新規薬物動態研究モデルシステムの構築
著者
後藤 順一
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(課題番号08457618 ) ;:碧.;:. :::･漕.r ト1Ll LJで･トrl.‥ トt 1-J∼R..まJlr ･一.1∴-㌔. :PJt･(.;1. /-- ). ､)-.-ヽーヰノ､〝陣川棚蛸瀞無線ノ
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･･ ;I:I:･1･YrI I仁.I 11･.･1 汀やリノ･･ [>-吋,..,Jt J.}〆. -1' }･∫･-∫. tf･7.4=･･小:. ; ･/●(. 1. -Tl 一ト.(. r -且･･_ 約7-.I.. _,P-I JヽFl-r･.I JもI Ill . 1ヽJ ′ ノー'ノ. ′..It'〝 l LIP-･ l rYJ1-ー ′ト ゝ ∫ ■†..;...㍉㍉ ●言直
-詔描繁簡
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/ は し が き 新規医薬品の開発段階で､また医薬品の適正使用を図るうえで､薬物の吸 収､移行､分布､代謝､排滑など生体内における動的特性を的確に把握する ことが重要となる｡従来､薬物動態研究は､多種の動物と多数の個体を必要 とし､しかも動物とヒトとの種の壁など多くの問題点が指摘されている｡そ ればかりか､極微量で顕著な薬理効果を発揮する薬物では､薬物動態を解明 するための感度､特異性に優れる分析法の開発が陸路となっている｡このた め､薬物動態解析法の確立とin vivoを良く反映する代謝研究モデルシステ ムの構築が強く求められている｡本研究は､胆汁酸､薬物を例にとり､クロ マトグラフ法､免疫測定法及び両者のハイブリッド型測定法を構築し､体液 中それらの高感度､高選択的測定法の開発を行うとともに､体内動態に大き く関与する肝を取り上げ､ in vivoのモデル系として固定化した薬物代謝酵素 群を用いる代謝研究システムを構築し､薬物の体内動態解析法に新たなるコ ンセプトの導入を目的とした｡ (1) LC/ESトMSによる胆汁敢3-グルクロニドの一斉分析 薬物の硫酸､グルクロン酸抱合など第Ⅱ相代謝反応を解析するうえで､酵 素反応により生成するサルフェート及びグルクロニドの高感度測定法の確立 が必須となる｡そこで､イオン性化合物の測定に有利とされるエレクトロス プレーイオン化(ESI)-マススぺクトロメトリー(MS)に着目し､胆汁酸3-サル フェート及び3-グルクロニドをモデル化合物として､本法による高感度測定 法に検討を加えた｡まず､高感度検出のため､これら酸性化合物のイオン化 の効率と移動相に添加する緩衝液の組成との関係を吟味した｡その結果､イ オンの生成は､ pKa値の小さいギ酸並びにトリフルオロ酢酸を用いると抑制 されるのに対し､酢酸アンンモニウムではイオン化効率が極めて高く微量分 析に有利なことが判ったC これは､イオン源で液滴が濃縮され､溶質が質量 分析計に導入されてゆく過程で､酸性化合物の解離が共存する酸により影響 を受け､解離一非解離の平衡がESI におけるイオン化に大きな役割を果たす ことを意味しており､イオン化に新たな知見を加えることが出来た｡ついで､ 遊離型､グリシン並びにタウリン抱合型胆汁酸3-サルフェートなど15種の 1
-∫ LC分離と∴ 生体試料のクリーン･アップ法を工夫し､ L(yESトMS による測 定法を確立するとともに､はじめて尿中のそれらの直接一斉分析に成功し､ 量的変動と病態との関係に検討を加えることができた｡また､胆汁酸3-グル クロニドについても同様に測定法を確立し､尿中3-グルクロニドの直接分析 を行い､病態時におけるそれらの動態を追跡した｡その結果､予想に反して それらの排雅量は3-サルフェートに比し極めて低いことが判明した｡ (2)胆汁酸エステルグルクロニドの生成 胆汁酸3-グルクロニドの体内動態と疾病との関係を論じる上で､その生成 に関与するグルクロニルトランスフェラーゼの性質を把握することが重要と なる｡そこで､各種アミノ酸抱合型胆汁酸を肝ミクロソ-ムとインキュベ-トし､グルクロニド生成の様相をLC/ESI-MSにて調べた｡その結果､遊離 型胆汁酸をインキュベ-トした時にのみ､クロマトグラム上にグルクロニド に相当するピークが観察されたが､3-グルクロニドとはLCにおける保持値が 異なっており､しかも､これらを分取後､アルカリで処理すると遊離型胆汁 酸が検出された｡