納豆製造過程における成分変化 (第2報) : 水溶性タンパク質について

(1)

昭和60年11月(1985年) 一27-一

研究報告

納豆製造過程における成分変化(第2報)

水溶性タンパク質について一

池田ひろ*,津野貞子**

The Componential Changes During the Manufacturing

Process of Natto (Part 2)

—On the Water Soluble Proteins—

Hiro Ikeda, Sadako Tsuno

1緒言納豆は蒸煮大豆に比べ消化性に優れ栄養価値の高い食品である。納豆に使用する大豆には中粒と小粒があり,一般には小粒大豆を使用した納豆が好まれているが,その理由は明らかではない。そこで,大豆の形態の違いが発酵過程中の成分の変化や製品の出来上り時聞などに影響を与えるのではないかと考え,粉末大豆で納豆を製造し,短時間で栄養価値の高い食品として利用出来るかどうかを知るため前報1)において旨味,香り,栄養的価値に関連の深いアミノ態窒素,アンモニァ態窒素,糖,ビタミンBz の各成分について丸大豆使用納豆との比較検討を行った。その結果,形態の違いが納豆菌の繁殖に影響を与え,丸大豆より表面積の大きい粉末大豆においては短時間で納豆化が行われるという結論を得た。また,納豆菌が生産する加水分解酵素のうち最も納豆の発酵過程に関与する酵素はタンパク質分解酵素であり,この酵素によってタンパク質はペプチドやアミノ酸にまで分解され2・9)納豆の旨味や消化性に影響を与えていると云われている。そこで今回はこのタンパク質分解酵素による発酵中の水溶性タンパク質の水解過程を,形態の異なる丸大豆および粉末大豆使用納豆についてゲルロ過および電気泳動により比較検討を行ったのでその結果を報告する。 II 実験方法 *京都女子大学食物学科調理学第1研究室 **日本生活医学研究所 1.試料の調製納豆菌:宮城野納豆製造所(仙台市)で純粋培養されたBacillus nattoを使用した。原料:丸大豆はアメリカ産のものを使用し,粉末大豆はそれを一196。Cで瞬間凍結粉砕したものを使用した。納豆の製造:前報D同様に行い発酵0から20時間まで2時間ごとにとり出し,これを試料とした。 2実験方法各試料を乳鉢で充分すりつぶしたのち一定量を秤取し,約6倍の4M尿素を含む0.1MNaClに懸濁し 1時間室温で撹伴抽出を行い,8,000×gで20分間遠心分離後その清澄液をとり,これをさらに56,000×9 で1時間遠心分離し,この清澄液を水溶性タンパク質抽出液とした。 1)Sephadexによるゲルロ過 Sephadex G-50を水によく分散させ24時間室温に懸濁放置して完全に膨潤させたのち4M尿素を含む 0.1MNaC1溶液で3回洗浄したものを直径1.5cm,

(2)

食物学会誌・第

4

0

号

-

28-1

)

S

e

p

h

a

d

e

x

によるゲノレロ過

S

e

p

h

a

d

e

x

G-50

による水溶性タンパク質のクロマトグラムを図

1

および図

2

に示した。吸光度

280nm

の測定では，生大立，蒸煮大豆については丸大豆，粉末大豆ともに

KAV0

，

0 .

8

および1.

0

付近に

3

つのピークがみられ，発酵

6

時間では

KAVO

のピークが減少し

KAV 0

.

6

の位置に新しいピークが現われ，

KAV 0

.

8

のピークは増加する。発酵後

1

0

時聞になると丸大豆では

KAVO

のピークはわずかとなり

0 .

7

付近に新しいピークが現われ，

KAV 0

.

8

および1.

0

のピークは増加する。発酵

2

0

時間では

280nm

の吸収のほとんどが

KAVO

.

9

および1.

0

のピークの位置に観察される。

Lowry

法によるタンパク質の測定では，生大豆では

KA

V

O

.

8

および1.

0

の位置にはごくわずかしか検出されず，また蒸煮大豆においても

KA

V0

.

8

および1.

0

の位置のタンパク質量は少ない。とのことより生大豆，蒸煮大豆における

0 .

8

および1.

0

のピークは紫外部吸収をもっ低分子のペプチドやアミノ酸であると推察される。ゲJレロ過でみるかぎり丸大豆と粉末大豆の違いは明確でなく，両者ともに発酵時間の経過とともに高分子のタンパク質は納立菌により加水分解され

K

A

VO

.

8

付近のタンパク質量は増加する。発酵

2

0

時聞になると

KAVO

.

