リポソームと細胞の相互作用（DDSへの応用）

(1)

リポソームと細胞の相互作用（ DDS への応用）

石田竜弘・際田弘志

^＊

徳島大学大学院ヘルスバイオサイエンス研究部薬物動態学分野〒

770-8505

徳島県徳島市庄町

1-78-1

Interaction of Liposomes with Cell Membrane

Tatsuhiro Ishida and Hiroshi Kiwada

^＊

Department of Pharmacokinetics and Biopharmaceutics, Institute of Health Biosciences, the University of Tokushima 1-78-1, Sho-machi, Tokushima 770-8505, Japan

A number of studies have appeared recently on the underlying mechanism of liposome-cell interactions under in vitro conditions, in which isolated cell populations or cell lines were used. However, our knowledge of how lipo- somes interact with cells, how liposomal physicochemical properties such as size, charge or fluidity, influence the interactions and the parameters that influence this in vivo is limited. We will summarize and discuss the relevant studies on this matter in this review.

Key words : liposome

／

cell

／

interaction

／

drug delivery system (DDS)

はじめに

リポソームは，両親媒性のリン脂質を水系に分散させることで形成される脂質二分子膜の閉鎖小胞

（

Fig. 1

）で，水溶性・脂溶性低分子から核酸やタン

パクなどの機能性高分子までを安定に包埋可能であり，生体内に投与された際にこれら包埋された機能性分子を生体による分解・代謝などから保護するとともに，非特異的な分布を抑制（毒性の軽減）し，

選択的に目的とする組織に送達する（効果の向上）

ことが可能であることから，薬物送達システム

（

drug delivery system; DDS

）のキャリアーとして期待され，既にいくつかの製剤が臨床応用されている

（

Table 1

）．

リポソームは生体膜に極めて性質が類似しているため，細胞－細胞間，ウイルス・細菌－細胞間などの相互作用を理解する目的でも利用されてきた．特にリポソームと細胞間の相互作用は，生体内投与後

の動態，目的部位に集積後の薬物の放出，標的細胞内への移行に影響を与える．したがって，これらの検討から得られた知見は，

DDS

キャリアーとしてリポソームを利用する際においても，非常に重要である．

リポソームと細胞間の相互作用メカニズムを整理すると以下の

3

種類に大別できる（

Fig. 2

）．

① リポソームの細胞表面への吸着および結合

② エンドサイトーシスあるいはファゴサイトーシスによるリポソームの細胞内への取り込み

③ リポソーム膜と細胞膜との融合

これらのうちどの様式をとるかは，細胞の種類やリポソームの物理化学的性質（表面電荷，サイズ，

膜流動性，表面修飾の有無など）によって異なる．

また，これらの様式は細胞の種類，培養細胞を用いる際には培地中の血清の有無によっても大きく影響を受ける．さらに，生体内での相互作用においては，

ここに挙げた様式のいくつかが並行して起こっている場合が多く，実験的にそのメカニズムを解明する際には特に注意が必要であることを強調したい．例えば一つの様式を阻害して実験を行った場合，その阻害によってそれまで目立たなかった様式が台頭し，

●特集ものづくりプラットフォームとしての脂質膜

＊Corresponding Author

Tel : 088-633-7259 Fax : 088-633-9506 E-mail : [email protected]

(2)

理解に苦しむ結果が得られる場合がある．また，前述した

3

種の様式以外のメカニズムも存在する可能性もあり，検討が困難となる場合もある．

リポソームを

DDS

キャリアーとして用いる際には，細胞との相互作用が前述のいずれの様式であれ，

リポソームはその内容物を細胞内に送達することができる．しかし，内封物の細胞内動態は，相互作用の様式に応じて異なることから，細胞に何らかの物質を作用させたい場合には，研究者はその目的と物質の物理化学的性質や作用点に応じて主要な相互作用様式を選択すべきである．

1.

