植物性ポリフェノールの消化酵素に対する阻害作用

成 膜 大 学 理 工 学 研 究 報 告 J,Fac,Sci,Tech.,Sei/keiUniv. Vol.48No.2(2011)pp.1-8

植 物 性 ポ リ フ ェ ノ ー ル の 消 化 酵 素 に 対 す る 阻 害 作 用

鈴木

敦 士*1,山 本

幸弘*2,原

節 子*3

Inhibition

Effects

of Plant Polyphenols

on Digestive

Enzymes

Atsushi

SUZUKI

* 1, Yukihiro

YAMAMOTO

* 2 Setsuko

HARA

* 3

ABSTRACT

: The inhibitory effects of polyphenols contained in plants extracts such as a rooibos tea

extract (RTE) and a green tea extract (G1'E) on digestive enzymes such as porcine pancreatic lipase and

a -amylase were investigated in the present work, since those polyphenols are expected to have various

physiological activities. In addition, quercetin (Qu) and rutin (Ru) which are main constituents of RIE,

and epigalocatechingallate

(EGCG) and epigalocatechin (EGC) which are main constituents of G 1'E were

evaluated to clarify the relation between the inhibitory effect and the structure of polyphenols. As results,

it was found that G'1'E showed strong inhibitory effect for the lipase, and RIE gave the effect for amylase.

The correlation between the chemical structures of plant polyphenols and inhibitory effects for the lipase

and a-amylase was suggested.

Keywords

: polyphenol,

plant extract.

lipase, amylase, inhibitory

effect

(ReceivedSeptemberl5,2011)

1.は じ め に ポ リ フ ェ ノ ー ル は 分 子 内 に 複 数 の フ ェ ノ ー ル 性 水 酸 基 を 有 す る 化 合 物 の 総 称 で あ り,分 子 内 に あ る 水 酸 基 の 数 や 立 体 的 な 位 置 関 係 が 異 な る 多 種 類 が 天 然 に 存 在 し,酸 化 防 止1)2),動 脈 硬 化 予 防3),が ん 予 防4)5),血 圧 上 昇 抑 制6〕,抗 菌 ゐ∼9),消 臭10)ll)お よ び タ ン パ ク 質 機 能 調 節 作 用12)な ど の 様 々 な 機 能 ・作 用 を 示 す こ と が 報 告 さ れ て い る 。 ポ リ フ ェ ノ ー ル は コ ー ヒ ー 酸,ク ロ ロ ゲ ン 酸 な ど の フ ェ ノ ー一一ル 酸,ケ ル セ チ ン(Qu)や エ ピ カ テ キ ン な ど の フ ラ ボ ノ イ ド,レ ス ベ ラ トロ ー ル に 代 表 さ れ る ス チ ル ベ ン お よ び リ グ ナ ン に 分 類 さ れ る 。 ま た,植 物 中 で は こ れ ら の 化 合 物 が 重 合 し た 高 分 子 タ ン ニ ン と し て も 存 在 し,こ れ ら は プ ロ ア ン トシ ア ニ ジ ン な ど の 縮 合 型 タ ン ニ ン と ガ ロ タ ン ニ ン や エ ラ グ タ ン ニ ン な ど の 加 水 分 解 型 タ ン ニ ン に 分 類 さ れ る 。 こ れ ら の 中 で,機 能 性 研 究 が 最 も 進 ん で い る の は ジ フ ェ ニ ル プ ロ パ ン(C6-C3-C6)構 造 を も ち,野 菜 *1:理 工 学 研 究 科 物 質 生 命 コ ー一一ス 修 ± 課 程 修 了 生 *2:理 工 学 部 助 教 *3:理 工 学 部 教 授(shara@st _{.seieki.acjp)} や 果 物 に 広 く含 ま れ る フ ラ ボ ノ イ ドで あ る 。 植 物 中 で は 種 々 の 単 糖 や 多 糖 が β一グ リ コ シ ド結 合 し た 配 糖 体 と し て 多 く 存 在 し,ま た,C3部 分 の 構 造 の 違 い に よ り フ ラ ボ ン,フ ラ ボ ノ ー ル,フ ラ バ ノ ー ル,フ ラバ ノ ノ ー ル,ア ン トシ ア ニ ジ ン,イ ソ フ ラ ボ ン な ど の 多 様 な 化 合 物 群 が 存 在 す る。 本 研 究 で は ポ リ フ ェ ノ ー ル の タ ンパ ク質 機 能 調 節 作 用 に 着 目 し,肥 満 や 糖 尿 病 な ど の 生 活 習 慣 病 の 対 策 に ポ リ フ ェ ノ ー ル を利 用 す る た め の 基 礎 的 検 討 と し て,各 消 化 酵 素 に 対 す る 阻 害 作 用 をinvitro系 で 評 価 し た 。 な お,消 化 酵 素 と し て は これ ら の 活 性 を 阻 害 す る こ と に よ っ て 抗 肥 満 作 用 や 高 血 糖 抑 制 作 用 が 期 待 され る た め,脂 質 と糖 質 に そ れ ぞ れ 作 用 す る リ パ ー一一ゼ[EC3.1.1.3]と α 一ア ミ ラ ー一一ゼ[EC3 _{.2.1.1]を用 い た 。 こ れ ま で ポ リ フ ェ ノ ー一一ル に よ} る 消 化 酵 素 の 阻 害 機 構 に つ い て は 明 確 に な っ て い な い が, ポ リ フ ェ ノ ー ル が 様 々 な 酵 素 タ ン パ ク 質 と 結 合 す る こ と で 阻 害 作 用 を 示 す こ と が 示 唆 され て い る13)。本 研 究 で は Quお よ びQuに ル チ ノ ー一一ス が 結 合 し た 配 糖 体 で あ る ル チ ン の よ うな フ ラ ボ ノ ー ル を 主 要 成 分 と す る ル イ ボ ス テ ィ ー一一抽 出 物(RrE)と _{,(一)エ ピ ガ ロ カ テ キ ン ガ レ ー一一ト} (EGCG)や(一)エ ピ ガ ロ カ テ キ ン(EGC)の よ う な フ ラ バ ノ