8

のピークのタンパク質量は減少するが

280nm

の吸収はほとんど変化しないととろから，さらに分解されて低分子のペプチドやアミノ酸にまで分解が進んだものと推察される。 2) ディスク電気泳動

8M

尿素を含む159彰ポリアクリjレアミドゲル電気泳動による結果を図

3

および図

4

に示した。図

3

にみられるように生大豆，蒸煮大豆，発酵2時間および4時間後の丸大豆および粉末大豆ともにゲノレの上部に 6本の鮮明なバンドを示し，その他数本の不鮮明なバンドがみられる。生大豆ではゲ、ノレの上端部および中央部に特に濃い鮮明なバンドが 2本認められるが蒸煮大豆ではとのバンドは消失する。これは高分子のタンパク質が加熱iとより水解または変性凝固したためと考えられる。蒸煮大豆と発酵 2時間および 4時間後の試料では大きな変化は認められないが発酵6時聞になると急速に水解が進み泳動バンドは中央より先端部に移動し，

4 "

"

'

-

'

5

本の成分が認められる。粉末大豆は発酵 6時間後にかなり低分子化した泳動ノインドを与え，丸大豆よりも加水分解速度が速い乙とを示している。図

4

の発酵

1

0 "

"

'

-

'

2

0

時間の各泳動図にみられるように発酵時間の経過とともにバンドの数は減少し，粉末大豆では

1

4

時間で先

結果と考察

I

一言、 ¥ 切ミ ) ど一﹂川 T t 馬断畑、ソヘ入、11111

S

e

p

h

a

d

e

x

G-50

による水溶性タンパク質のゲjレロ過 18 ρ h u i

1

2 o

24 生大立 K

_A

_V

1.8 1.2 1.0

0 .

8 。

ρ りハ U 0.4

0 .

2

1.6 1.4 日ロ { ) 父町一ヨパ﹁︿ V E l l -図

1

長さ

45cm

のカラムに均一に流し込み，

4M

尿素を含む

0 .

1M NaCl

溶液で充分平衡化を行ったのち生大豆，蒸煮大豆，発酵

6

，

1

0

，

2

0

時間の各抽出液についてゲルロ過を行った。まず，抽出液

0.2ml

をカラムに吸着させ，

4M

尿素を含む

0 .

1M NaCl

で溶出

(

1 0m

l

j

h

r

)

し，フラクションコレクターで1.5

ml

ずつ秤取して分画を行い，各画分の

280nm

の吸光度を測定した。あわせて

Lowry

法

l

とよりタンパク質の定量を行い，各ピーク曲線の総面積からこれらピークのタンパク質が全体に占める割合を算出した。らのトリスー 2) ディスク電気泳動ポリアクリルアミドゲル電気泳動は

D

a

v

i

s

10 ) 方法

l

とより

8M

尿素を含む

1

5

9

6

ゲ、jレを用い，グリシン緩衝液中で行った。 3) 分子量の測定分子量の測定は

Web

e

r

， Os

b

o

r

n

10)らの

SDS

ポリアクリルアミドゲ、ル電気泳動法に従い，

0 .

1

9

6 SDS

を含む

1

2 .

5

9

6

ゲノレを用い

O.lM

リン酸塩緩衝液

(

0 .

1

形

SDS

を含む，

pH

7 .

2 )

中で行った。

SDS

測定用には各抽出液の最終濃度が

1

9 6SDS

，

1

9

6

2 -

メjレカプトエタノーノレ，

O.OlM

リン酸塩緩衝液

(pH 7

.

0 )

になるように調製したのち

6

0

C3

0

分間還元させたものを使用した。

(3)

~ 29-昭和60年11月(1985年)

1

りふんI，i.

h

大 I，i. ;W 2"1 12 吉野叫 ) 逗刊一一将官、ご入以 11111 21 12

。

、

副 1.0

j

o

内f20l1

:

S

I111 0.1 0.2

。

j

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内初11、'i:1111 0.4 0.2 36 21 12 !1~主主、 K1J. 21 12 21

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I

伴GII.'i:1111

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ロ ( ) 話以一一副ぎ一

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l

24 12

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自民 1.0

j

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内ねり11

:

，

i

'

1111 0.81

-。

0 .

5

KAV

0 .