リポソームの物理化学的性質による吸着・結合を利用した

DDS

リポソームの細胞膜への吸着・結合は，リポソームの物理化学的な性質が重要な要因となる．

一般に，生理的

pH

条件下では，細胞表面は糖タンパクやリン脂質のリン酸基が存在しているため負に

荷電している．したがって，正に荷電したリポソーム（カチオニック・リポソーム）のほうが，負や中性に荷電したリポソームよりも細胞に結合しやすいことが知られている^{1, 2）}．また，吸着においては，リポソーム膜の流動性も重要な要因であり，生理的な温度（

37

℃）で高い膜流動性を持つリポソームのほうが，低い膜流動性のものよりも一般に高い結合量を示すことが知られている．

さらに，リポソームの物理化学的性質のみならず，

細胞自体の性質も重要な要因となる．

Harigai

ら^3）は，

TRX-20

（

3,5-dipentadecy- loxybenzamindine hydrochloride

）を含有した新規カチオニック・リポソーム（

TRX-20 liposome

）を調製し，このリポソームと種々の血管内皮下層細胞（ヒト大動脈内皮細胞（

E C s

），ヒト血管平滑筋

（

SMCs

），ヒト糸球体間質細胞（

MCs

），ヒト糸球体毛細血管上皮細胞（

GMVECs

））との相互作用に関して検討を行った．その結果，

TRX-20 liposome

は，

ECs

および

GMVECs

よりもむしろ

SMCs

および

MCs

Table 1 Clinically approved liposomal formulations

(3)

に高い親和性を有することが示された．このようなリポソーム結合性の違いが導かれた明確な理由は分かっていないが，

TRX-20 liposome

の高い結合性が観察された細胞を事前に

chondroitinase

で処理したところ，

TRX-20 liposome

の結合が阻害されたことから，

細胞表面あるいは細胞外マトリクスに存在するある種のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンが重要な役割を果たしている可能性が高いことが示されている．

DDS

キャリアーとしてリポソームを捉えた場合，

細胞による取り込みを伴わない単純な吸着・結合のみが生じたとすると，リポソームはその封入物質の物理化学的性質に応じて，大まかに分けて以下の

2

つの様式でその内封物を細胞に移行させると考えられる（

Fig. 2

①）．

比較的脂溶性の高い低分子物質である薬物や

pro- drug

は，吸着・結合に伴ってリポソームが細胞膜と接触した際に，リポソーム膜から細胞膜に移行し，

次いで細胞質に移行するものと考えられる．この過程にそった物質移行の効率や速度は，対象となる低分子物質の物理化学的な性質に依存する．

一方，水溶性の高い物質の場合，リポソームから細胞内へ移行するためには少なくとも

2

回（リポソー

ム膜，細胞膜）脂質膜を透過する必要があるため，

それほど効率よく送達されるとは考えにくい．このため，このような物質を送達させるためには，後述のエンドサイトーシスや膜融合を利用した相互作用

様式（

Fig. 2

，②③）を選択したほうが有利である．

しかし，水溶性の高い物質であっても，低分子物質の場合，リポソームが細胞と接触した際のわずかなタイミングでリポソームから漏出し，細胞内に移行する場合があることが報告されている．正確なメカニズムは現時点では明らかではないが，リポソームと細胞が接触した際に生ずる脂質膜のゆらぎによって物質のリポソームからの漏出と細胞内への移行が促進されているものと考えられる．このような様式は広義には③の膜融合に類似したものであるとも考えられるが，リポソーム膜が細胞膜に吸収されることはなく，接触後細胞から離れるため，①の吸着および結合に分類した．

2.

膜分子（受容体・抗原など）とリガンドとの相互作用を利用した

DDS

リポソームを細胞に積極的に結合させようとする試みは以前から行われてきた．特に生体成分である Fig. 1 Structure of various type of liposomes.

Fig. 2 Type of liposome-cell interactions.

