I 2 ESI - Ion Trap

先端物性測定実習I

質量分析2

エレクトロスプレーイオン化法

（ESI - Ion Trap）

•2011年度 前期（月曜3限∼5限）

•担当：高山・野々瀬・高橋

•注射針先端に大きな電場勾配が生じ、

静電気力が表面張力に打ち勝って、

溶液が荷電液滴となって大気中に放出される。

•シリンジポンプによって、流量5∼20μl/minで

希薄溶液が注射針に送られる。

•注射針には周囲の電極に対して

3∼5ｋVの電位が印加される。

エレクトロスプレーイオン化法の原理

エレクトロスプレーイオン化法（ESI）とは、

生体分子・有機分子を非破壊的に、

溶液中から真空中へ導入するソフトなイオン化法である。

大きな分子量を持ち、不揮発性で電荷を帯びる分子の

質量分析にはきわめて有用である。

＋ − ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − − − − − − − ＋ ＋ ＋ 高圧電源 ３−５ｋV ＋ − 電子 電子 酸化 還元

エレクトロスプレーイオン化法

の原理図

＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋_＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ Taylor コーン 対極板 注射針 シリンジより 送られてきた 試料溶液

＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ •このような分裂過程が繰り返される。 最後には孤立した分子イオンが生成される。 •液滴表面から溶媒分子が蒸発。 •溶媒の蒸発に伴って液滴のサイズが減少し 液滴表面の電荷密度が増大。 •静電反発力が表面張力よりも大きくなると、 荷電液滴はより小さなサイズの液滴にクーロン分裂。

荷電液滴から孤立分子イオンの生成

蛋白質は20種類のアミノ酸から構成される

酸性溶液中にある蛋白質では、

リシン、ヒスチジン、アルギニンのR基

728.1 17+ 773.6 16+ 825.1 15+ 883.9 14+ 951.8 13+ 1031.0 12+ 1124.7 11+ 1237.0 10+ 1374.4 9+ 1546.2 8+ 09123cyto mass00003.d: +MS 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 8 x10 Intens. 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 m/z エレクトロスプレーイオン化法（ESI)を用いた質量分析装置を用いて、 蛋白質多電荷イオンのマススペクトルを測定する。 ESIによって蛋白質をイオン化すると 多数のプロトンが付加した多電荷イオンが生成される。

蛋白質多電荷イオンの質量分析

H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ Cytochrome cのマススペクトル 分子量∼12000 Da

N-H結合をレナード-ジョーンズ・ポテンシャルと仮定すると、次の式であらわされる。 ここで、rはN原子とH原子との間の距離(核間距離)である。 化学結合は近距離力 ) ( 3 2 1 4 ) ( 4 2 2 0 2 Coulmb 0 2 Coulmb a r a r a Ze U a r r Ze U 6 12 Jones Lenard 4 r r U 蛋白質多電荷イオンの構造を球だと仮定する。 半径aの球の内部に電荷Zeが一様に分布しているとする。 その場合のクーロンポテンシャルは、次の式であらわされる。

N - H

+ + ++ ₊ + + + + + + + + + + + + ++ + + + クーロン力は遠距離力 +

N-H結合のレナード-ジョーンズ・ポテンシャルと 蛋白質内の電荷によるクーロンポテンシャルを 足し合わせたもの + + + + ₊ + + + + + + + + + + + + + + + + +

N -

H+

728.1 17+ 773.6 16+ 825.1 15+ 883.9 14+ 951.8 13+ 1031.0 12+ 1124.7 11+ 1237.0 10+ 1374.4 9+ 1546.2 8+ 09123cyto mass00003.d: +MS 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 8 x10 Intens. 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 m/z

Cytochrome c とは・・

•シトクロムc（cytochrome c）は、ミトコンドリアの内膜に弱く結 合しているヘム蛋白質の一種である。ミトコンドリア内で電子 伝達系の構成要素を成す。 •分子量は１個あたり約12,000である。 •シトクロムcは高度に保存されたタンパク質で、動物、植物、 単細胞生物など非常に多様な生物で確認されている。

Chain Sequence of Cytochrome c

Basic Residues;

Lysine;K

,

Arginine;R

,

Histidine;H

104 residues

GDVE

K

GKKIFVQ

K

CAQC

H

TVE

K

GG

K

H

K

TGPN

L

H

GLFG

R

K

TGQAPGFTYTDAN

K

N

K

GITW

K

EET

LMEYLENP

KK

YIPGT

K

MIFAGI

KKK

TE

R

EDLIA

YL

KK

ATNE

•蛋白質

ミオグロビン (myoglobin）

リゾチーム (lysozyme）

リゾチーム [S-S結合の解離したもの]