5

KAV 3) 分子量の推定

SDS

ポリアクリルアミドゲ、ル電気泳動による標準タンパク質の分子量と泳動速度の関係を図

5

に示した口この関係に基づいて泳動距離を分子量に変換し，発酵過程における分子量の経時的変化を示すデンシトメトリーによるパターン(図

6

および図

7 )

を作成した。図

6 '

とみられるように生大豆では分子量分布は100，000"'-' 10，000の広範囲にわたっており，分子量 100，000近く

S

e

p

h

a

d

e

x

G-50

による水溶性タンパク質のゲソレロ過る。端部に1本の鮮明なバンドの他にいくつかの不鮮明なバンドがみられるが，発酵20時間では先端部の 1本のみとなる口丸大豆ではバンドの消失は徐々に進行し，発酵20時間で中央部と先端部に 2本のバンドがみられる。図

2

この結果より，プロテアーゼによって粉末大豆では約

1

4

時間でタンパク質の大部分が低分子のペプチドやアミノ酸にまで分解されるが，丸大豆が同程度まで分解されるためには発酵20時間が必要であると推察され

(4)

n u 円ο

'

1 :

大

-

U

_大以;I:<._r，.

1

i{酔 211寺1111 九大豆粉末大IA

l

' e t U H -品川上手 j l J 今 F

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4 A

1

i{時 Glhf'

l

1 l

図

3

製造過程中の水溶性タンパク質の変化 (8M尿素 1596ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動) 食物学会誌・第40号泥酔 811年IIIJ

(5)

昭和60年11月(1985年) - 31-九大豆粉末大tJ. 発酔

?

C

骨子発酵発酵発両手発酵 1011年!日

l

1211.'i=1I11 1411キ￨間 1611年1111 1811キ1111 2011年1111 図

4

製造過程中の水溶性タンパク質の変化 (8M尿素 15%ポリアクリノレアミドゲルによる電気泳動)

(6)

食物学会誌・第40号 - 32 -+ 一一lホスホリラーゼP (MW:9A

x

1(1₎ 4

一

-2 アルブミン (MW:G.7

x

1(1 ) 骨一一・1オボアルブミン (MW >1.3:

x

1(1 )

骨

一

lカーボニックアンヒド、ラーゼ (MW::3.0XI01₎ ..---5トリプシンインヒビター (MW:2.01 X 1(1₎ 埠一一Gα ラクトアルブミン (MW: 1.44 X 1(1₎ 4.7 4.0 4.G 4.5 4.3 4.2 4

.

4

.

1

( 切。︻ ) 耐廿， -'-、，-'" 1.0 0.9 0.8 0.7 に υ ハ υ 0.5 0.2 0.1

。

村

I

~.J 移動

l

i

SDS

ポリアクリルアミドゲ、ル電気泳動による標準タンパク質の移動度ノfク質の熱変牲が著しいためと考えられる。しかし発酵6時間になると急速にプロテアーゼによる加水分解が進み，分子量40，000以上のものは減少し 30，000...__， 15，000のものが増加するD 発酵8...__，12時間では徐々に加水分解が進み分子量30，000のポリペプチドは減少し 20，000前後のものが増加する。発酵14時間になるとほとんどが20，000...._._，10，000の聞に分布し，丸大豆の20時間発酵のものとほぼ同程度の分布状態であった。その後も徐々に分解は進み，分子量20，000近くのポリペプチドはさらに減少し， 10，000に近いものが増加する。丸大豆，粉末大豆ともに発酵過程中にみられる分子量20，000...__，10， 000のポリペプチドの増加は高分子のタンパク質の減少度より小さいが，これはこれらのタンパク質のほとんどがさらに低分子のペプチドやアミノ酸にまで分解されたためと考えられる。そこで

S

e

p

h

a

d

e

x G-10

を用い

6M

塩酸グアニジ図

5

に大きなピークがある。蒸煮大豆では加熱lとより水解されて分子量100，000近くのタンパク質は減少し， 60， 000...__，40， 000のタンパク質が増加する。発酵 2時間および 4時間では蒸煮大豆に比べ著しい差はみられないが，発酵6時間になると分子量40，000以上のものは著しく減少して30，000...__，18，000の範囲に多く分布し，発酵4時間まで存在していた分子量15，000""'__'10，000のものは減少している。これらのタンパク質は納豆菌のフ。ロテアーゼによって色素と結合できない程度に低分子化されたものと考えられる。その後発酵8...__，20時間では時間経過に伴って徐々に分子量30，000前後のものが減少し， 20， 000...__，10， 000のポリペプチドが増加する。図7に示すように粉末大豆は丸大豆とほぼ同様な傾向を示すが，蒸煮大豆の分子量100，000近くのタンパク質の減少は丸大立ほど顕著ではない。これは粉末大豆の方が表面積が大きいため加熱の影響が大きくタン

(7)

