metabolic clearance in mice liver microsomes. Aβ42 IP a. Max. Inh. b. (nM). (%). 1. 56. 57. 5.1. 150. 12. 170. 68. 4.3. 110. 13. 180. 63. 4.3. 150. 14. 450. 47. 4.9. 230. 15. 34. 67. 4.4. 130. Compound. a. Ar. clog P. c. MLM d (μL/min/mg). IP value is the mean of triplicate measurements. b Maximum inhibition (Max. Inh.) is % inhibition. at 3 μM of compound. Each value is the mean of triplicate measurements. c Calculated by Daylight Software.47 d In vitro metabolic clearance in mice liver microsomes.. 15.

(17) Figure 8. The most stable conformations of 1’ (yellow), 14’ (purple) and 15’ (green) calculated by MOE.. Figure 9. Calculated energy barrier between the most stable conformation of 14’ (left) and the 180° rotated form (right).. 次に、一連のピペラジン誘導体から、オキサゾール誘導体 15 を選出し、酸化代謝を受けていると推測されるピペラジン環、または 1-ナフチルエチルウレア部分の最適化により代謝安定性の向上を検討した。15 のピペラジン環を環拡大したホモピペラジン誘導体 20 においては、Aβ 低下作用は維持したものの、代謝安定性が低下した（Table 2）。またピペリジン誘導体 24 においては、活性が約 8 倍低下し、24 におけるコンフォメーション変化が、望ましくない影響を与えたと考えられる。次にピペラジン環へのメチル基の導入を検討したが、 (S)-体 21 において、わずかな活性の向上が確認され、代謝安定性への影響は確認されなかった。一方で、(R)-体 22 においては、活性の向上は確認されなかった。これらの検討から、ピペラジン環への(S)-メチル基の導入は、活性向上に利用できることが明らかとなった。 16.

(18) Table 2 Aβ42-lowering effects of 15, 20‒22, 24 and their in vitro metabolic clearance in mice liver microsomes. a. IP value is the mean of triplicate measurements. b Maximum inhibition (Max. Inh.) is % inhibition. at 3 μM of compound. Each value is the mean of triplicate measurements.. c. In vitro metabolic. clearance in mice liver microsomes.. 最後に、1-ナフチルエチルウレア部分の最適化を行った（Table 3）。まずはベンジル位の (S)-メチル基が活性および代謝安定性に与えている影響を確認するために、無置換体 16 を合成し、評価した。その結果、活性および代謝安定性はほとんど変化せず、15 のベンジル位(S)-メチル基がそれらに与える効果は限定的であった。続いて、酸化代謝を受けやすいと考えられるベンジル位を取り除くために、ヘテロ環の窒素原子でリンクしている 28, 29 お. 17.

(19) よび 33‒36 を合成し、代謝安定性の改善を図った。また、更なる代謝安定性の向上を目的に、代謝を受けやすい 16 のナフタレン環の一方のベンゼン環の除去を検討した。その際に、 16 のナフタレン環において、いずれのベンゼン環が活性発現に重要かを判断するために、イソインドリン誘導体 28 およびインドリン誘導体 33 を調製し、それぞれの活性を比較した。いずれの誘導体においても活性は減弱したが、とくに 28 において顕著であった。この結果から、16 のナフタレン環の両ベンゼン環は、いずれも Aβ 低下作用に重要であり、特に内側のベンゼン環の重要度が高いことが示唆された。続いて 33 のインドリン環を、インドール環へと変換したところ、活性の向上が確認された。34 においては、代謝安定性の向上は達成されなかったが、より極性の高い 29, 35 および 36 において、代謝安定性が大幅に向上した。なかでもベンゾイミダゾール誘導体 35 は最も強い Aβ 低下作用を示した。続いて、更なる活性向上を目的に、16 のナフタレン環が占有していた空間の再充填を指向し、35 の末端にトリフルオロメチル基を導入した。ベンゾイミダゾール環 4 位へのトリフルオロメチル基の導入は、活性に影響しなかったものの（37）、5-CF3 誘導体（31）および 6-CF3 誘導体（38）はナフタレン誘導体 16 と同等の活性を示した。一方で、7 位へのトリフルオロメチル基の導入は大幅に活性を減弱させた（40）。また、中央ピペラジン環への(S)-メチル基の導入により、さらなる活性の向上を達成し（32, 39）、良好な代謝安定性を示した 32 を精査化合物として選出した。32 の Notch シグナルに対する活性を調べたところ、予想通り、全く阻害活性を示さなかった（IC50 > 30 μＭ）。次にヒト神経芽細胞腫細胞 IMR-32 を用いて、 32 の Aβ40, Aβ42 および total Aβ に対する影響を調べた。その結果、Aβ42 に対しては濃度依存的な阻害作用を示し、Aβ40 に対してはわずかな増加作用を示した。また、total Aβ はほとんど変化しなかった（Figure 10）。これらの結果は、32 が γ-セクレターゼの APP 切断部位をシフトさせ、その結果として、Aβ42 が選択的に低下することを示唆している。さらに 32 はマウスを用いた動態試験において、良好な経口吸収性を示した（Table 4）。この結果には、32 の良好な代謝安定性が大きく寄与していると考えられる。最後に 32 を用いて、マウスへの投与における in vivo Aβ 低下作用の検討を行った。その結果、in vitro 試験のプロファイルを反映し、32 の 100 mg/kg 経口投与によって、脳内および血漿中の Aβ42 が有意に低下し、一方で、Aβ40 への影響はほとんど観察されなかった（Table 5）。. 18.

(20) Table 3 Aβ42-lowering effects of 15, 16, 28, 29, 31‒40 and their in vitro metabolic clearance in mice liver microsomes. 19.

(21) a. IP value is the mean of triplicate measurements. b Maximum inhibition (Max. Inh.) is % inhibition. at 3 μM of compound. Each value is the mean of triplicate measurements. clearance in mice liver microsomes.. 20. c. In vitro metabolic.

(22) Figure 10. Effect of 32 on Aβ levels in IMR-32 human neuroblastoma cells.. Table 4 Pharmacokinetic parameters of 32a. a. Vdss b. CLtotal b. Cmax c. AUC c. MRT c. BA d. (mL/kg). (mL/h/kg). (μg/mL). (μg·h/mL). (h). (%). 360. 117. 773.1. 3932.0. 3.26. 46. Mice cassette dosing at 0.1 mg/kg for i.v. administration and 1 mg/kg for p.o. administration (male,. n = 3). b Vdss (steady state volume of distribution), and CLtotal (total body clearance) obtained with i.v. administration. c Cmax (maximal drug concentration), AUC (area under the concentration-time curve), and MRT (mean residence time) obtained with p.o. administration. d Bioavailability.. Table 5 In vivo profile of 32 in C57BL/6J mice (male, 10 w.o.) brain Aβ (%)a. a. plasma Aβ (%)a. Aβ42. Aβ40. Aβ42. Aβ40. 41b. 105. 36b. 106. Expressed as % vehicle at 3 h after dosing (n = 7). b p < 0.05 Student’s t-test.. 21.