(4)

トランスフェリンや葉酸，モノクローナル抗体やペプチド，糖脂質などをリガンドとしてリポソーム表面に提示し，リポソームに細胞特異的な結合性を付与しようとする試みは，

in vitro

のみならず

in vivo

においても高い効果を示すことが報告されている^{4, 5）}．リガンド結合型リポソームの製品化には，生産性，

安全性，安定性，スケールアップ，さらには臨床試験における高度な知識とノウハウが要求される．しかし，その優れた効果はリポソームの新たな臨床応用に道を開くものであると期待されている^6）．

リガンド修飾リポソームによるアクティブターゲティングでは，癌細胞に高発現する膜分子（受容体・抗原など（

Table 1

））に対するリガンドを利用した手法が古くから試みられている．抗体やタンパク

をリガンドとした試みがほとんどであるが，高い腫瘍集積性や優れた治療効果が報告されてきた^{7, 8）}．近年では，癌細胞自身ではなく，癌の新生血管に標的化したリガンド修飾リポソームも注目されている⁹^～^12）．

抗がん剤は，増殖性の細胞を傷害することから，

増殖性を持つ新生血管の内皮細胞にも効果的に作用する．抗がん剤によって新生血管内皮細胞が破壊されれば，癌細胞の生存に必須な栄養素や酸素が送達されなくなり，結果癌細胞にアポトーシスが誘導され間接的な腫瘍組織の退縮が生じるものと期待される．腫瘍の種類によって新生血管の密度は異なるものの，一般に内皮細胞は癌細胞の数パーセントしか存在していないと言われている．さらに，癌細胞に Fig. 3 Targeting of liposome by surface-modification with ligands that bind specifically to over-expressed antigens or receptors

on tumor cells and/or angiogenic endothelial cells.

Table 2 Internalizing receptors or epitopes suitable for targeted drug delivery systems

(5)

標的化したリポソームが，血管内皮細胞の隟間を通過した後，癌細胞の細胞間隟を拡散してより多くの癌細胞と相互作用しなければ高い薬理効果を得ることができないのに対して，血流に面した血管内皮細胞を標的としたリポソームは，到達性という観点からも有利であると考えられる（

Fig. 3

）．したがって，

抗がん剤の標的細胞を癌細胞から血管内皮細胞にシフトした方が高い治療効果が得られるものと期待されている．ファージディスプレイペプチドライブラリー法によりクローニングされた新生血管に親和性を持つペプチドで修飾した標的化抗がん剤封入リポソームを用いた検討において，高い抗腫瘍効果が得られることが報告されている^{9, 11}^～^14）．また，抗がん剤に耐性を持つ癌細胞移植モデルでも高い抗腫瘍効果が得られており^11），新生血管標的化リポソームが確かに血管内皮細胞に送達され，新生血管に障害が与えられたことが確かめられてもいる．

3.

エンドサイトーシス

細胞に吸着したリポソームは，細胞の食作用により細胞内に取り込まれる．リポソームが係わる食作用はその形態からエンドサイトーシスあるいはファゴサイトーシスと呼ばれており，大まかには粒子径

が

200 nm

以下のリポソームがエンドサイトーシスに

より，それ以上の粒子径を持つリポソームがファゴサイトーシスにより取り込まれている¹⁵^～^17）．

Fig. 2

②に示すように，細胞膜の陥没によって生ず

るエンドソームに包まれた状態で細胞内に移行したリポソームは，細胞質内を移動しやがてライソゾームと融合する．この過程でエンドソームは

H

⁺ポンプを作動させ，内部

pH

を徐々に低下させる^{18, 19）}．このような低

pH

環境は，ライソゾームと融合した後，

種々のライソゾーム酵素によってエンドソーム内容物を分解させるために大変都合がよい．ライソゾームに達したリポソームは，種々のホスファターゼにより加水分解を受け，この際膜構造が消失することにより，その内容物がライソゾーム内に放出される．

放出された内容物は，ライソゾーム膜を透過し，細胞質内に放出されると考えられている．したがって，

この経路で送達される物質は総じて低

pH

環境にもライソゾーム酵素による分解にも安定なものでなければならない．一方，エンドソーム内で加水分解されたリン脂質やリポソーム構成成分としてよく用いられるコレステロールは，一部は細胞外に放出されたり，一部は細胞膜の構成成分として細胞に再利用されたりすると考えられる．