一一一ル を 主 要 成 分 と す る 緑 茶 抽 出 物(GTE)を ポ リ フ ェ ノ ー ル 化 合 物 と し て 用 い,こ れ ら の リパ ー ゼ と α一ア ミ ラ ー ゼ に 対 す る 阻 害 作 用 に つ い て ポ リ フ ェ ノ ー ル 構 造 と の 関 連 性 を 含 め てinvimo系 に お い て 検 討 し た 。 2.実 験 2.1試 料 と 試 薬 ポ リ フ ェ ノ ー ル を 含 む 植 物 抽 出 物 と し てRTE,GTEの 2種,標 準 物 質 と し てRTEに 含 ま れ る 主 要 な ポ リ フ ェ ノ ー一一ル で あ るQuとRu(東 京 化 成 工 業 製)_{,GTEに 含 ま れ る} EGCGとEGC(SigmaAldrich社 製),比 較 の た め に プ ロ ピ ル ガ レー一一ト(PG)と 没 食 子 酸(GA)(東 京 化 成 工 業 製)を 使 用 した 。RTE,GTEの ポ リ フ ェ ノ ー ル 含 有 率 を フ ォ ー リ ン ・チ オ カ ル ト法 に よ っ て 測 定 し た 結 果,RTEはQu換 算 で28.4%,GTEはEGCG換 算 で58.3%で あ っ た 。ま た, 酵 素 と し てSigmaAldrich社 か ら 購 入 した 豚 す い 臓 リパ ー一一 ゼ(135,000u/g)と 豚 す い 臓 α一ア ミ ラ ー一一ゼ(27,000u/g) を 使 用 し た 。 な お,こ れ ら の 酵 素 の 活 性 を 測 定 す る た め の 基 質 と し て,リ パ ー ゼ に 対 し て は 精 製 キ ャ ノ ー ラ 油(シ リカ ゲ ル カ ラ ム 分 画 に よ っ て 予 め トコ フ ェ ロ ー ル を 除 去) お よ び α一ア ミ ラ ー ゼ で は 生 化 学 用 溶 性 デ ン プ ン(和 光 純 薬 工 業 製)を そ れ ぞ れ 使 用 し た 。 そ の 他 の 試 薬 類 は 全 て 市 販 の 特 級 ま た は1級 の も の を そ の ま ま 使 用 した 。 2.2ポ リ フ ェ ノ ー ル 化 合 物 の 定 量 植 物 抽 出 物 に 含 ま れ る ポ リ フ ェ ノ ー ル 化 合 物 の 定 量 に は 下 記 の フ ォ ー リ ン ・チ オ カ ル ト法 を 用 い た 。す な わ ち, 50mg/Lの 植 物 抽 出 物 水 溶 液lmLに2倍 希 釈 の フ ェ ノ ー ル 試 薬lmL,10%炭 酸 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液5mLを 加 え,lh, 30℃ で 静 置 し た 後,760㎜ で 吸 光 度 測 定 した 。 抽 出 物 中 の ポ リ フ ェ ノ ー ル 含 有 量 は あ ら か じ め 作 成 し た 検 量 線 を 用 い,RTEに 対 し て はQu換 算 量,GTEに 対 し て はEGCG 換 算 量 と し て ポ リ フ ェ ノ ー ル 量 を 求 め た 。 2.3豚 す い 臓 リ パ ー ゼ に 対 す る 活 性 阻 害 作 用 の 測 定 2.3.1ポ リ フ ェ ノ ー ル 添 加 量 と 共 存 時 間 の 検 討 豚 す い 臓 リパ ー一一ゼ0.177gに,RTE,GTEを 酵 素 量 に 対 し て0∼50wt%量 に な る よ う に イ オ ン 交 換 水lmLに 溶 か し て 加 え,37℃,8001pmで10min∼3h撹 拝 し た 。 撹 拝 後 の 酵 素 溶 液 の 活 性 を 下 記 の よ う に 測 定 し,RTEお よ び GTEの 酵 素 に 対 す る 阻 害 作 用 を 測 定 し た 。 す な わ ち,酵 素 溶 液 に 反 応 基 質 と し て 精 製 キ ャ ノ ー ラ 油2gとO.2mol/L ト リス 塩 酸 緩 衝 液(pH=7.7)lmLを 加 え37℃,800rpmで 加 水 分 解 反 応(5,15h)を 行 っ た 。 