(23) 2-5 第二章のまとめ第二章においては、Aβ42 とアルツハイマー病との関わりを検証できる経口投与可能な薬理ツールの創出を第一の目的に、新規ピペラジン系 γ-セクレターゼ調節薬のデザインおよび合成を行った。Aβ42 低下作用および代謝安定性の向上を目的に、シード化合物 1 の各部位の最適化を行い、ベンゾイミダゾール誘導体 32 を見出した。また、その過程で化合物 32 の部分構造であるオキサゾリルフェニル基は、多くの γ-セクレターゼ調節薬の共通部分構造であるイミダゾリルフェニル基の代替となることを示した。32 は強力な in vitro の Aβ42 低下作用、およびマウスを用いた動態試験において良好な経口吸収性を示した。さらに 32 はマウスを用いた in vivo 試験において、Aβ42 を選択的に低下させた。以上のことから、化合物 32 には、アルツハイマー病の発症や進展における Aβ42 の役割を解明する際の有用な薬理ツールとしての役割が期待される。. 22.

(24) 第三章 5,6,7,8-テトラヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン骨格を有する新規 γ-セクレターゼ調節薬の合成研究 3-1 研究背景 3-1-1 シード化合物 1,2,4-トリアゾール誘導体 42 の創出第二章において独自に見出したオキサゾリルフェニル基を活用し、新規な γ-セクレターゼ調節薬を見出すことを目的に、オキサゾリルフェニル基と、既知の様々な γ-セクレターゼ調節薬の右側部分構造とのハイブリット合成を行った。その結果、米メルク社から報告されている γ-セクレターゼ調節薬 4141 の部分構造を有する 1,2,4-トリアゾール誘導体 42 が、中程度の Aβ42 低下作用（IC50 2000 nM）を示すことを見出した (Figure 11) 。. Figure 11. ピペラジン誘導体 32 および 1,2,4-トリアゾール誘導体 41, 42. 3-1-2 Ligand-lipophilicity efficiency (LLE)を指標とした創薬研究創薬研究において、化合物への脂溶性の付加は、活性の増強につながることが多いものの、同時に毒性発現に関連する酵素やレセプター等への非特異的な親和性の向上や、物性の悪化等、ドラッグライクネスの低下につながることが多い。したがって、化合物の標的分子に対する真の活性と、化合物の脂溶性とを切り離して最適化研究を進める場合には、以下の式で表される Ligand-lipophilicity efficiency (LLE)が最適化の指標として利用される 48 。. LLE = 活性（pIC50 など）－脂溶性（clog P, log D など）. γ-セクレターゼ調節薬の合成研究において、Gijsen らが化合物への脂溶性の付加と Aβ 低下作用の関連性を解析している 49。彼らは、化合物への脂溶性の付加は Aβ 低下作用を効果的に増強しているものの、化合物のドラッグライクネスは低下していると論じている 50 。以上のことから、脂溶性の付加によらない新たな γ-セクレターゼ調節薬の活性向上戦略の創出を目的に、1,2,4-トリアゾール誘導体 42 から LLE を指標とした最適化研究を行った。. 23.

(25) 3-2 分子設計戦略第一にシード化合物 42 の末端ベンゼン環の活性コンフォメーションの固定化による活性および LLE の向上を計画した (Figure 12) 。さらに LLE 向上を指向する上で適切な極性基および脂溶性基の導入位置、コンフォメーションの探索を計画した。. Figure 12. シード化合物 42 からの分子設計戦略. 3-3 化合物の合成 Scheme 5 の通り、ブロミド 4d をニトリル 43 へと変換したのちに、ヒドラジド 44 との縮合、分子内環化を行い 1,2,4-トリアゾール誘導体 42 を合成した。. Scheme 5. Reagents and conditions: (a) Zn(CN)2, Pd2(dba)3, DavePhos, DMF, 130 oC, 88%; (b) K2CO3, n-BuOH, 120 oC, 12%.. 24.

(26) 次に、ニトリル 43 を原料とし、カルボン酸 45 を経て、カルバジン酸 tert-ブチルと縮合させた後に、Boc 基の脱保護を行いヒドラジド 46a へと導いた。45 とヒドラジンを縮合させてヒドラジド 46b を直接得ることも可能であった。フェニルアセトニトリル誘導体 47 のベンジル位をアルキル化した後に、酸性条件下でのエタノリシスによりイミダート 49 を得た。 49 とヒドラジド 46a とをイミダゾール存在下反応させることで、テトラヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン誘導体 50 を合成した（Scheme 6）。. Scheme 6. Reagents and conditions: (a) n-BuOH, 8. M. t-butyl carbazate, DEPC, Et3N, DMF, rt, 73%; (ii) 4. NaOH aq., reflux, 74%; (b) For 46a, (i). M. HCl/EtOAc, EtOAc, rt, 96%; For 46b,. hydrazine monohydrate, CDI, THF, 92%; (c) 1-bromo-3-chloropropane, t-BuOK, THF, ‒10 oC to rt, 35%; (d) AcCl, EtOH, 0 oC to rt, 76%; (e) 46a, imidazole, MeOH, rt to 65 oC, 46%.. 25.

(27) テトラヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン誘導体および関連誘導体は Scheme 7 の通り合成した。フェニル酢酸誘導体 51 のベンジル位を 1-ブロモアルカン類 52a‒c によりアルキル化し 53a‒c とした後に、ヒドラジド 46a または 46b と縮合させることで、ジアシル体 54a‒d へと導いた。続いて四塩化炭素、トリフェニルホスフィンを用いて環化させることにより、オキサジアゾール誘導体 55a‒d を得た。次に 55a‒d に対して求核的に導入したアジド基を還元することにより、アミン体 56a‒d へと導いた。酸性条件下にて 56a‒d の分子内環化を進行させ、目的の 57‒60 を合成した。ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン誘導体 62 は、57 のベンジル位の酸化、続く脱水反応により合成した。. Scheme 7. Reagents and conditions: (a) 1.6 M n-BuLi/hexane, THF; (b) 46a, HATU, Et3N, DMF, or 46b, DEPC, Et3N, DMF; (c) CCl4, PPh3, MeCN or Burgess reagent, THF; (d) (i) NaN 3, DMSO; (ii) PPh3, H2O, THF; (e) AcOH, reflux; (f) NaH, DMF, air, rt, 39%; (g) TsOH·H 2O, toluene, reflux, 94%.. 26.

