Title Development of an Environmentally Friendly L-Lactic AcidProduction Process( 内容の要旨 ) Author(s) 三浦, 重信 Report No.(Doctoral Degree) 博士(農学) 乙第088号 Issue Date 2004-09-10 Type 博士論文 Version URL http://hdl.handle.net/20.500.12099/2332 ※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。
氏 名(本個)籍) 学 位 の 種 類 学 位 記 番 号 学位授与年月 日 学位授与の要件 学 位 論 文 題 目 審 査 委 員 会 三 浦 重 信 (東京都) 博士(農学) 農博乙第88号 平成16年9月10日 学位規則第4条第2項該当 DevelopmentofanEnvironmentanyFriendly L･LacticAcidProductionProcess (環境にやさしいレ乳酸生産プロセスの開発) 主査 静岡大学 教 授 岡 部 満 康 副査 信州大学 教 授 柴 井 博四郎 副査 静岡大学 教 授 朴 龍 洗 副査 岐阜大学 教 授 高見澤 一 裕 論 文 の 内 容 の 要.一旨 生分解性プラスチックスの優れた原料であるL-乳酸の省エネルギーかつゼロエミ ッション化を目指した生産プロセスの開発を目的とした研究についてまとめられて いる｡ 最初に世界における生分解性プラスチックの開発状況ならびにその中で最も有望 とされているポリレ乳酸の原料となるL･乳酸の既存の生産プロセスが紹介され､本 論文の研究背景について概説している｡従来のレ乳酸生産プロセスはバクテリア､ カビのいずれを問わず炭酸カルシウムを中和剤として用いてきたが､ゆゆしき環境 問題をひきおこす結果となっている｡まず炭酸カルシウムに代わりうるアンモニア を利用することを検討したが､使用しているj払如びβ以:J召aeにはアンモニア耐性 がなく､アンモニアによるpH調整は不可能であった｡そこで静岡県藤枝市の土壌 から改めて戯画びを分離し､上れを親株としてNTG変異処理後､塩化アンモニ ウム濃度勾配寒天培地を用いてアンモニア耐性変異株の分離を試みた｡結果的に高 度の塩化アンモニウムに耐性を有し､かつ乳酸生成能の高い戯如∬Sp. ME･96-1196を分離している｡ 次いで本菌株を用いた培地培養条件の最適化を試みている｡本研究の場合はバイ オリアクターは省エネルギー型の3-Jエアリフトバイオリアクタ一に限定した｡結 ･果的に､炭酸カルシウムを使用せず､前培養時での胞子接種濃度10￠spores/ml,グ
収率で90g/J以上のL一乳酸が生産された事を明らかにしている｡ 実際の工業生産を目的とし､エアリフト型バイオリアクタ一によるレ乳酸醗酵の スケールアップについて検討した｡まず､気一水系での酸素移動容量係数亀α)を幾 何学的形状がほぼ相似である3･Jと100･Jエアリフトバイオリアクターの両方で測定 し､バイオリアクターの形状に関係なく､如は通気練達度の関数となることを明ら かにした｡そこで3-Jエアリフト型バイオリアクターで最大のL一乳酸の濃度が得ら れた通気線速度で100-Lエアリフトバイオリアクターで運転したところノ3-′エアリ フト型バイオリアクターとほぼ同じL一乳酸濃度が得られた｡結果的にエアー｣フト型 バイオリアクタ一におけるL-乳酸醗酵は毎をスケールアップの基準として使用す ることが可能なことを示している｡ アンモニア中和法で得られたL･乳酸はアンモニウム塩となっているが､この塩か ら炭酸カルシウムは乳酸と反応すると乳酸とほぼ等量の硫酸カルシウム(石膏)を 生成し､遊離のL･乳酸草生産する回収生成プロセスについて検討した｡まず培養液 から菌体を分離した培養ろ過液を蒸発缶で濃縮し､これに刀･ブタノールを加えてレ 乳酸プチルとした｡このレ乳酸プチルに触媒を加え遊離のレ乳酸をえた｡このL･乳 酸は無臭､無色で光李純度はほぼ100%であった｡培養液からのL･乳酸の回収率は 95%であった｡また培拳時のpH調整に使用したアンモニアの回収率は58%であり､ 回収したアンモニアは次のL･乳酸醗酵甲pH調整剤として再利用した｡ 従来のL･乳酸醗酵においては澱粉あるいはグルコースが炭素源として用いられて いたが､これらの炭素源は生分解性プラスチックスの原料としては高価すぎる｡そ こで､中国東北部のトウモロコシ生産坤帯で未利用のまま廃棄されているトウ軍ロ コシ廃棄物のひとつであるコーンコブからのレ乳酸生産の可能性について検討した｡ まずコーンコプを市販のセルラーゼ(アクレモニウムセノ_レラーゼ､明治製菓)で加 水分解し､これを原料としj払如ⅣSp.ME･96･1196によるL一乳酸醗酵を行った｡ 結果的に100g〝のコーコプから24'離のL･乳酸を得ている｡しかしながら市販酵素