反 応 終 了 後,ク ロ ロ ホ ル ム:メ タ ノ ー ル(1:2)溶 液 を20mL加 え,20min, 3500rpmの 遠 心 分 離 し て 得 ら れ た 下 層 を 無 水 硫 酸 ナ ト リ ウ ム で 脱 水,脱 溶 媒 し て 脂 質 区 分 を 回 収 し,酸 価(AV)を 測 定 し た 。AVか ら算 出 し た 加 水 分 解 率 か ら リ パ ー-tiの 比 活 性(ポ リ フ ェ ノ ー ル を 添 加 し た 系 の 加 水 分 解 率)/(酵 素 の み を 添 加 し た 系 の 加 水 分 解 率)を 算 出 し,ポ リ フ ェ ノ ー ル の リ パ ー ゼ に 対 す る活 性 阻 害 作 用 を 調 べ た 。 な お,算 出 し た 比 活 性 が1よ り低 い ほ ど ポ リ フ ェ ノ ー一一ル 化 合 物 の リ パ ー ゼ に 対 す る 阻 害 作 用 が 強 い こ と を 示 す 。 2.3.2各 種 ポ リ フ ェ ノ ー ル の 活 性 阻 害 作 用 の 比 較 2.3.1に 示 し た 活 性 阻 害 作 用 の 測 定 実 験 に お い て,RTE お よ びGTEを そ れ ら の ポ リ フ ェ ノ ー ル 含 有 率 に 基 づ き酵 素 量 に 対 し ポ リ フ ェ ノ ー ル 量 と し て10wt%に な る よ うに 添 加 し,共 存 時 間lh,加 水 分 解 時 間5hと し て,リ パ ー ゼ に 対 す る 阻 害 作 用 の 強 さ を 比 較 し た 。 な お,ポ リ フ ェ ノ ー一一ル と し て はRTE,GTEに 加 え てQu,Ru,EGcG,EGc, PGお よ びGAを 用 い た 。 2.3.3ポ リ フ ェ ノ ー ル の 活 性 阻 害 作 用 に 対 す る 分 子 構 造 の 影 響 ポ リ フ ェ ー ル の 活 性 阻 害 作 用 に 対 す る分 子 構 造 の 影 響 を 検 討 す る た め に,QuとRu,ポ リ フ ェ ノ ー一一ル 標 準 物 質 で あ るEGCGとEGCお よ び 比 較 物 質 で あ るPGとGAを そ れ ぞ れ1.0×10'2mol量 を 用 い て2.3.2と 同 条 件 で 活 性 阻 害 試 験 を 行 い,各 種 ポ リ フ ェ ノ ー一一ル の 等mol当 た り の 阻 害 作 用 に つ い て,そ の 分 子 構 造 と の 関 連 を 含 め て 検 討 し た 。 2.4豚 す い 臓 α一ア ミ ラ ー ゼ に 対 す る 活 性 阻 害 作 用 の 測 定 2.4.1ポ リ フ ェ ノ ー ル 添 加 量 と 共 存 時 間 の 検 討 5mmol/L塩 化 カ ノレシ ウ ム 添 加 酢 醗 衝 液(pH-55)に α一ア ミ ラ ー-tiを 溶 解 し て0.02mg/mL溶 液 を 調 製 し,酵 素 量 に 対 し て50∼250Wt%のRTE,GTEを そ れ ぞ れ イ オ ン 交 換 水 に 溶 解 し た 溶 液lmLを 混 合 し て,40℃,8001pm で1∼3h概 拝 し た 。 こ の 酵 素 溶 液 に0,1%デ ン プ ン溶 液 2mLを 加 え,40℃,700rpmで 加 水 分 解 反 応(lh)を 行 っ た 。 反 応 終 了 後 沸 騰 浴 中 で10min加 熱 し,酵 素 を 失 活 させ た 後,0,015%ヨ ウ 素 一〇.15%ヨ ウ化 カ リ ウ ム 溶 液5mLを 加 え て ヨ ウ 素 一デ ン プ ン 反 応 に 基 づ く 青 紫 の 発 色 を 吸 光 度 分 析(660㎜)し,デ ン プ ン 残 存 量 か ら α一ア ミ ラ ー ゼ に 対 す る活 性 阻 害 作 用 を 測 定 し た 。 2.4.2各 種 ポ リ フ ェ ノ ー ル の 活 性 阻 害 作 用 の 比 較 ポ リ フ ェ ノ ー ル 量 を 酵 素 量 に 対 し て50wt%,共 存 時