(28) テトラヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン誘導体 66a‒j は Scheme 8 の通り、57 と同様の方法で合成した。カルボン酸 64e および 64h はエステル 68e および 68h のベンジル位のアルキル化、続く加水分解により調製した。化合物 64g の合成においては、フェニル酢酸誘導体 63g のベンジル位のアルキル化が進行しなかったために、保護体 69 を経由して、所望の 64g へと導いた。モルホリン誘導体 66e はブロミド 67 を原料とするカップリング反応により合成した。. Scheme 8. Reagents and conditions: (a) n-BuLi, 1-bromo-3-chloropropane; (b) (i) 46a or 46b, HATU or DEPC; (ii) CCl 4 or CCl3CN, PPh3, (c) (i) NaN3; (ii) PPh3, H2O; (iii) AcOH; (d) (i) NaH, 1-bromo-3-chloropropane,. DMF;. (ii). NaOH,. H2O,. MeOH,. THF;. (e). 1,1-di-tert-butoxytrimethylamine, toluene, 80 oC, 81%; (f) (i) NaH, 1-chloro-3-iodopropane, DMF, rt, 91%; (ii) TFA, rt, 99%; (g) morpholine, DavePhos, Pd2(dba)3, t-BuONa, toluene, 100 oC, 20%.. 27.

(29) 次にテトラヒドロ[1,2,3]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン誘導体の合成を行った（Scheme 9）。ブロミド 4d と 5-ヘキシン-1-オールとの薗頭カップリング反応、続くアルコールの酸化によりアルデヒド 71 へと導いた。アルデヒド 71 と 3,4-ジクロロフェニルマグネシウム＝ブロミドとの反応により 2 級アルコール 72 を得た後に、メシル＝クロリドと反応させて、メシラート 73 へと導いた。73 のアジド化、続く分子内[3+2]環化付加反応をワンポットで行い、テトラヒドロ[1,2,3]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン環を構築し、目的の 74 を合成した。. Scheme 9. Reagents and conditions: (a) 5-hexyn-1-ol, PdCl2(PPh3)2, CuI, Et3N, 70 oC, 83%; (b) Dess–Martin periodinane, MeCN, DMSO, rt, 83%; (c) 3,4-dichlorophenylmagnesium bromide, THF, ‒78 oC, 41%; (d) MsCl, Et3N, THF, 0 oC, 97%; (e) sodium azide, DMSO, 110 oC, 48%.. 28.

(30) Scheme 10 に示したとおり、57 の 8 位に種々の官能基を導入した。塩基性条件下で、57 の 8 位を酸化し、生じたヒドロキシ基のメチル化を行うことで、8-メトキシ誘導体 75 を得た。パラホルムアルデヒドと 57 とを反応させヒドロキシメチル化を行い、生じたヒドロキシ基をトシル化して 76 へと導いた。続いてアジド化、還元を経てアミン 77 を調製した。次に 77 を N-アセチル化することで、アミド 78 を得た。エステル 79a の α 位にエトキシカルボニル基を導入後、アクリロニトリルとの Michael 反応を行い、ニトリル 81a へと導いた。次にワンポットでの 81a のシアノ基の還元、分子内環化反応によりラクタム 82a を合成した後に、Lawesson 試薬によりチオラクタム 83a を調製した。83a をヨウ化メチルにより活性化した後に、ヒドラジド 46a との環化反応を行うことで、5,6,7,8-テトラヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン骨格を合成し 84a へと導いた。最後に 84a のエトキシカルボニル基をメチルマグネシウム=ブロミドにより 2-ヒドロキシプロパン-2-イル基へと変換し 85 を得た。ジフルオロ誘導体 86 も同様に合成した。. Scheme 10. Reagents and conditions: (a) NaH, air, then NaH, MeI, DMF, 31%; (b) (i) NaH, paraformaldehyde, DMF, 13%; (ii) TsCl, Py, 69%; (c) (i) NaN3, DMSO; (ii) PPh3, H2O, THF, 49% 29.

(31) (2 steps); (d) AcCl, Et3N, THF, 72%; (e) NaH, diethyl carbonate, THF, 90‒100%; (f) NaOEt, acrylonitrile, t-BuOH; (g) H2, Raney cobalt, NH3, EtOH, 41‒73%; (h) Lawesson's reagent, toluene, 79‒90%; (i) MeI, MeCN, then 46a, EtOH, 59‒68%; (j) MeMgBr, THF, 36‒41%.. ベンジル誘導体 90‒95 およびフェノキシ誘導体 100‒102 の合成を Scheme 11 に示した。テトラフルオロほう酸トリメチルオキソニウムによりラクタム 87 を活性化した後に、ヒドラジド 46a との環化反応を行い、二環性化合物 88 へと導いた。続いてベンジル＝ブロミドにより、88 の 8 位をアルキル化して 89 を調製後、メチルマグネシウムブロミドとの反応により、3 級アルコール 90 へと導いた。また副生成物としてケトン 91 を得た。続いて、エステル 89 の LAH による還元で 1 級アルコール 92、ホルムアミドとの反応によりカルボキサミド 93 をそれぞれ合成した。また、89 の加水分解、続く 2,2,2-トリフルオロエチルアミンとの縮合により 2 級アミド 94、続く N-メチル化により 3 級アミド 95 を調製した。エステル 88 を N-クロロスクシンイミドで処理することで α 位がクロロ化された 96 を得た。3 級クロリド 96 に対するフェノール類の求核置換反応によりフェノキシ体 97‒99 を調製後、メチルマグネシウムブロミドで処理することにより 2-ヒドロキシプロパン-2-イル誘導体 100‒102 を合成した。. 30.

(32) Scheme 11. Reagents and conditions: (a) (i) Me3OBF4, MeCN; (ii) 46a, MeCN, 38% (2 steps); (b) NaH, 3,4-difluorobenzyl bromide, DMF, 87%; (c) MeMgBr, THF, 48% for 90, 8% for 91; (d) LAH, THF, 73%; (e) HCONH2, NaOMe, MeOH, DMF, 85%; (f) (i) 1. M. NaOH aq., MeOH, THF; (ii). 2,2,2-trifluoroethylamine, HATU, Et 3N, DMF, 31% (2 steps); (g) MeI, NaH, DMF, 25%; (h) NCS, NaH, DMF, 69%; (i) various phenols, K2CO3, DMF, 43‒62%; (j) MeMgBr, THF, 58‒66%.. 31.