は高価であり､コスト的に本方法によるL･乳酸生産はグルコースや澱粉を原料とす
る場合に比較して大幅にコストダウンすることは出来なかった｡そこで､セルラー ゼ生産菌であるAα以mm桓m`血肌m呼血統∽とレ乳酸生産菌である戯如〟βSp. ME･96･1196を混合培養し未処理のコーンコブからレ乳酸を生産するプロセスを検 討した結果､100がの未処理のコーンコブから26釘JのL-乳酸を生産することが出 来た｡これは廃棄物処理とL-乳酸生産を兼ねた新規なプロセスであり､今後の検討 により大嘩なコストダウンが期待できることを明らかにしている｡ 一以上のように本論文では硫酸カルシウムの副生がなく､しかも使用したアンモニア は回収が可能なゼロエミッションに一歩近づいたプロセスを完成させた｡さらに省 エネルギータイプのエアリフトバイオリアクターの利用が可能なことを示し､さら-130-に低コスト化の一環として農産物廃棄物を炭素源として使用できる可能性を示唆し ている｡ 審 査 結 果 の 要 旨 生分解性プラスチックスの優れた原料であるレ乳酸の省エネルギーかつゼロエミ ッション化を目指した生産プロセスの開発を目的とした研究についてまとめたもの である｡ 本論文の公開学位論文発表会は､審査委員会全員を含む関連教官や学生の出席の もと､平成16年5月14日(金)午後1時から静岡大学農学部応用生物化学科会 議室において実施された｡発表内容は充実しており､本申請者は質問に対し的確に 応答した｡発表終了に引き続き､論文内容を中心に審査委負会を開催した｡
提出された学位論文の主な審査結果は以下のとおりである｡
はじめに世界における生分解性プラスチックの開発状況ならびにその中で最も有 望とされているポリL-乳酸の原料となるレ乳酸の既存の生産プロセスが紹介され､本論文の研究背景について概説している｡従来めL･乳酸生産プロセスはバクテリア
､カビのいずれを問わず炭酸カルシウムを中和剤として用いてきたが､炭酸カルシ ウムは乳酸と反応すると乳酸とほぼ等量の硫酸カルシウム(石膏)を生成し､ ゆゆしき環境問題をひきおこす結果となっている｡まず炭酸カルシウムに代わりうる アン卓ニアを利用することを検討したが､使用している点物描叩堰aeにはアン モニア耐性がなく､アンモニアによるpH調塵鱒不可能であった｡そこで静岡県藤 枝市の土壌から改めて戯血pぴを分離し､これを親株としてmG変異処理後､塩 化アンモニウム濃度勾配寒天培地を用いてアンモニア耐性変異株の分離を試みた｡結 果的に高度の塩化アンモニウムに耐性を有し⊥かつ乳酸生成能の高い物掴印･ MK･96-1■196を分離している｡ 次いで本菌株を用いた培地培養条件の最適化を試みている｡本研究の場合はバイオ リアクターは省エネルギー型の3-J土アリフトバイオリアクターに限定した｡結果的に､炭酸カルシウムを使用せず､前培養時での胞子接種濃度106spores/ml,グルコ
ース初発濃度120g/J､培養時のpH6.0ならびに通気量1･0vvmの時に炭酸かレシ ウムを使用せず､10%アンモニア水によるpH調整でグルコースから8鴫以上の収率で 90g/J以上のレ乳酸が生産された事を明らかにしている｡ 実際の工業生産を目的とし､エアリフト型バイオリアクターによるL･乳酸醗酵の スケールアップについて検討した｡まず､気一水系での酸素移動容量係数亀dを幾何 ▼学的形状がほぼ相似である3･Jと100イエアリフトバイオリアクターの両方で測定し､ バイオリアクターの形状に関係なく､如は通気線速度の関数となることを明らかに した｡そこで3-Jエアリフト型バイオリアクターで最大のレ乳酸の濃度が得られた通 気線速度で100rJ土アリフトバイオリアクターで運転したところ3-Jエアリフト型リアクターにおけるレ乳酸醗酵は如をスケールアップの基準として使用すること が可能なことを示している｡ アンモニア中和法で得られたL･乳酸はアンモニウム塩となっているが､この塩 から遊離のレ乳酸を生産する回収生成プロセスについて検討した｡まず培養液から 菌体を分離した培養ろ過液を蒸発缶で濃縮し､これに∬ブタノールを加えてレ乳酸 プチルとした｡このL･乳酸プチルに触媒を加え遊離のレ乳酸をえた｡このL･乳酸は 無臭､無色で光学純度はほぼ100%であった｡培養液からのレ乳酸の回収率は95% であった｡