•ペプチド

アンジオテンシン I (angiotensin I )

•試料溶液

試料濃度 1∼10μg/ml

溶媒 メタノール + 純水（1％） + 酢酸（0.1∼1％）

実習に用いる試料

616.1 737.9 23+ 771.5 22+ 808.2 21+ 848.5 20+ 893.1 19+ 942.7 18+ 998.1 17+ 1060.4 16+ 1131.1 15+ 1211.8 14+ 1304.9 13+ 1413.5 12+ myo mass00000.d: +MS 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 8 x10 Intens. 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 m/z

Myoglobin とは・・・

•ミオグロビン（myoglobin）とは筋肉中にあって 酸素分子を代謝に必要な時まで貯蔵する色素タンパク質。 •1本のポリペプチド鎖と1分子のヘムからなる。 •分子量は１個あたり約17,000である。

Chain Sequence of Myoglobin

Basic Residues;

Lysine;K

,

Arginine;R

,

Histidine;H

153 residues

GLSDGEWQQVLNVWG

K

VEADIAG

H

GQEVLI

R

LFTG

H

PETLE

K

FD

K

F

K

H

L

K

TEAEM

K

ASEDL

KK

H

GTVVLTAL

GGIL

KKK

G

HH

EAEL

K

PLAQS

H

AT

K

H

K

IPI

K

YLEFISDAI

I

H

VL

H

S

K

H

PGDFGADAQGAMT

K

ALELF

R

NDIAA

K

Y

K

Lysozymeとは・・

•リゾチーム（Lysozyme）とは、真正細菌の細胞壁を構成する多糖類を加水分解する酵素である。 ヒトの場合涙や鼻汁、母乳などに含まれている。 工業的には卵白から抽出したリゾチームが食品や医薬品に応用されている。 •分子量は∼14000amu。 •酸性アミノ酸（Asp7、Glu2）に対して塩基性アミノ酸（Arg11、Lys6）の数が多いことと 分子量の割にS-S結合が多いことが特徴である。 •食品添加物としては日持ちを向上させるために用いられる。 •塩化リゾチーム（リゾチーム塩酸塩）は、グリコサミノグリカンを分解作用があるとして 日本でも医薬品として広く用いられている。

Length;129 residues

Secondary structure;

41% helical (7 helices; 54 residues) 10% beta sheet (9 strands; 14 residues)

Cystine;C, Disulfide bond;

----Reference; Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb)

OH HS H N O C S N H C O S HS OH

+

OH S H N O C SH N H C O SH S OH

+

Reduction of S-S bonds with DTT

HO

SH OH HS

1101.3

1193.0

1301.3

1431.3

1590.2

lysozyme mass 158vcap00000.d: +MS

362.9 845.5 955.3 1023.4 1102.0 1193.7 1302.1 1432.1

lysozyme+DTT mass 158vcap00000.d: +MS 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 8 x10 Intens. 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 8 x10 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time [s]

Lysozymeのマススペクトル

S-S結合の切断前 S-S結合の切断後 m/z

s

s

s

s

s

s

H+ H+ H+ H+

Disulfide-intact

lysozyme

H+ H+ H+ H+ H+ H+

Disulfide-reduced

lysozyme

H+ H+ H+ H+ H+ H+ S-S結合によって構造が固定されている 内部のサイトにH+_{が付着できない} H+間のクーロン反発が大きい 構造が柔軟 内部のサイトにもH+_{が付着できる} H+間のクーロン反発が小さい

Angiotensin のマススペクトル

アンジオテンシン (angiotensin) はポリペプチドの一種で、 昇圧作用を持つ生理活性物質。 アンジオテンシンI∼IVの4種がある。 心臓収縮力を高め、細動脈を収縮させることで血圧を上昇させる。 アンジオテンシンIの1次構造

Asp - Arg - Val - Tyr - Ile - His - Pro - Phe - His - Leu - OH

分子量∼1300amu。 433.0 3+ 487.3 649.1 2+ ang mass00004.d: +MS 0 1 2 3 4 5 7 x10 Intens. 300 400 500 600 700 800 900 m/z