(33) Scheme 12 にスピロ誘導体の合成ルートを示す。エステル 88 に対して 2-ニトロベンジル基を導入して 103 へと導いた。フェニル誘導体 104 は 88 と 1-フルオロ-2-ニトロベンゼンとの反応により合成した。それぞれニトロ基を還元して、分子内環化反応を行い 108 および 109 を得た。環状アミド部分を 2,2,2-トリフルオロエチル＝トリフラートを用いてアルキル化し、目的の 113 および 114 を合成した。エステル 88 の 8 位を塩基性条件下で酸化して、生じたヒドロキシ基と 2-ニトロベンジル＝ブロミドとを反応させることでベンジルオキシ誘導体 105 へと導いた。105 からニトロ基の還元およびエトキシカルボニル基の加水分解によりアミノ酸誘導体を合成した後に、HATU による分子内環化反応を行い、ベンゾオキサゼピン誘導体 110 を調製した。続いて、N-トリフルオロエチル化を行い、目的の 115 を得た。類縁体の 116 および 117 も同様の方法で合成した。また、エステル 88 の 8 位のヒドロキシメチル化、2-ベンジルオキシアニリンとの縮合により 119 を調製後、ベンジル基の脱保護、続く光延反応によりベンゾオキサゼピン誘導体 120 を得た。最後に 120 の N-トリフルオロエチル化を行い、121 へと導いた。. Scheme 12. Reagents and conditions: (a) NaH, 2-nitrobenzyl bromide, DMF for 103, 60%; NaH, 1-fluoro-2-nitrobenzene, DMF for 104, 46%; NaH, air, DMF, then NaH, 2-nitrobenzyl bromide analogs for 105‒107, 35‒64%; (b) (i) H2, Pd/C, MeOH, EtOH; (ii) EtOH for 108, 43% (2 steps); Fe, AcOH for 109, 39%; (i) H2, PtO2, MeOH; (ii) NaOH aq., THF; (iii) HATU, Et3N, DMF for 110, 57% (3 steps); (i) NH2NH2·H2O, FeCl3·6H2O, activated charcoal, THE, MeOH; (ii) NaOH aq., THF, MeOH; (iii) HATU, Et3N, DMF for 111 and 112, 45‒69%; (c) 2,2,2-trifluoroethyl triflate, NaH or Cs2CO3, DMF, 40‒73%; (d) NaH, paraformaldehyde, DMF, then H2O; (e) 2-benzyloxyaniline, HATU, DMF, 55% (2 steps); (f) (i) H 2, Pd/C, MeOH, THF; (ii) PPh3, DEAD, THF, then P(n-Bu)3, ADDP; (g) 2,2,2-trifluoroethyl triflate, NaH, DMF, 22% (3 steps).. 32.

(34) 3-4 生物活性と考察第二章と同様に、合成した化合物はラット初代培養神経細胞を用いて Aβ42 低下作用を測定した。IC50 値を活性の指標とし、化合物の脂溶性は、実測値の log D (pH 7.4)50 を用い、 LLE は pIC50 － log D (pH 7.4)で示した。また in vitro の代謝安定性はマウスの肝ミクロソームを用いた代謝安定性試験で測定した。 1,2,4-トリアゾール誘導体 42 をシード化合物として、末端ベンゼン環の活性コンフォメーションの固定化による活性の向上を試みた。42 のトリゾール環とベンジル位を環化させた二環性の 50 および 57 の活性は、いずれも向上した。しかしながら 50 は、シード化合物 42 と同様の LLE を示すに留まり、50 における脂溶性の増加のみが、Aβ42 低下作用を増強させたと考えられる。一方で、化合物 57 においては、顕著に LLE が向上しており、42 の活性コンフォメーションが効果的に固定化されたと考えられる。化合物 57 の 1,2,4-トリアゾール環を 1,2,3-トリアゾール環に置換した 74 は、57 と同等の活性を示したが、増加した脂溶性により LLE が低下する結果となった。また、環拡大した 58 において LLE は低下し、環縮小した 59 においても活性および LLE が低下した。さらにテトラヒドロピリジン環内に二重結合を導入した 62 においても、活性および LLE が低下した。これらの結果から、二環構造の環のサイズ、および末端フェニル基のコンフォメーションが γ-セクレターゼ調節薬としての活性に大きく影響し、57 のコンフォメーションが Aβ42 低下作用にとって最適であると考えられる。また、57 と同様のコンフォメーションを持つトリアゾロオキサジン誘導体 60 において活性および LLE が低下したことについては、トリアゾロオキサジン環内の酸素原子の極性がその原因として推察される。以上の構造活性相関研究により、中央骨格として、57 におけるテトラヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン環を選択し、更なる最適化を行った。. 33.

(35) Table 6 Aβ42-lowering effects of 42, 50, 57‒60, 62, 74, their log D values and their LLE. Compound. a. Aβ42 IC50a (nM). log Db. LLEc. 42. 2000. 4.1. 1.6. 50. 860. 4.4. 1.7. 57. 210. 3.2. 3.5. 74. 210. 4.2. 2.5. 58. 220. 3.5. 3.2. 59. 630. 3.3. 2.9. 62. 600. 3.6. 2.6. 60. 530. 3.1. 3.2. IC50 values are means of triplicate measurements. b log D at pH 7.4. c LLE = pIC50 ‒ log D. 34.

(36) 次に末端フェニル基上の置換基に関する構造活性相関研究を行った。化合物 57 の末端フェニル基 3 位のクロロ基を取り除いた 66a においては、Aβ42 低下作用はわずかに減弱したものの、LLE は維持した。4-CF3 誘導体 66b は 66a と同様の活性および LLE を示した。また、脂溶性の低下した 4-F 誘導体は、活性は低下したものの、66a と同様の LLE を示した。極性基を導入した際にも同様の傾向が示され、4 位にメトキシ基（66d）やモルホリノ基（66e）を持つ化合物においても、LLE は維持された。また、66f（3-CF3）や 66g（2-CF3）が 66b とほぼ同等の活性、LLE を示したことから、置換位置も LLE に与える影響は少ないことが示唆された。これらの一置換誘導体の活性と脂溶性との間には強い相関が認められ（Figure 13）、一連のテトラヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン誘導体においては、末端フェニル基の脂溶性が、ほぼ直接的に Aβ42 低下作用を支配していることが明らかとなった。したがって、更なる活性の向上を指向し、二置換誘導体を調製したところ、期待通り 66h‒j において大幅な活性向上が認められた。特に、最も脂溶性の高い 66j は極めて強い Aβ42 低下作用を示した。 Table 7 Aβ42-lowering effects of 66a‒j, their log D values and their LLE. a. Aβ42 IC50a. log Db. LLEc. 570. 2.8. 3.4. 4-CF3. 510. 2.9. 3.4. 66c. 4-F. 1500. 2.4. 3.4. 66d. 4-OMe. 1900. 2.4. 3.3. 66e. 4-morpholine. 2300. 2.3. 3.3. 66f. 3-CF3. 370. 2.8. 3.6. 66g. 2-CF3. 380. 3.0. 3.4. 66h. 3-CF3, 4-Cl. 220. 3.2. 3.5. 66i. 2-CF3, 5-CF3. 300. 3.3. 3.2. 66j. 2-CF3, 4-Cl. 84. 3.5. 3.6. Compound. R. 66a. 4-Cl. 66b. (nM). IC50 values are means of triplicate measurements. b log D at pH 7.4. c LLE = pIC50 ‒ log D. 35.