間lh,加 水 分 解 時 間lhと し て2,4.1と 同 様 に 加 水 分 解 反 応 を 行 い,α 一ア ミ ラ ー ゼ に 対 す る 阻 害 作 用 を 調 べ た 。 な お,ポ リ フ ェ ノ ー ル 試 料 と し て はQu,Ru,EGCG,EGC, PGお よ びGAを 用 い た 。 2.4.3ポ リ フ ェ ノ ー ル の 活 性 阻 害 作 用 に 対 す る 分 子 構 造 の 影 響 ポ リ フ ェ ノ ー ル の 分 子 構 造 が 酵 素 に 対 す る 活 性 阻 害 作 用 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 す る た め,Qu,Ruに 加 え て ポ リ フ ェ ノ ー一一ル 標 準 物 質 で あ る,EGCG,EGCと 比 較 物 質 で あ るPGお よ びGAを そ れ ぞ れ1.0×10'7mol量 を 用 い て2.4.2 と 同 条 件 下 に 活 性 阻 害 試 験 を 行 い,各 ポ リ フ ェ ノ ー ル 等 mol当 た り の 活 性 阻 害 作 用 を そ の 分 子 構 造 と の 関 連 を 含 め て 比 較 し た 。 2.5各 ポ リ フ ェ ノ ー ル の 分 配 係 数 の 測 定 リパ ー ゼ お よ び α 一ア ミ ラ ー ゼ に 対 す る 活 性 阻 害 作 用 に 及 ぼ す ポ リ フ ェ ノ ー ル の 溶 解 性 の 影 響 を 調 べ る た め, オ ク タ ノ ー一一ル/水 系 に お け る 分 配 係 数 を 測 定 し た 。す な わ ち,50mg/Lの ポ リ フ ェ ノ ー一一ル 水 溶 液10mLに,イ オ ン 交 換 水 と オ ク タ ノ ー一一ル を24h以 上 混 合 し て 飽 和 さ せ た 水 飽 和 オ ク タ ノ ー ル10mLを 分 液n-一 トに 取 り 振 盤 し た 。 振 盤 後,遠 心 分 離 し,各 層 に 含 ま れ る ポ リ フ ェ ノ ー ル 量 を 285㎜ に お け る 吸 光 分 析 に よ り 測 定 し,分 配 係 数 を log(Co/Cw)と し て 算 出 し た 。 2.6Hanes-Woolfプ ロ ッ トに よ る活 性 阻 害 メ カ ニ ズ ム の 検 討 Hanes-Woolfプ ロ ッ トを行 い,ミ カ エ リ ス 定 数(Km)と 最 大 反 応 初 速 度(Vmax)を 求 め,活 性 阻 害 メ カ ニ ズ ム の 検 討 を行 っ た 。す な わ ち,酵 素 量,ポ リ フ ェ ノー ル 量 を 一 定 に し,基 質 量 を 精 製 キ ャ ノ ー ラ 油 で は0,5∼5,0g,デ ン プ ン で はO.Ol∼05%と し て,酵 素 と ポ リ フ ェ ノ ー ル を 基 質 に 同 時 に 添 加 し て 加 水 分 解 反 応 を 行 っ た 。そ れ ぞ れ 加 水 分 解 速 度[V]を 算 出 し,横 軸 に 基 質 濃 度[S],縦 軸 に[S]/[V]で プ ロ ッ ト し,得 ら れ た 直 線 式 とHanes-Woolfフ.ロ ッ トの [S]/[V]=[S]八rmax+Km八rmaxか らKmとVmaxの 値 を 算 出 し た 。 ポ リ フ ェ ノ ー ル 添 加 後 をKm、,VmaXiと し た 時,拮 抗 阻 害 の 場 合 に はVmax=Vmaxi,Km<Km、 と な り,非 拮 抗 阻 害 の 場 合 に はVmax>VmaXi,Km=Kmlと な る こ と か ら,ポ リ フ ェ ノ ー ル 化 合 物 に よ る 酵 素 の 活 性 阻 害 メ カ ニ ズ ム を 考 察 し た 。