エレクトロスプレーイオントラップ型質量分析装置

Bruker-Daltonics, HCT-ETD II

N2 He

PC _Hub

Source CID

直流電源 0−360V ＋ − + + + エレクトロスプレー キャピラリー スキマー 電位勾配によって加速され、 中性分子と衝突し、分解する N₂ N₂ N₂ N₂ N₂ N₂ N₂

433.0 3+

487.3

648.8 2+

angiotensin mass 129 vcap00000.d: +MS

269.1 380.0 433.0 3+ 513.2 649.0 2+ 784.3

angiotensin mass 230 vcap00000.d: +MS

110.1 255.0 343.2 506.2 660.1 784.3 880.4 973.5 1119.4 1296.6

angiotensin mass 360 vcap00000.d: +MS 0 1 2 3 4 8 x10 Intens. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 8 x10 0 1 2 3 4 7 x10 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time [s] 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time [s] m/z m/z Angiotensin I キャピラリー電圧依存性（スキマー電圧40V） Vcap 129V Vcap 230V Vcap 360V

616.1 848.5 20+ 893.1 19+ 1060.4 16+ 1131.0 15+ 1211.7 14+ 1304.8 13+ 1413.4 12+ 1541.8 11+

myoglobin mass 151vcap 00000.d: +MS

616.1 893.1 19+ 942.7 18+998.1 17+1060.4 16+ 1131.0 15+ 1211.7 14+ 1304.8 13+ 1413.5 12+ 1541.9 11+

myoglobin mass 300vcap 00002.d: +MS

616.1 998.1 17+ 1060.4 16+ 1131.0 15+ 1211.7 14+ 1304.8 13+ 1413.5 12+ 1541.9 11+ 1696.0 10+

myoglobin mass 360vcap 00000.d: +MS 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 8 x10 Intens. 0 1 2 3 8 x10 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 8 x10 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time [s] 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time [s] m/z m/z Myoglobin キャピラリー電圧依存性（スキマー電圧40V） Vcap 151V Vcap 300V Vcap 360V

Octapole Ion Guide

+

Quadrupole Ion Trap

+

++

432.8

433.4 433.8

angiotensin I mass 150vcap 430-440high res00000.d: +MS

0 1 2 3 8 x10 Intens. 430 432 434 436 438 440 m/z 648.9 649.2 649.8 650.2

angiotensin I mass 150vcap 645-655high res00000.d: +MS

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 8 x10 Intens. 644 646 648 650 652 654 m/z

Angiotensin I （z=2,3)

１３

C 同位体分布

3+ 2+

1. これならわかるマススペクトロメトリー

志田保夫 [ほか] 著 化学同人

図書館配架場所 433.2¦¦17

2. マススペクトロメトリーってなあに

日本質量分析学会出版委員会編

日本質量分析学会

図書館配架場所 433.2¦¦18

【参考文献】

レポートの課題

・Angiotensin I 1. ESI法によってangiotensin Iをイオン化すると、2個あるいは3個のプロトンが付加した多電荷イオンが生成する。 一方、MALDI法によってイオン化すると、主として1価のイオンのみが生成する。これはなぜか。 その理由について考察しなさい。 1. 試料分子中にプロトンが付加できるサイトは合計何カ所あるか。また、それはどこか。 2. ガラスキャピラリー末端とスキマーとの間の電位勾配を大きくすると、イオンが電位勾配によってより大きく加速さ れ、 中性分子との衝突エネルギーが増大する。その結果、イオンの分解反応が促進される。 これによって、マススペクトルにどのような変化が観測されているだろうか。簡単に述べなさい。 ・Myoglobin 1. 得られたマススペクトルからMyoglobinの分子量を推定しなさい。 2. ガラスキャピラリー末端とスキマーとの間の電位勾配を大きくすると、電荷数の小さいイオンの生成が促進される。 その理由について述べなさい。 Lysozyme 1. Lysozymeには4箇所のS-S結合が存在する。DTTによってS-S結合を切断すると、電荷数のより大きな 多電荷イオンが観測される。その理由について考察しなさい。 1. Lysozymeの分子量は約14000ダルトン程度である。得られたマススペクトルから分子量を推定しなさい。 2. S-S結合の切断前と切断後のマススペクトルにおいて、同じ電荷数（と思われる）イオンの分子量を比較すると、 僅かにS-S結合切断後の場合の分子量が大きい。これはなぜか。理由を述べなさい。

終わり

御静聴を

どうも有り難うございました。

次回からの実習を