DDS

においては，リポソーム内部に目的物質を封

入させるか，もしくはリポソーム膜表面に吸着させ，

細胞のエンドサイトーシスを利用して細胞内に送達させるアプローチが汎用されている．個々の細胞の表面には，栄養素の取り込みなどにかかわる様々な受容体が提示されている（

Table 1

）．特に癌細胞では，

その旺盛な増殖を維持するために，これらの受容体が高発現している場合が多い（

Table 1

）．例えば，肝臓の実質細胞にはインスリンや

LDL

の受容体が，また，癌細胞にはトランスフェリンと呼ばれる

Fe

³⁺を含有するタンパク質や，グルコースの受容体が高密度で提示されているとされている．これらの細胞は，

こういった受容体を効果的に利用することにより，

必要な養分を効率的に細胞内に取り込んでいる

（

receptor-mediated endocytosis

）．リポソーム表面にこれらの分子を提示させることにより，リポソームがエンドサイトーシスによって特定の細胞に取り込まれる確率を高めようとするアプローチも行われている^6）．

上述のように，エンドサイトーシスで細胞内に取り込まれても，内封物がエンドソームから細胞質に移行することが重要である．エンドソームはやがてライソゾームと融合し，その内容物はライソゾーム酵素によって分解される．また，エンドソームもその内部の

pH

が徐々に低下するため，先にも述べた通り

pH

変化に弱い物質は活性の低下を示す可能性がある．したがって，できるだけ速やかにエンドソームから脱出し，細胞質に移行させることが重要である．

このような問題を解決するために，例えばエンドソーム内の

pH

が低下することを利用し，中性付近では安定であるが，

pH5

程度になると膜構造が不安定化して，内封した物質を放出できるようなリポソーム

（

pH

感受性リポソーム）も開発されている²⁰^～^22）．また，膜融合性を有するペプチドや合成高分子などをリポソーム表面に提示することにより，細胞質への移行効率を高めようとする試みも行われている^{23, 24）}．

上記のリポソームに関しては中性脂質を用いる場合が多いが，遺伝子導入に関しては，負電荷を帯びている

DNA

と相互作用可能なように正電荷を帯びた脂質を主な基剤とするカチオニック・リポソームが多く用いられている．実際，研究用遺伝子導入剤としてリポフェクトアミン

2000

といった商品名で市販されてもいる．

DNA

がリポソームと複合体を形成することにより，

DNA

がコンパクト（コンデンス）化され，エンドサイトーシスにより細胞内に効率的に取り込まれることが想定されている^{25, 26）}．しかし，

この方法ではエンドソームやライソゾーム内で

DNA

の分解が生じてしまう可能性が極めて高い．そこで

(6)

複製不能のアデノウイルスを用いるカチオニック・

リポソームにさらに結合させ，このウイルスの被覆蛋白の働きでエンドソーム膜を破壊することによって

DNA

の分解を防ぎつつ，細胞質内へ

DNA

を放出させる方法が開発されている^27）．さらに，アデノウイルスに代わってインフルエンザウイルスの

HA

蛋白の内融合ペプチドと考えられる約

20

個のペプチドを結合させたトランスフェリン修飾カチオニック・リポソームによりエンドソーム内での融合を利用して

DNA

を効率よく細胞室内に導入することに成功している^28）．

4.

リポソーム膜と細胞膜との融合

リポソーム膜と細胞膜との融合は，お互いの膜を構成している脂質同士が完全に混合されることによって生ずると考えられている．このような脂質の混合を効率良く生じさせるためには，ウイルスのそれを模した

fusion protein

や

fusion peptide

などでリポソーム表面を修飾することが行われている．

Schreier

ら^29）は，リポソームにウイルス膜蛋白を再構成させた

Virosome

を開発している．

Virosome

はウイルスの細胞内移行能をリポソームにそのまま移築したものであり，

in vitro

での遺伝子導入に用いられている．

また，水口ら^30）は，センダイウイルスの膜融合蛋白をリポソーム膜に融合させることによって，細胞膜との融合が可能なリポソームを開発している．しかし，一般的なリポソームでは，直接細胞膜と融合する資質を持つものは無いと考えられている．