3.結

果 と 考 察

3.1豚 す い 臓 リパ ー ゼ に 対 す る 活 性 阻 害 作 用 3.1.で ポ リ フ ェ ノ ー ル の 添 加 量 と 共 存 時 間 の 影 響

RTEお よ びGTEの 添 加 量 を0-50wt%,共 存 時 間10min-3hと 変 化 さ せ,加 水 分 解 時 間 を5hと し た 場 合 の リ パ ー ゼ の 比 活 性 の 変 化 を 図1,2に そ れ ぞ れ 示 し た 。 な お,加 水 分 解 時 間15hの 結 果 は5hと ほ ぼ 同 様 で あ っ た の で,以 後 は 加 水 分 解 時 間 を5hと し た 。 1 0.8 0.6 麺 云0・4 0.2 0 5 , , 一 共 存 時間 ◇:10m血O:1h 口=2h△;3h 一 一

一

II

OIO20304050 RTE添 加 量(%)

図1RTE添

加 系 に お け る リパ ー ゼ 比 活 性 の 変 化

坦

距

玉

1

0.8

0.6

0.4

0,2

0

N口

糖

翫 血 。,、h

"ロ=2h△:3h

,

"

"

[_犠

OlO20304050 GTE添 加 量(%)

図2GTE添

加 系 に お け る リパ ー ゼ 比 活 性 の 変 化

図1か らRTE添 加 系 に お い て 添 加 量 の 増 加 に 伴 っ て 比 活 性 は 低 下 し,50wt%添 加 系 で は 約0.6で あ っ た 。ま た, 図2か らGTE添 加 系 で はRTE添 加 系 に 比 較 し て 顕 著 な 比 活 性 の 低 下 が 見 られ,30Wt%以 上 の 添 加 系 で は ほ ぼ 完 全 に 失 活 す る こ と が 判 明 し た 。 な お,図1,2か ら10min ∼3hの 共 存 時 間 で は 阻 害 作 用 に 大 き な 変 化 が な い こ と が 確 認 さ れ た た め,以 後 の 共 存 時 間 はlhと し た 。 以 上 の 結 果 か ら,RTEとGTEが リパ ー-tiに 対 して 活 性 阻 害 作 用 を 示 し,こ の 作 用 は 添 加 量 に 依 存 し て い る こ と が 判 明 し た 。

3.1.2各 種 ポ リ フ ェ ノ ー ル の 活 性 阻 害 作 用 の 比 較 R]rE,GTE,Qu,Ru,EGcG,EGc,PGお よ びGAを リパ ー ゼ に 対 し て ポ リ フ ェ ノ ー一一ル 量 と し て10wt%に な る よ うに そ れ ぞ れ 添 加 し,リ パ ー ゼ の 比 活 性 を 測 定 し た 結 果 を 図3に 示 し た 。 RTE GTE Ou Ru EGCG EGC 045 0ア8 078 018 071 082 PG-03/ GA■ ■ ■■ ■■ ■■置032 Q凹 Ru-066 EGCG-023 082 EGC

PG-06ア

GA-069

0紛 0 020、40608 比 活 性(無 添 加 系:1.0) 1

図4各

種 ポ リ フ ェ ノー ル 等 モ ル あ た りの リパ ー ゼ 活

性 阻 害

0 02 04 06 OB 比 活 性(無 添 加 系:1.0) 1

図3各

種 ポ リ フ ェ ノ ー ル 等 量 あ た りの リパ ー ゼ に

対 す る 活 性 阻 害