- 33-昭和60年11

月(1

985年) 発酵 14時間生大医発酵6時間発酵 16時間発酵8時間来系:大 'J. 出制町一主宰発酵18時間発酵10時間発酵 211，~:mj 発酵20時!日j 発酵 12時間発酵 41時間噌 ( ︺同 × 一 [ 噌 ( ) ︻ × N 噌 ( ︺同 × 噌噌()-[×。噌 ( ) 同 × ∞ 畦 { ) 同 × 。 -[ 噌 ( ) 円 × 円噌 { ) 同 × N 守 ( } ︻ × 噌噌 { ) 同 × 。噌 ( ) ︻ × ∞ 噌 ( ) 同 × 。同日 ( } 円 × 戸千()同× N ザ()-[×噌噌 ( ) 同 × 匂申 ( ) 同 × ∞ 申 ( ) 同 × 。同量図

6

SDSポリアクリルアミドゲノレ電気泳動によるデンシトメトリー図〈丸大豆) 波長:AEx 553 nm;スリット:

o

.

2X3mm;モード:透過リニアスキャンニング法; スキャンニング速度:50mm/min;チャート速度:50mm/min 1 1 分

(8)

食物学会誌・第40号 - 34ー発酵14時

n

I

J

発酵6時間生大豆発酵16時間発酵8時間蒸煮大豆出鰐友田特発酵1811王子!日j 発酵10時間

l

発酵2時間発酵201時間発酵 12時!日

i

発酵411寺陪j 守 ( ) -× 円申 ( ) -× N 申{)-×噌噌 ( ) 同 × 。守 ( ) 同 × ∞ 噌 ( ) ︻ × 。一 [ 守 { ) H × 円守 ( ) 円 × N -マ ( ) 円 × 噌噌 ( } 同 × 。司Y ( ) ︻ × ∞ 守 ( ) 同 × 。 -[ 守 ( ) ︻ × 円司 ( ) 同 × N 司Y ( ) ︻ × 市噌 ( ) 同 × 。申 ( ) 同 × ∞ 噌 ( ) ︻ × 。︻量図

7 SDS

ポリアクリJレアミドゲノレ電気泳動によるデンシトメトリー図(粉末大立) 波長:λEx553nm;スリット :0.2X3mm; モード:透過リニアスキャンニング法;スキャンニング速度:50mmjmin; チャート速度: 50mmjmin 子分

(9)

昭和60年11

月(1

985年) - 35ー 4.0 3.8 3.6 1 :ミオグロビン (MW:17，201)

[

。

切 2 :ミオグロビン I十II(MW:14，632) ~." :~ :ミオグロビン 1(MW:8，235) -、『 .‘んごヘ、 3.4 1 :ミオグロビン II(MW:6，383) 5:ミオグロビンIII(MW:2 ，556) (i:ミオグロビン 1-}11(MW: 1，695) 3.2 3.0

。

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 K<¥v 図

8

Sephadex G-lO による 6M塩酸グアニジン存在下でのポリペプチドの標準曲線ンを溶媒とし，生大豆および丸大豆の蒸煮大豆，発酵 6時間， 20時間の各抽出液を塩酸グアニジン 6 Mおよび2-メJレカプトエタノール1労の濃度になるよう調製したのち 600

C

，30分間で還元させた溶液についてゲルロ過を行い，ポリペプチドの標準曲線により分子量の測定を行い，その結果を図

8

および図

9

に示した。図

9

にみられるように生大立では分子量 17，000(1)， 8， 100(2~ 5，300(3)の 3つのピークが溶出されるが，蒸煮大豆では加熱によってピーク(1)のタンパク質およびピーク (2)のペプチドが減少するがピーク (3)が増加し，新たに分子量 4，200のピーク (4)が溶出される。発酵 6 時聞になるとプロテアーゼによってタンパク質やペプチドは水解されて，さらに(1)のピークは減少し代りに (2)および(3)のピークが増加し，分子量 3，600のピーク (5)が新たに溶出される。発酵20時聞になると著しく水解が進み， (1)(2)のピークは減少し， (3)のピークは著しく減少， (5)のピークは著しく増加し，新たに分子量3，100(6)， 3，000 (7)， 2，300 (8)， 1，600 (9)のピークが溶出される。この結果lとみられるように発酵20時間になると大部分のタンパク質が分子量 4，000以下のペプチドにまで分解されているととが裏付けられる。以上の結果より大豆中の水溶性タンパク質の発酵中のフ。ロテアーゼによる水解は発酵 4時間以後急速に進み，納豆になると一部のタンパク質は残存するが大部分のものは分子量20，000---10，000のポリペプチドおよび低分子のペプチドやアミノ酸にまで水解される。ま

(10)

食物学会誌・第

4

0

号

円。円。

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5

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5

1.0 図

9 S

e

p

h

a

d

e

x

G-10

による

6M

塩酸グアニジン存在下でのゲ、jレロ過分子量:

1 :

1.