(37) Figure 13. Plot of pIC50 against log D for 42, 50, 57 and 66a‒j.. 次に、興味深いことに 62 の合成中間体であるアルコール 61 が、中程度の Aβ42 低下作用および無置換体 57 と同等の LLE を示すことに注目した。この結果は、テトラヒドロ[1,2,4] トリアゾロ[4,3-a]ピリジンの 8 位への極性基の導入が許容されること及びそれにより LLE の向上が期待されることを示している。そこで、この位置への極性基の導入を検討した。 8 位に種々の極性基を導入した化合物群の構造活性相関を Table 8 に示す。61 を O-メチル化したメトキシ誘導体はわずかに活性向上に寄与したものの、脂溶性が増加しており、LLE が低下した。また 8 位へのアミノメチル基（77）やアセトアミドメチル基（78）の導入においても、LLE は向上しなかった。一方で 2-ヒドロキシプロパン-2-イル誘導体 85 は、57 と比較して 8 倍の活性向上を示し、同時に大幅な LLE の向上を達成した。末端ベンゼン環の置換基を 3,4-ジフルオロ基へと変換した 86 も高い LLE を維持し、この傾向は Table 7 と同様であった。さらに、母核であるテトラヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン環と末端ベンゼン環との間にメチレンリンカーを挿入したところ、活性および LLE が大幅に向上した（90）。この結果は、8 位の極性基だけではなく、末端ベンゼン環の位置も LLE に大きく影響することを示している。しかしながら、ベンジル誘導体 90 はマウス肝ミクロソームに対して、低い代謝安定性（93 μL/min/mg）を示した。そこで次に、酸化代謝部位と考えられる 2-ヒドロキシプロパン-2-イル基、およびベンジル位の置換を行い、代謝安定性の改善を目指した（Figure 14）。 36.

(38) Table 8 Aβ42-lowering effects, log D values, and LLE values of 57, 61, 75, 77, 78, 85, 86 and 90. Compound. 1. R. 2. Aβ42 IC50a. R. log Db. LLEc. (nM). a. 57. H. 240. 3.2. 3.5. 61. OH. 290. 2.9. 3.6. 75. OMe. 120. 3.7. 3.2. 77. 280. 3.1. 3.5. 78. 300. 3.2. 3.3. 85. 35. 3.7. 3.8. 86. 160. 2.9. 3.9. 90. 48. 3.0. 4.3. IC50 values are means of triplicate measurements. b Measured at pH 7.4. c LLE = pIC50 ‒ log D.. 37.

(39) Figure 14. Approaches to improve metabolic stability of 90.. まずは、2-ヒドロキシプロパン-2-イル基の置換を行い、LLE および代謝安定性に対する構造活性相関を取得した（Table 9）。90 からのジェミナルジメチル基の除去（92）、および 2-ヒドロキシプロパン-2-イル基からアセチル基への置換（91）を行ったが、いずれにおいても代謝安定性は改善されなかった。一方で、カルボキサミド 93 においては、大幅に代謝安定性が向上した。93 は LLE のわずかな低下を示したが、N-トリフルオロエチル誘導体 94 は、良好な代謝安定性を維持したまま、93 と比較して高い活性、LLE を示した。94 のアミド基の N-メチル化は、さらに LLE を向上させたが、代謝安定性が大幅に低下する結果となった。従って、化合物 94 を in vivo 試験への精査化合物として選出した。. 38.

(40) Table 9. Aβ42-lowering effects, log D values, LLE values, and in vitro metabolic clearance of 91‒95 in mouse liver microsomes. Aβ42 IC50a Compound. R. log D. b. LLE. (nM). a. c. MLMd (μL/min/mg). 92. 250. 2.5. 4.1. 144. 91. 290. 2.6. 3.9. 148. 93. 870. 2.3. 3.8. 22. 94. 75. 3.0. 4.1. 3. 95. 50. 2.9. 4.4. 101. IC50 values are means of triplicate measurements. b Measured at pH 7.4. c LLE = pIC50 ‒ log D. d In. vitro metabolic clearance in mice liver microsomes.. 39.

(41) 次に、Table 9 に示す通り、90 のベンジル位の置換を行い、LLE および代謝安定性に対する構造活性相関を取得した。90 において酸化代謝部位と考えられるベンジル位を酸素原子で置き換えたところ、代謝安定性が大幅に改善し、LLE も維持することがわかった（100）。末端ベンゼン環置換基の脂溶性を増加させた 101 および 102 においては、期待通り、高い LLE を維持したまま Aβ42 低下作用が増強した。また、高い代謝安定性も維持されたため、 101 および 102 を in vivo 試験への精査化合物として選出した。. Table 9 Aβ42-lowering effects, log D values, LLE values, and in vitro metabolic clearance of 100‒102 in mouse liver microsomes. Aβ42 IC50a Compound. R. log D. b. LLE. (nM). a. c. MLMd (μL/min/mg). 100. 88. 2.8. 4.3. ‒1. 101. 38. 3.2. 4.2. ‒7. 102. 41. 3.2. 4.2. ‒3. IC50 values are means of triplicate measurements. b Measured at pH 7.4. c LLE = pIC50 ‒ log D. d In. vitro metabolic clearance in mice liver microsomes.. 40.

(42) 次に、更なる LLE の向上のために、高い LLE を示したアミド 95 をリード化合物として、 Figure 15 に示す様に、95 の 8 位のジェミナルな置換基であるベンジル基とアミド基とを結合させ、活性コンフォメーションの固定化を指向したスピロ化合物をデザインした。また、このデザインにおいては、酸化代謝を受けやすいアミド基上のメチル基の除去、および中枢神経系薬剤としては望ましくないとされる 95 のフレキシビリティーの低減も同時に指向している 51 。. Figure 15. Design of spiro compounds from N-trifluoroethyl amide analog 95.. スピロ誘導体の構造活性相関を Table 11 に示した。期待通り 6 員環スピロ誘導体 113 は高い LLE および良好な代謝安定性を示した。LLE に関して更に適切なコンフォメーションを探索する目的で、113 のスピロ環サイズの調整を行った。その結果、5 員環誘導体 114 において、LLE は低下したものの、ベンゾオキサゼピン誘導体 115 は非常に高い LLE を示した。しかしながら 115 の代謝安定性は低下しており、ベンジル位の酸化代謝が示唆された。そこで、代謝部位をブロックするために、115 のオキサゼピン環の酸素原子をシフトさせた 121 を合成した。121 の LLE は低下したものの、予想通り代謝安定性は大きく改善した。これらの結果は、想定通り 115 のベンジル位が酸化代謝されていることを示している。したがって、115 のベンジル位への酸化代謝酵素のアプローチを妨げるために、嵩高い置換基を 115 のベンゾオキサゼピン環 6 位に導入した。しかしながら、クロロ誘導体 116 およびトリフルオロメチル誘導体 117 において、代謝安定性は改善しなかった。これらスピロ誘導体の構造活性相関から、高い LLE を維持したまま、代謝安定性を改善することは困難であると判断し、強い Aβ42 低下作用および極めて高い LLE を示した 116 と 117 を in vivo 試験への精査化合物として選出した。. 41.