RTEお よ びGTE添 加 系 の 比 活 性 は そ れ ぞ れ0,78お よ び 0.45ま で 低 下 し,こ れ らの 植 物 抽 出 物 は リパ ー一一ゼ に 対 し て 阻 害 作 用 を 示 し,さ ら に,GTEは ポ リ フ ェ ノ ー一一ル 量 あ た りの 活 性 阻 害 作 用 がRTEよ り強 い こ と が 判 明 し た 。 そ の た めRTE,GTEの 主 要 成 分 で あ るQu,Ru,EGCG,EGC の 活 性 阻 害 作 用 を 調 べ た 結 果,Qu:0,78,Ru:0.82, EGCG:0.18,EGC:O.71,PG:0,37,GA:0,32と い ず れ に お い て も 比 活 性 の 低 下 が 観 察 さ れ,特 に,EGCGに 最 も 高 い 活 性 阻 害 作 用 が あ る こ と が 判 明 した 。ま た,RrE とQu,Ruを 比 較 す る と,い ず れ の 添 加 系 に お け る 比 活 性 も ほ ぼO.8程 度 で あ っ た こ と か ら,RTEの 作 用 は そ の 構 成 成 分 で あ るQu,Ruの 作 用 に 基 づ く と考 え ら れ た 。 さ ら に,GTE添 加 系 の 比 活 性 は0.45ま で 低 下 し た が,EGCG で は0.18と さ ら に 強 い 阻 害 が 見 ら れ た 。GTEがEGCGよ り も 阻 害 が 弱 い こ と に つ い て はGTEに はEGCG以 外 に よ り阻 害 作 用 の 低 い ポ リ フ ェ ノ ー ル が 存 在 し て い る こ と が 推 察 さ れ た 。GTEに 含 ま れ る 成 分 の1つ で,EGCGと は 異 な りガ ロ イ ル 基 が エ ス テ ル 結 合 し て い な いEGCの 比 活 性 は0.71とGTEやEGCGよ り低 い こ と か ら,フ ラ ボ ノ イ ド類 に あ るC6-C3-C6結 合 に も リパ ー ゼ に 対 す る 活 性 阻 害 作 用 が あ り,そ の 作 用 は ガ ロ イ ル 基 に よ っ て さ ら に 補 強 さ れ る こ と が 判 明 し た 。 3.1.3ポ リ フ ェ ノ ー ル の 活 性 阻 害 作 用 に 対 す る 分 子 構 造 の 影 響 Ru,EGCG,EGC,PG,GAを 基 質 に 対 し て 等 モ ル 量 (1.0×10'2mol)添 加 し,こ れ ら の 添 加 系 に お け る リパ ー一一 ゼ の 比 活 性 を 図4に 示 し た 。 Quはo.82,Ruはo.66,EGcGはo.23,EGcはo.83,PG は0,67,GAは0.69と な り,EGCGが 最 も 高 い 阻 害 を 示 し た 。QuとEGCは ほ ぼ 同 じ 阻 害 作 用 を 示 し た こ と か らQu の 構 造 に 見 られ るB環 の ジ オ ー一一ル 構 造 とEGCの 構 造 に 見 ら れ るB環 の ト リ オ ー一一ル 構 造 に よ る 阻 害 作 用 に は 差 が な い と 考 え ら れ た 。 ま た,PG:0,67,GA:0,69と い ず れ も Qu,Ru,EGCよ り 阻 害 作 用 が 強 い こ と か ら も ガ ロ イ ル 基 の リパ ー ゼ に 対 す る 阻 害 作 用 が 確 認 さ れ た 。 こ の こ と か ら フ ラ ボ ノ イ ド類 に あ るC6-C3-C6結 合 に も リパ ー一一ゼ に 対 す る活 性 阻 害 作 用 が あ り,そ の 作 用 は ガ ロ イ ル 基 に よ っ て さ ら に 強 ま る こ と が 判 明 し た 。 3.2豚 す い 臓 α一ア ミ ラ ー ゼ の 活 性 阻 害 作 用 3.2.1ポ リ フ ェ ノ ー ル の 添 加 量 と 共 存 時 間 の 影 響 RTE添 加 系 お よ びGTE添 加 系 に お け る α一ア ミ ラ ー ゼ に 対 す る 阻 害 作 用 を 比 活 性 に よ り 測 定 し,図5,6に そ れ ぞ れ 示 し た 。