7 X

1

0

4_;

₂

_:

₈

_.

₁

_X

₁

₀

_3;

₃

_:

₅

_.

₃

_X

₁

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₄

_:

₄

_.

₂

_X

₁

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₅

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₃

_.

₆

_X

₁

₀

3 _;

6 :

3.1X10

3; 7:

3 .

OX10

3;

8 :

2 .

3X10

3; 9:1.

6X10

3

0 .

6

0.4 0.2 1.0

0 .

8

0 .

6

0.4 0.2 方が各成分の変化が速く，今回の水溶性タンパク質の水解過程と一致した。さらに今後旨味と関係するアミノ酸組成の変化についての検討が必要である。納豆製造過程中の水溶性タンパク質の水解過程をゲ Jレロ過法，ポリアクリノレアミド電気泳動法を用いて明らかにし，また大豆の形態の違いがタンパク質の水解過程にどのような影響を与えるかを知るため丸大豆と粉末大豆を使用して検討を行った結果は次のとうりである。 (1)

S

e

p

h

a

d

e

x

G-50

によるゲルロ過では発酵時間の経過とともにKAVOに溶出されたタンパク質の大部分約要

I

V

た分子量推定やディスク電気泳動により丸大豆の発酵

2

0

時間のものと粉末大豆の発酵

1

4

時間のものの水解程度はほぼ同じであると考えられる。前報においてもほとんどの成分は発酵4時間までの変化は少く，またエネルギー源である糖を添加して納豆製造を行った場合にも粘質物の生成は発酵 4時間までほとんどおこらないと乙ろから，納豆菌の発芽や増殖のためには温度

4

0

_C

，湿度

8

0

形で最低

4

時間が必要であると推察される。また前報でのアミノ態窒素，アンモニア態窒素， pH，ビタミン B2，糖の各成分の増減は丸大豆の発酵

2

0

時間と粉末大豆の発酵

1

4

時間の植がほぼ等しく，形態の違いにより丸大豆より表面積の大きい粉末大豆の

(11)

昭和60年11月(1985年) は水解され， KAVO.8付近に溶出されたタンパク質が増加する。また一部のタンパク質は 280nmの紫外部吸収をもっ低分子のペプチドやアミノ酸にまで分解された。しかしゲルロ過では丸大豆と粉末大豆の違いを明らかにする乙とは出来なかった。 (2) 蒸煮大豆，発酵2および4時間の水溶性タンパク質は分子量100，000'"'-'10，000の広い範囲に分布し，発酵6時間では40，000'"'-'10，000の範囲に分布する。発酵時間の経過とともに分子量40，000近くのものは減少し， 20，000'"'-'10，000の範囲のポリペプチドが増加した。また丸大豆の発酵20時間と粉末大豆の発酵14時間のポリペプチドの分子量分布はほぼ同じであった。以上の結果より，大立の形態の違いが納豆菌の繁殖に影響を与え，表面積の大きい粉末大豆においてフ。ロテアーゼ、の活性も盛んとなってタンパク質の水解が速くすすみ，発酵14時間で納豆になることが明らかとなっfこ。終りに試料大豆を御提供いただいた大阪ガス株式会社に深く感謝致します。 - 37ー

参考文献

1)池田ひろ，津野貞子:本誌， 39， 19， (1984) 2)渡辺篤二，中山修:農芸化学会誌， 36， 890， (1962) 3)越山育則，福島男児:栄養と食糧， 23， 297， (1971) 4)大塚一止，武恒子:新潟大学教育学部紀要， 18， 37

，

(1966) 5)斎尾恭子，若林昭，渡辺篤二:農芸化学会誌， 42， 2， 90， (1968) 6)浅野三夫，宮本義広，大久保一良，紫崎一雄:日本食品工誌， 21， 262， (1974) 7)伊藤清技:栄養と食糧， 23， 196， (1971) 8)平宏和，姥名春枝，杉村敬一郎，桜井芳人:栄養と食糧， 11， 351， (1958) 9)平春枝，平宏和，桜井芳人:栄養と食糧， 17， 219

，

(1964) 10)電気泳動学会編:電気泳動実験法，文光堂(1978)

納豆製造過程における成分変化 (第2報) : 水溶性タンパク質について

研 究 報 告