(43) Table 11 Aβ42-lowering effects, log D values, LLE values, and in vitro metabolic clearance of 113‒117 and 121 in mouse liver microsomes. Aβ42 IC50a Compound. R. log D. b. LLE. (nM). a. c. MLMd (μL/min/mg). 113. 240. 2.4. 4.2. 29. 114. 520. 2.2. 4. ‒ 10. 115. 140. 2.2. 4.6. 62. 121. 420. 2.5. 3.9. 11. 116. 30. 2.8. 4.8. 107. 117. 31. 2.9. 4.6. 83. IC50 values are means of triplicate measurements. b Measured at pH 7.4. c LLE = pIC50 ‒ log D. d In. vitro metabolic clearance in mice liver microsomes.. 42.

(44) 続いて野生型マウス（C57BL/6J）を用い、in vivo における Aβ42 低下作用の評価を行った (Table 12) 。In vitro 試験において中程度の Aβ42 低下作用を示した N-トリフルオロエチルアミド誘導体 94 は 30 mg/kg、その他の精査化合物は、代謝安定性を指標に、2-ヒドロキシプロパン-2-イル誘導体 101 と 102 は 10 mg/kg、スピロ誘導体 116 と 117 は 30 mg/kg でそれぞれ経口投与し、投与後 3 時間後の脳内および血漿中の Aβ42 を測定した。その結果、94 以外の化合物は、脳内および血漿中の Aβ42 低下作用を示し、特に 101 および 102 は強力な in vivo 活性を示した。この結果には 101 および 102 の極めて良好な代謝安定性が寄与していると考えられる。. Table 12 In vivo Aβ42-lowering effects in C57BL/6J mice. a. brain Aβ42 (%)a. plasma Aβ42 (%)a. 94 (30 mg/kg). 96. 80. 101 (10 mg/kg). 71. 42. 102 (10 mg/kg). 66. 35. 116 (30 mg/kg). 77. 49. 117 (30 mg/kg). 75. 39. Expressed as % vehicle at 3 h after p.o. administration, n = 4‒6.. 最終的に、最も強力な脳内 Aβ42 低下作用を示した 102 を更なる精査化合物として選出し、光学活性体の調製を行った 52 。その結果、立体配置は活性に大きく影響し、in vitro 試験において、 (R)-102 は (S)-102 の 460 倍以上の Aβ42 低下作用を示した（Table 13）。また Neuro2A 細胞を用いた実験において、(R)-102 は Aβ42 および Aβ40 を低下させる一方で、Aβ37 を増加させ、total Aβ 量は変化させなかった 53 。この結果は、(R)-102 が γ-セクレターゼの機能を調節し、APP 切断部位をシフトさせていることを示唆している。さらに、期待通り、(R)-102 は Notch シグナルに対して阻害作用を示さなかった (IC50 >10 μM)53 。. 43.

(45) Table 13 Aβ42-lowering effects, log D values, LLE values, and in vitro metabolic clearance in mouse liver microsomes, and in vivo Aβ42-lowering effects of (R)-102 and (S)-102 in C57BL/6J mice. Aβ42 IC50a Compound. R. b. log D. LLE. (nM). a. (R)-102. 26. 3.2. (S)-102. >10000. 3.2. 4.4. c. MLMd. In vivo Aβ42 (%)e. (μL/min/mg). brain. plasma. -7. 60. 36. -20. N.T.f. N.T.f. IC50 values are means of triplicate measurements. b Measured at pH 7.4. c LLE = pIC50 ‒ log D. d In. vitro metabolic clearance in mice liver microsomes.. e. Expressed as % vehicle at 3 h after p.o.. administration, 6 mg/kg, n = 6. f Not tested.. 更に(R)-102 の薬理作用を確認するために、 (R)-102 をアルツハイマー病モデル動物として、 APP を過剰発現するトランスジェニックマウス（Tg2576 マウス）を用いた連投試験（3, 6 mg/kg/day）に供した。(R)-102 の単回投与後 18 時間後には、(R)- 102 は血中からは検出されないこと、また、連投試験で(R)-102 が脳内および血中に蓄積増加しないことを確認した。 58 日間の連投試験後の解析により、(R)-102 は濃度依存的に脳内に蓄積した不溶性 Aβ42、および可溶性 Aβ42 を有意に低下させた (Figure 16) 。また、Aβ40 に対しても低下作用を示す一方で、total Aβ に対しては影響を示さなかった。さらに、マウスの認知機能を評価する試験として、連投試験の 45 日目に新奇物体認識試験を評価した (Figure 17) 。その結果、(R)-102 投与群において、新奇物体への嗜好性は有意に増加し、認知機能の改善が示唆された。さらに、(R)-102 の連投終了後、7 日間の休薬期間をおき、同様の新奇物体認識試験を行ったところ、認知機能改善効果は維持されていた. 53. 。これらの結果は、(R)-102 の連投投与が、. Tg2576 マウスの脳内への病原性 Aβ の蓄積を低下させて、認知機能の改善に寄与したことを示している。. 44.

(46) Figure 16. Effect of (R)-102 on insoluble Aβ42 (A), soluble Aβ42 (B), soluble Aβ40 (C), and soluble total Aβ (D) in Tg2576 mouse cortex. (R)-102 was administrated for 58 days and at 3 h prior to decapitation, n = 10‒15. The bars represent means±SEM. +++p < 0.001, Aspin-Welch test vs wild-type (WT) mice treated with vehicle. $p < 0.025, Shirley-Williams test vs Tg mice treated with vehicle. #p < 0.025, Williams test vs Tg mice treated with vehicle.. Figure 17. Effect of (R)-102 on novel object recognition test in Tg2576 mouse on the 45th day of 58-day oral administration, n = 10‒15. The bars represent means±SEM. ***p < 0.001, t-test vs WT mice treated with vehicle. $p < 0.025, Shirley-Williams test vs Tg mice treated with vehicle. 45.