艶

玉

1 0.8 O.6 0.4 O.2 0 共 存 時 間 ◇:10millO:lh 口=2h△:3h 050 100150200250 RTE添 加 量(%) 図5RTE添 加 系 に お け る α 一ア ミ ラ ー ゼ 比 活 性 の 変 化

且 屑 0.8 0.6 云0.4 0.2 0 }

＼

自 コ 匿 一 = 桝 〔 共 存 時 間 ◇:10mh1 口=2h O:lh △=3h 一 一 050100150200250 GTE添 加 量(%) 図6GTE添 加 系 に お け る α 一ア ミ ラ ー ゼ 比 活 性 の 変 化 RTE GTE qu Ru EGCG F(=G PG GA … ↑ 0.73 α64 0.6 0.69 076 071 0 02040608 比 活 性(無 添 加 系:1.0) 084 1

図7各

種 ポ リフ ェノ ー ル 等 量 あ た りの α一ア ミラ ー ゼ

に 対 す る活 性 阻 害 作 用

RTE,GTEを 酵 素 量 に 対 し て0-250wt%添 加 し た 場 合, 添 加 量 に と も な っ て α一ア ミ ラ ー-tiの 活 性 は 最 大05ま で 低 下 し た が,1∼3hの 共 存 時 間 の 阻 害 作 用 に 対 す る 影 響 は リパ ー ゼ の 時 と 同 様 に 観 察 さ れ な か っ た 。 ポ リ フ ェ ノ ー ル 添 加 量 に つ い て は,図1に 示 し た リパ ー-tiで は 酵 素 量 に 対 し て50wt%量 でRTEで は0,6,GTEで は ほ ぼ 完 全 に 失 活 し た の に 対 し,α 一ア ミ ラ ー ゼ は 酵 素 量 に 対 し て 250wt%添 加 し て も比 活 性 の 低 下 は 約05と な っ て い る こ と か ら,RTE,GTEの 活 性 阻 害 作 用 は リパ ー一一ゼ に 対 し て よ り も α一ア ミ ラ ー ゼ に 対 す る 方 が 弱 い こ と が 判 明 し た 。 3.2.2各 種 ポ リ フ ェ ノ ー ル の 活 性 阻 害 作 用 の 比 較 R]rE,GTE,Qu,Ru,EGCG,EGC,PGお よ びGAの ポ リ フ ェ ノ ー一一ル 量 を α一ア ミ ラ ー一一ゼ 量 に 対 して50wt% に な る よ う に 添 加 し て α一ア ミ ラ ー ゼ に 対 す る 阻 害 作 用 を 比 活 性 に よ っ て 比 較 し た 結 果 を 図7に 示 し た 。RTEの 比 活 性 はo.6,GTEはo.73,Quはo.64,Ruはo,6,EGcG は0,69,EGCは0.84,PGは0.76,GAは0.71ま で 低 下 し, α 一ア ミ ラ ー一一ゼ に 対 しRuが 最 も 強 い 阻 害 作 用 を 示 す こ と, ま た α一ア ミ ラ ー一一ゼ に 対 し てRTEはGTEよ り 強 い 阻 害 作 用 を 示 す こ と が 判 明 し た 。 さ ら にRTE,GTEの ポ リ フ ェ ノ ー一一ル 成 分 で あ るQu,Ru,EGCG,EGCの 活 性 阻 害 作 用 を 比 較 し た 結 果,Ruの 作 用 が 最 も 強 い こ と が 確 認 さ れ た 。 同 じ フ ラ ボ ノ ー一一ル 類 で あ るQuも 強 い 活 性 阻 害 作 用 を 示 し た こ と か ら,α 一ア ミ ラ ー ゼ に 対 し て は フ ラ ボ ノ ー ル 骨 格 を 有 す る ポ リ フ ェ ノ ー ル が 強 い 阻 害 作 用 を 示 す と 考 察 さ れ た 。 3.2.3各 種 ポ リ フ ェ ノ ー ル の 阻 害 作 用 に 対 す る 分 子 構 造 の 影 響 各 ポ リ フ ェ ノ ー一一ル を 等 モ ル 量(1.0×10'7mol)添 加 し, こ れ ら の 活 性 阻 害 作 用 を 比 活 性 と し て 図8に 示 し た 。各 添 加 系 の 比 活 性 はQu:o,62,Ru:05,EGcG:o.6,E㏄: O.78,PG:0,78,GA:O.67ま で 低 下 し,Ruが 最 も 高 い 阻 害 作 用 を 示 し た 。 ま た,EGCG,EGC,PGお よびGAの 阻 害 作 用 に は 大 き な 差 は 見 られ ず,リ パ ー ゼ に 対 す る 作 用 と は 異 な り,ガ ロ イ ル 基 が α一ア ミ ラ ー ゼ に 対 す る 阻 害 作 用 を 顕 著 に 強 め る こ と は な い こ とが 判 明 し た 。 従 っ て,α 一 ア ミ ラ ー ゼ に 対 す る 阻 害 作 用 に 関 与 す る構 造 は ポ リ フ ェ ノ ー一一ル 特 有 のC6-C3-C6結 合 と推 測 さ れ た 。 さ ら に フ ラ ボ ノ ー ル 骨 格 と フ ラ バ ノ ー ル 骨 格 の 構 造 を 比 較 す る と フ ラ ボ ノ ー一一ル 骨 格 に は ポ リ フ ェ ノ ー ル のC環 に 二 重 結 合 と キ ノ ン 構 造 が あ る こ と か ら,こ れ らの 部 位 が α一ア ミ ラ ー ゼ に 対 す る 強 い 阻 害 作 用 に 関 与 して い る と推 測 さ れ た 。

Qu■ ■■■圏■■■■ ■■■06?

R・-Ob

EGCG-06

EGC 0]8 PG 078 0 02040608 比 活 性(無 添 加 系:1.0) 1

図8各

種 ポ リフ ェノ ー ル 等 モ ル あ た りの α一ア ミラー

ゼ に 対 す る 活 性 阻 害作 用

3.3活 性 阻 害 メ 力 ニ ズ ム の 検 討 3.3.1各 種 ポ リ フ ェ ノ ー ル の 活 性 阻 害 作 用 と 分 配 係 数 の 関 係 各 種 ポ リ フ ェ ノ ー一一ル の オ ク タ ノ ー一一ル/水 系 に お け る 分 配 係 数 を 算 出 し た 結 果,RrEは 一 〇.68,GTEはo,06,Qu は0,62,Ruは 一 〇.22,EGCGはO.6,PGは1.15,GAは 0.04で あ っ た 。 各 種 ポ リフ ェ ノ ー一一ル の 分 配 係 数 と 図3,