また培養時のpH調整に使用したアンモニアの回収率は58%であり､回 収したアンモニアは次の.レ乳酸醗酵のp鏑調整剤として再利用した｡ 従来のL･乳酸醗酵においては澱粉あるいはグルコースが炭素源として用いられて いたが､これらの炭素源は生分解性プラスチックスの原料としては高価すぎる｡そこ で､中国東北部のトウモロコシ生産地帯で未利用のまま廃棄されているトウモロコシ 廃棄物のひとつであるコーンコプからのL･乳酸生産の可能性について検討した｡ま ずコーンコブを市販のセルラーゼ(アクレモニウムセルラーゼ､明治製菓)で加水分 解し､これを原料とし物相島p.ME･96･1196によるL･乳酸醗酵を行った｡結呆 的に100がのコーコプから24g/JのL-乳酸を得ている｡しかしながら市販酵素は高 価であり､コスト的に本方法によるL･乳酸生産はグルコースや澱粉を原料とする場 合に比較して大幅にコストダウンすることは出来なかった｡そこで､セルラーゼ生 産菌であるAcnヲ皿皿血皿地色Ⅷ呼ム血皿とL･乳酸生産菌である励如〟βSp･ ME･96･1196を混合培養し未処理のコーンコブからL-乳酸を生産するプロセスを検 討した結果､100g/Jの未処理のコーンコブから26がのL-乳酸を生産することが出 来た｡これは廃棄物処理とL-乳酸生産を兼ねた新規なプロセスであり､今後の検討 により大幅なコストダウンが期待できることを明らかにしている｡ 以上のように本論文では硫酸カルシウムの副生がなく､しかも使用したアンモニア は回収が可能なゼロエミッションに一歩近づいたプロセスを完成させた｡さらに省エ ネルギータイプのエアリフトバイオリアクターの利用が可能なことを示し､さらに低 コスト化の一環として農産物廃棄物を炭素源として使用できる可能性を示唆してい る｡以上のことから審査委員全員で本論文が岐阜大学大学連合農学研究科の博士論 文として十分価値あるものと認めた●○ 学位論文の基礎となる学術論文は以下のとおりである｡ 1.Miura.S.,Arimura,T,Hoshino,M.,K可ima,M･,Dwiarti,lL･,andOkabe,M･ (2003)optimizationandScale-UpofレhcticacidFermentationbyMutant StrainRhhqpus甲･MK-96-1196inAirliftBioreactors･J･Biosci･Bioeng･,96, 65-69. 2.塑iura.SuDwiarti,L.,血imura,T,Hoshino,M･,LiuT,andOkabe,M･(2004)･ EnhancedProduction ofL･LacticAcidby･Ammomia･TblerantMutant Strain戯画ussp.MK･96･1196･J･Biosci･Bioeng･,97,19-23･
-132-3.Miura.S.,Admura,Tl,Itoda,N.,Dwiarti,L.,Jin,B･R,CuiH･B.,and Okabe,M.(2004).productionofL･LacticAcidfrom Corncob.J.Biospi. Bioeng.,97,153-157. その他の既発表論文は以下のとおりである｡ 1.Hano,Tl,Matsumoto,M.,S.Uenoyama,S.,Ohtake,Tl,YKawano,K., and担iura.S.(1993).Separationoflacticacidfromfermentedbrothby SOIventextraction.Bioseparation,3;321･326. 2･MatsumOtO,M･,Uenoyama,S･,Hano,T,Hirata,M･,and迦L､ &(1996).ExtractionKineticsofOrganicAcidswith Tri･uOctylphosphineOxide.JournalChemicalTbchnologyand Biotecbnolo訂67,260･264. 3.Tbng,Y,Hirata,M.,恥kanashi,H.,Hano,Tl,Matsumoto,M･,and Miura.S.(1998).soIventScreeningforProductionofLacticAcidbyExtractive Fermentation.SEPARAJIONSCIENCEANDTECHNOLOGY;33, 1439･1453. 4.Hironaka,M.,Hirata,M.,恥kanashi,H.,Hano,T,and
旦(2001)･KINETICS OF LACTIC