先にも述べたとおり，細胞表面は負に荷電している．したがって，正に荷電しているカチオニック・

リポソームは，負や中性のリポソームよりも細胞表面に結合しやすい^{1, 2）}．さらに，これらのリポソームには正電荷脂質に加え

dioleoyl phosphatidylethanole- amine

（

DOPE

）などの膜融合能を持つリン脂質が適量組み込まれているものが多い．このようなカチオニック・リポソームは，細胞膜に静電気的なエネルギーを利用して吸着した後，細胞膜と融合し，細胞内に直接封入物を送達しているものと考えられる³¹^～^33）（

Fig. 2

③）．しかしながら，カチオニック・

リポソームにおいても，前述のとおり，細胞に結合後エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ，

DOPE

などの膜融合にともないライソゾームに到達する以前に内封物を細胞質に放出しているとする報告も見られる^{25, 26）}．このような一見矛盾する報告が散在している背景には，【はじめに】で述べたように，

エンドサイトーシスと膜融合が並行して生じている可能性が高いにもかかわらず，実験結果をどちらか

一方が生じていると解釈しようとしたことが考えられる．細胞とリポソームとの相互作用は，用いる細胞の性質によっても，用いるリポソームの物理化学的な性質によっても，大きく影響を受ける．したがって，リポソームを用いて何らかの物質を細胞内に送達させようとする場合，その相互作用の様式を研究者自身で個々に把握し，最適化する必要があるだろう．

まとめ

以上，本稿では，リポソームと細胞の相互作用に関して，

DDS

への応用という観点から概説した．薬物をはじめとした生理活性物質の効果を最大限発揮させるためには，キャリアーはその目的とする組織や細胞「近傍」まで「荷物」を送達するだけでなく，

宅配便のごとく生理活性物質をその作用部位に的確に送達する必要がある．作用部位は多様であり，細胞膜上の受容体であったり，細胞内オルガネラであったり，核であったりする．リポソーム膜と生体膜の相互作用は，このようなデリバリーにおける「第一の関門」であり，搭載する「荷物」に応じたキャリアーの「デザイン」が必要となる．細胞の異物貪食機構においてもカベオラ経路やマクロパイノサイトーシスなど新たな機構が報告されており，さらには核酸とリポソームの複合体がある種の

Toll-like

receptor

を刺激することが報告されたりもしている．

膜と膜の相互作用に関する研究は，今後もキャリアーを用いた

DDS

開発において，重要な位置を占めるものと考える．

文　　献

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著者略歴

石田　竜弘（いしだ　たつひろ）

1993年3月徳島大学薬学部薬学科卒業

1995年3月徳島大学大学院薬学研究科薬品科学専攻博士前期課程修了

1995年4月～1998年3月　日本学術振興会特別研究員（DC1） 1998年3月徳島大学大学院薬学研

究科薬品科学専攻博士後期課程修了

1998年4月～2000年3月　カナダ・アルバータ州立大学医・

歯学部，薬理学部門，

博士研究員

2000年4月徳島大学薬学部　講師 2003年7月徳島大学薬学部　助教授 2004年4月徳島大学大学院ヘルスバイオサイエンス研究部　助教授（改組）

際田　弘志（きわだ　ひろし）

1971年6月東京大学薬学部製薬化学科卒業

1973年3月東京大学大学院薬学系研究科修士課程修了 1973年4月三菱化成工業株式会社

入社 1975年3月同上退社

1978年3月東京大学大学院薬学系研究科博士課程修了 1978年4月東京理科大学薬学部

助手

1980年4月～1981年3月　米国UCSF 留学

1983年7月～1983年9月　米国UCSF 留学

1986年5月徳島大学薬学部　助教授 1989年2月徳島大学薬学部　教授 2003年1月～2005年1月　徳島大学薬

学部部長

33) Almofti MR, Harashima H, Shinohara Y, Almofti A, Baba Y, Kiwada H : Arch. Biochem. Biophys., , 246-253 (2003)

34) 菊池寛: ファルマシア, , 337-342 (2006) (Received 13 October 2006 ;

Accepted 16 October 2006)