図7に 示 した 比 活性 との 関係 を 図9に 示 した 。 こ こに 示

した オ ク タ ノー

一

一

ル/水系 分 配 係 数 は,そ の 数 値 が 高 い ほ ど

脂 溶性,低

い ほ ど水 溶性 で あ る こ と を示 す の で,リ パ ー

ゼ に 対 して は脂 溶性 の ポ リフェ ノー ル ほ ど,α 一

ア ミラー

ゼ に 対 して は 水 溶性 の ポ リフェ ノー ル ほ ど強 い 活 性 阻 害

作 用 を示 す 傾 向 が観 察 され,そ れ ぞ れ の 酵 素 の 作 用 す る

基 質 で あ る,脂 質 と糖 質 の性 質 を反 映 して い る こ とが 示

唆 され た。

坦

躯

﹄

(

図9

1 0、8-◆ ◆ 06・ 「 一.一 冨 、 0、4一 ● 一 ◆ ◆ y=001x奮066  そ  むむら   ◆ _一■ 一■ 一一 ■ 02一 セ 一 セ ラ } ミ バ ア ◆ ■ ◆ ◆ y--02417x+058?8 即 一〇3198 0-一 ・ -1-05005115 分 配 係 数(10g(Co/Cw)) 各 種 ポ リ フ ェ ノ ー ル の 分 配 係 数 と 酵 素 活 性 阻 害 作 用 と の 関 係 3.3.2Hanes-Woolfプ ロ ッ トに よ る 活 性 阻 害 メ 力 ニ ズ ム の 検 討 表1に リパ ー一一ゼ,表2に α一ア ミ ラ ー一一ゼ のVmaxとKmを 比 較 し た 結 果 を 示 し た 。 リパ ー ゼ,α 一ア ミ ラ ー ゼ と も に VmaxをVmax、 と比 較 す る と 、 い ず れ の ポ リ フ ェ ノ ー ル を 用 い た 場 合 に お い て も 減 少 し た の に 対 し,Kmの 値 に 変 化 は 見 ら れ な か っ た 。 こ の こ と か ら リパ ー ゼ,α 一ア ミ ラ ー ゼ に 対 す る 阻 害 作 用 は い ず れ も 活 性 中 心 以 外 で 酵 素 と ポ リ フ ェ ノ ー ル が 結 合 し,酵 素 活 性 を 失 活 さ せ る 非 拮 抗 阻 害 で あ る と 考 察 さ れ た 。 表1ポ リ フ ェ ノ ー ル の リ パ ー ゼ に 対 す る 活 性 阻 害 に お け るKmとVmaxの 変 化

無添加系 _{添加 系}RTE _{添 加 系}GTE _{添 加 系}Qu EGCG_{添 加 系 添 加 系}PG _{添加 系}GA

Vmax 0601 0347 0441 0271 0473 0516 0461

Km Ol84 Ol79 Ol83 Ol85 Ol84 Ol80 Ol87

表2ポ リ フ ェ ノ ー ル の α 一ア ミ ラ ー ゼ に 対 す る 活 性 阻 害 に お け るKmとVmaxの 変 化 無添加系 RTE 添加 系 GTE 添 加 系 Qu 添 加 系 EGCG 添 加 系 PG 添 加 系 GA 添加 系 Vmax 125 869 545 823 243 668 770 Km 2667 2664 2652 2683 2690 2628 2641 4.結 論 2種 の 植 物 抽 出 物 お よ び 各 種 ポ リ フ ェ ノ ー ル 化 合 物 を 用 い て,リ パ ー ゼ お よ び α一ア ミ ラ ー ゼ に 対 す る 加 傭 π)系 に お け る活 性 阻 害 作 用 に つ い て 検 討 し た 結 果,ポ リ フ ェ ノ ー ル の 構 造 お よ び 酵 素 と の 組 み 合 わ せ に よ り,そ の 阻 害 作 用 が 大 き く 異 な る こ と が 判 明 し た 。 す な わ ち,リ パ ー ゼ に 対 す る ポ リ フ ェ ノ ー ル の 活 性 阻 害 作 用 に つ い て は_, ポ リ フ ェ ノ ー ル 特 有 のC6-C3-C6結 合 に よ る 阻 害 作 用 に 加 え て ポ リ フ ェ ノ ー ル に 結 合 し て い る ガ ロ イ ル 基 の 影 響 が 強 い こ と が 確 認 され た 。 一 方,α 一ア ミ ラ ー ゼ に 対 す る活 性 阻 害 作 用 は フ ラ ボ ノ ー ル 骨 格 を 有 す る ポ リ フ ェ ノ ー ル で 強 く,ポ リ フ ェ ノ ー ル 特 有 のC6-C3-C6結 合 が 阻 害 作 用 に 影 響 し て い る こ と が 推 察 さ れ た 。 さ ら に,こ れ ら の ポ リ フ ェ ノ ー ル 化 合 物 の 酵 素 に 対 す る 阻 害 作 用 の メ カ ニ ズ ム を 検 討 し た 結 果,リ パ ー ゼ に 対 し て は 脂 溶 性 の ポ リ フ ェ ノ ー ル,α 一ア ミ ラ ー ゼ に 対 し て は 水 溶 性 の ポ リ フ ェ ノ ー ル が 強 い 阻 害 作 用 を 示 す 傾 向 が 見 られ,ま た リパ ー ゼ,α 一ア ミ ラ ー ゼ に 対 す る 阻 害 メ カ ニ ズ ム に つ い てHanes-W601fプ ロ ッ トに よ り検 討 し た 結 果,酵 素 の 活 性 中 心 以 外 で 酵 素 と ポ リ フ ェ ノ ー ル が 結 合 し,酵 素 活 性 を 失 活 させ る非 拮 抗 阻 害 で あ る こ と が 確 認 さ れ た 。 ポ リ フ ェ ノ ー ル 化 合 物 お よ び これ ら を 含 む 植 物 抽 出 物 に つ い て,消 化 酵 素 に 対 す る活 性 阻 害 作 用 を 活 用 し た 各 種 利 用 法 が 今 後 開 発 さ れ る こ と が 期 待 さ れ る 。

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