(47) 3-5 第三章のまとめ第三章においては、脂溶性の付加によらない新たな γ-セクレターゼ調節薬の活性向上戦略の創出を目的に、LLE を指標とした γ-セクレターゼ調節薬の合成研究を行った。新規 1,2,4トリアゾール誘導体 42 をリード化合物として、活性コンフォメーションの固定化により LLE を向上させたテトラヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン誘導体 57 を見出した。さらに 57 の 8 位への 2-ヒドロキシプロパン-2-イル基の導入、および末端ベンゼン環へのメチレンリンカーの挿入によりさらに LLE を向上させた 90 を見出した。化合物 90 は低い代謝安定性を示したものの、2-ヒドロキシプロパン-2-イル基のトリフルオロエチルアミド基への置換、またはベンジル基のフェノキシ基への置換により、高い LLE を維持したまま、代謝安定性の大幅な改善を達成した。さらに、トリフルオロエチルアミド誘導体から、その活性コンフォメーションの固定化を指向してデザインしたスピロ誘導体が極めて高い LLE を示すことを見出した。本研究で得られた高い LLE を示す化合物群における極性基や脂溶性基の位置およびコンフォメーションの情報は、脂溶性の付加によらない γ-セクレターゼ調節薬の活性向上戦略を考える上で有用な情報となる。また、代表化合物群を in vivo 試験により評価し、強力な脳内 Aβ42 低下作用を示す(R)-102 を見出した。さらにアルツハイマー病モデル動物である Tg2576 マウスへの(R)-102 の連投投与試験を行った。その結果、 (R)-102 投与群において、有意に脳内 Aβ42 の蓄積が減少し、Tg2576 マウスの認知機能が改善した。これらの結果は、γ-セクレターゼ調節薬(R)-102 が、脳内病原性 Aβ の蓄積の減少を介して、アルツハイマー病の根本的な治療薬になり得る可能性を示唆している。. 46.

(48) 第四章総括本博士論文では、アンメットメディカルニーズの非常に高いアルツハイマー病治療薬の創出に貢献するために、脳内の病原性 Aβ を低下させる作用を持つ種々の新規 γ-セクレターゼ調節薬の創薬研究を実施した。. 第二章では、Aβ42 とアルツハイマー病との関わりを検証する上で、十分な Aβ42 選択性、動態および中枢移行性を示す化合物が少ないことから、脳内 Aβ42 を選択的に低下させる経口投与可能な薬理ツールの創出を目的に、新規ピペラジン系 γ-セクレターゼ調節薬のデザインおよび合成を行った。In vitro 試験において Aβ42 を選択的に低下させるシード化合物 1 から、代謝部位の特定および代謝安定性の改善を行うことで、Aβ42 選択的低下作用を維持したまま、in vivo 試験での薬効の増強を図り 32 を見出した。32 は in vitro 試験および in vivo 試験において Aβ40 の低下作用を示さず、Aβ42 を選択的に低下させることから、Aβ42 とアルツハイマー病との関わりを検証する上で有用な薬理ツールになると考えられる。. 第三章では脂溶性の付加によらない新たな γ-セクレターゼ調節薬の活性向上戦略の創出を目的に、LLE を指標とした 5,6,7,8-テトラヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン誘導体の合成研究を行った。LLE の向上を指向し、活性コンフォメーションの固定化や、極性基、脂溶性基の至適な位置への配置を行った結果、極めて LLE の高いフェノキシ誘導体(R)-102 およびスピロ誘導体 116 の創出に成功した。これらの化合物における極性基や脂溶性基の位置およびコンフォメーションの情報は、脂溶性の付加によらない γ-セクレターゼ調節薬の活性向上戦略を策定する上で有用な知見になる。さらに(R)-102 は、連投試験において、アルツハイマー病モデル動物 Tg2576 マウスの脳内 Aβ の蓄積を減少させ、マウスの認知機能を改善させる薬効を示した。これらの結果は、 (R)-102 がアルツハイマー病の根本的な治療薬になり得る可能性を示唆している。. 47.

(49) 実験の部核磁気共鳴スペクトル (1H NMR) は Varian Mercury-300 (300 MHz)、Bruker AVANCE III (300 MHz) または Bruker Advance III plus (400 MHz) を用いて測定した。化学シフトはテトラメチルシランを内部標準として用い、δ 値 (ppm) で示した。多重線は以下の様に示した： s = singlet, d = doublet, t = triplet, q = quartet, quin = quintet, m = multiplet, dd = doublet of doublets, dt = doublet of triplets, td = triplet of doublets, qd = quartet of doublets, brs = broad singlet. 結合定数 (J 値) はヘルツ (Hz) で表記した。LC–MS 分析は、Waters Liquid Chromatography–Mass Spectrometer System (LC–MS) または Shimadzu LC–MS を用い、APCI (+ or −) または ESI (+ or −) のイオン化モードを使用した。融点は Yanaco micro melting point apparatus または Büchi melting point apparatus B-545 を用いて測定し、未補正である。各種アッセイに供した化合物の純度は Shimadzu UFLC (L-column 2 ODS 2 µm 2.1 x 30 mm, gradient method 1 : mobile phase A [10% MeCN / 90% 5 mM AcONH4], mobile phase B [90% MeCN / 10% MeCN]. The ratio of mobile phase B was increased linearly from 5% to 95% over 3 min, 95% over the next 1 min; gradient method 2 : mobile phase A [5 mM AcONH4], mobile phase B [98% MeCN / 2% MeCN]. The ratio of mobile phase B was increased linearly from 14% to 86% over 3 min, 86% over the next 1 min.) または元素分析により測定した。元素分析は武田分析研究所で実施された。クロマトグラフィーによる精製は、Merck Kieselgel 60, 70‒230 mesh or 230‒400 mesh (Merck 社) 、 Chromatorex NH-DM 1020, 100‒200 mesh (富士シリシア社) または Purif-Pack (Si or NH) (モリテックス社) を用いた。市販の試薬、溶媒は精製せず用いた。本論文に記載の実験及び動物飼育条件は武田薬品工業株式会社の実験動物倫理委員会の承認を得た。. (4-Bromo-2-methoxyphenyl)hydrazine (3) NaNO2 (6.1 g, 89 mmol) を水 (8 mL) に溶解させ、4-bromo-2-methoxyaniline (2) (17 g, 85 mmol) と濃塩酸 (150 mL) の混合液に‒20 ºC で加えた。生じた混合液を‒20 ºC で 15 分間撹拌後、0 ºC で 20 分間撹拌した。この反応混合液を SnCl2 (60 g, 320 mmol) と濃塩酸 (200 mL) の混合液に‒20 ºC で加えた。生じた混合液を‒20 ºC で 10 分間撹拌後、室温で 40 分間撹拌した。0 ºC に冷却後、沈殿物をろ取し、冷水およびジエチルエーテルで洗浄した。得た固体を酢酸エチルおよび 10%炭酸カリウム水溶液に溶解させ、不溶物をろ別後、有機層を単離した。水層を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮し 3 (16 g, 90%)を褐色の油状物質として得た。1H NMR (CDCl3) δ: 3.80 (3H, s), 4.36 (3H, brs), 6.81‒6.85 (2H, m), 7.02 (1H, dd, J = 8.1, 1.8 Hz).. 1-(4-Bromo-2-methoxyphenyl)-3-methyl-1H-1,2,4-triazole (4a) Methyl ethanimidothioate hydroiodide (16 g, 75 mmol) を 3 (16 g, 71 mmol) のメタノール (130 mL) 混合液に室温で加えた。生じた混合液を室温で 30 分間撹拌し、減圧濃縮した。残渣と 48.

(50) オルトギ酸トリメチル (50 mL) のトルエン (100 mL) 混合液に、ピリジン (100 mL) を室温で加えた。生じた混合液を 100 ºC で 16 時間撹拌後、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチルおよ炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて、有機層を単離した。水層を酢酸エチルで抽出し、あわせた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル／ヘキサン) で精製し 4a (12 g, 61%) を淡白色の結晶として得た。 1H NMR (CDCl3) δ: 2.49 (3H, s), 3.94 (3H, s), 7.20‒7.24 (2H, m), 7.65 (1H, d, J = 8.4 Hz), 8.61 (1H, s). MS m/z: 268 (M+H)+.. 4-(4-Chloro-2-fluorophenyl)-1-methyl-1H-pyrazole (6) 窒素雰囲気下、Pd(PPh3)4 (0.29 g, 0.25 mmol) を 5 (1.1 g, 5.0 mmol) 、 1-methyl-4-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)-1H-pyrazole (1.0 g, 5.0 mmol) 、2 M 炭酸ナトリム水溶液 (5 mL) 、トルエン (5 mL) およびエタノール (5 mL) の混合液に加えた。生じた混合液を 80 ºC で 12 時間撹拌後、酢酸エチルと飽和食塩水で希釈した。有機層を単離後、水層を酢酸エチルで抽出した。あわせた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル／ヘキサン) で精製し 6 (0.65 g, 62%) を無色の油状物質として得た。 1H NMR (CDCl3) δ: 3.97 (3H, s), 7.13‒7.16 (2H, m), 7.47 (1H, dd, J = 8.7 Hz, 8.1 Hz), 7.75 (1H, d, J = 2.7 Hz), 7.82 (1H, s). MS m/z: 211 (M+H)+.. 4-(4-Chloro-2-methoxyphenyl)-1-methyl-1H-pyrazole (4b) 28%ナトリウムメトキシドメタノール溶液 (1.8 mL) を 6 (0.65 g, 3.1 mmol) の DMF (10 mL) 混合液に加えて、100 ºC で 1 時間撹拌後、酢酸エチルと飽和食塩水で希釈した。有機層を単離後、水層を酢酸エチルで抽出した。あわせた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮し 4b (0.70 g, 100%) を無色の油状物質として得た。 1H NMR (CDCl3) δ: 3.92 (3H, s), 3.95 (3H, s), 6.93‒6.98 (2H, m), 7.43 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.81 (1H, s), 7.83 (1H, s). MS m/z: 223 (M+H)+.. 1-(4-Bromo-2-fluorophenyl)-4-methyl-1H-1,2,3-triazole (8) 4-Bromo-2-fluoroaniline (7) (13 g, 68 mmol) を 0 ºC で α,α-dichloroacetone tosylhydrazone (4.0 g, 14 mmol) のメタノール (25 mL) 混合液に加えて、室温で 2 時間撹拌後、1 時間加熱還流し、減圧濃縮した。残渣にトルエンを加え、不溶物をろ別した。ろ液を 1 M 水酸化ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル／ヘキサン) で精製し 8 (0.50 g, 14%) を褐色の結晶として得た。 1H NMR (CDCl3) δ: 2.47 (3H, s), 7.46‒7.51 (2H, m), 7.82 (1H, d, J = 2.7 Hz), 7.89 (1H, dd, J = 9.0, 8.1 Hz). MS m/z: 256 (M+H)+.. 49.

(51) 1-(4-Bromo-2-methoxyphenyl)-4-methyl-1H-1,2,3-triazole (4c) 4b と同様の合成法で、8 から 9c を 95%の収率で褐色の油状物質として得た。 1H NMR (CDCl3) δ: 2.45 (3H, s), 3.91 (3H, s), 7.22‒7.26 (2H, m), 7.66 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.82 (1H, s). MS m/z: 268 (M+H)+.. 5-(4-Bromo-2-fluorophenyl)-2-methyl-1,3-oxazole (10) トリフルオロ酢酸 (3.7 mL, 42 mmol) を PhI(OAc) 2 (6.7 g, 21 mmol) のアセトニトリル (100 mL) 混合液に加えた。混合液を 30 分間室温で撹拌後、4-bromo-2-fluoroacetophenone (9) (3.0 g, 14 mmol) を加えた。混合液を 2 時間加熱還流した後に、飽和水酸化ナトリウム水溶液で中和し、有機溶媒を減圧下留去した。残渣を酢酸エチルで抽出し、抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル／ヘキサン) で精製し 10 (2.6 g, 75%) を淡黄色の結晶として得た。 1H NMR (CDCl3) δ: 2.54 (3H, s), 7.31‒7.40 (3H, m), 7.52‒7.65 (1H, m). MS m/z: 256 (M+H)+.. 5-(4-Bromo-2-methoxyphenyl)-2-methyl-1,3-oxazole (4d) 4b と同様の合成法で、15 から 4d を 88%の収率で無色の結晶として得た。 1H NMR (CDCl3) δ: 2.52 (3H, s) 3.95 (3H, s), 7.10 (1H, d, J = 1.9 Hz), 7.17 (1H, dd, J = 8.3, 1.9 Hz), 7.39 (1H, s), 7.59 (1H, d, J = 8.3 Hz). MS m/z: 268 (M+H)+.. tert-Butyl 4-[3-methoxy-4-(3-methyl-1H-1,2,4-triazol-1-yl)phenyl]piperazine-1-carboxylate (11a) 窒素雰囲気下、4a (400 mg, 1.5 mmol) 、1-Boc-piperazine (310 mg, 1.6 mmol) 、DavePhos (59 mg, 0.15 mmol) および t-BuONa (220 mg, 2.2 mmol) のトルエン (3 mL) 混合液を 90 ºC で終夜撹拌した。混合液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル／ヘキサン) で精製し 11a (460 mg, 82%) を褐色の結晶として得た。 1H NMR (CDCl3) δ: 1.50 (9H, s), 2.48 (3H, s), 3.15‒3.25 (4H, m), 3.55‒3.66 (4H, m), 3.87 (3H, s), 6.50‒6.61 (2H, m), 7.53 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.43 (1H, s).. tert-Butyl 4-[3-methoxy-4-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)phenyl]piperazine-1-carboxylate (11b) 11a と同様の合成法で、4b から 11b を 64%の収率で淡白色の結晶として得た。 1H NMR (CDCl3) δ: 1.51 (9H, s), 3.17 (4H, t, J = 5.1 Hz), 3.61 (4H, t, J = 5.4 Hz), 3.91 (3H, s), 3.94 (3H, s), 6.54‒6.58 (2H, m), 7.41 (1H, d, J = 8.7 Hz), 7.75 (1H, s), 7.80 (1H, s). MS m/z: 373 (M+H)+.. tert-Butyl 4-[3-methoxy-4-(4-methyl-1H-1,2,3-triazol-1-yl)phenyl]piperazine-1-carboxylate (11c) 50.