このことから､生成物の構造は3 位水酸基を介したエーテ ル型のグルクロニドではなく､ 24位カルポキシル基を介したエステル型のグ ルクロニドであることが推測された｡そこでさらに､インキュベ-ト混合物 をアセテート-メチルエステルに誘導後､大気圧化学イオン化(APCI)-MSに おける挙動を標品のそれと比較し､エステルグルクロニドであることを確認 した｡また､胆汁酸とグルクロン酸の結合様式はβであることも判明した｡ 従来､胆汁酸グルクロニドはステロイド核上3α水酸基を介してグルクロン酸 と結合した安定なエーテル型のみと考えられてきたが､今回の事実から､肝 においては2-アリルプロピオン酸系抗炎症薬と同様､エステル型のグルクロ ニドの生成が優先するものと推測される｡ 2-アリルプロピオン酸系抗炎症薬 エステル型グルクロニドは容易に蛋白付加体を生成することが知られており､ 胆汁酸についてもこうした付加体の生成も考えられ興味深い｡ (3)固定化抗体-LC/MSによる光学異性薬物高感度却定システム 分子内に不斉中心を持つ光学異性薬物では､吸収､移行､分布､代謝など
ー 2 -｢ 体内動態が相互に異なることが指摘され､有効性と安全性を確保し､適正な 薬物療法を行う上に､薬物のみならず代謝物をも含めた光学対掌体の一斉分 析法の確立が重要となる｡しかし､光学対草体は化学的､物理的性質が酷似 するばかりか体液中には微量にしか存在せず､とりわけ代謝によって生起し た複数の不斉中心を持つ代謝物を､一つの分離モードによるクロマトグラフ 法で一斉に分離､定量することは困難である｡そこで､低分子抗ハブテン抗 体の特異性が､感作抗原であるハブテン-BSA複合体の構造に依存し､ BSA より立体的に遠い位置をよく認識するというこれまでの知見をもとに､ β-逮 断薬ブプラロールを例に､芳香環側鎖1'位代謝部位を介する蛋白複合体を免 疫原として2 種のキラル特異抗体を作成し､これらが､予想通り不斉中心を よく認識する一方､代謝部位に対しては幅広い親和性を持つことを証明した｡ ついで､これらを固定化し､ R体､ S体の群特異的前処理用器材とするクリー ン･アップ法を設定し､LαESI-MSと組み合わせるハイブリッド型測定法が､ 複数の不斉中心を持つ光学異性薬物の高感度一斉分析に極めて有用なことを はじめて提案した｡ (4)固定化辞兼を用いるReversed Derivatization ESI法はアミノ基､カルポキシル基､スルホン酸基などのイオン性グループ を持つ水溶性極性化合物の測定に威力を発揮し､生体内微量生理活性物質の 動態解析法の柱の一つとなってきている｡しかしながら､本法により効率よ くイオンを生成する化合物は限られており､こうした官能基を持たない中性 化合物をESトMSで高感度に測定するには､固有の官能基を足掛りに解離能 に優れるイオン性原子団の導入による誘導体化-Reversed Derivatization が不可欠となる｡一方､グルクロニルトランスフェラーゼ､スルホトランス フェラーゼ､コリンキナ-ゼに代表される第Ⅱ相薬物代謝酵素は､幅広い基 質特異性を持っており､水酸基を有する化合物を生理的条件下でグルクロニ ド､硫酸､リン酸エステルへと変換する｡したがってこれらを機能性誘導体 化試薬として用いるとき､解離能に優れるイオン性グループの導入が可能と なるばかりか､ESI-MSによって効率よく負イオンを生成しうる結果､高感度 検世の可能なことが期待される｡そこで､ラット肝ミクロソ-ム画分､サイ トソール画分並びにリコンビナントスルホトランスフェラーゼをN-ヒドロキ
- 3 -∫ シスクシンイミド修飾アガロースに固定化し､ β-遮断薬プロプラノロール､ テストステロン及びデヒドロエビアンドロステロンをモデル化合物に取り上 げ､各種誘導体化条件を検討した｡その結果､前2者は､プロプラノロール 及びテストステロンを60%の収率でグルクロニド､リン酸エステルへ､一方､ 後者では定量的にデヒドロエビアンドロステロンをサルフェートに変換し､ これらが機能性誘導体化試薬として有用なことが判明した｡そればかりか､ これら生成物は､ESトMSにおいて分子量に相当する特徴的な負イオン【M-H] を効率よく生成し､ Reversed DerivatizationとLαESI-MSとの組み合わ せカ亨,.水酸基を持つ生体内生理活性物質の高感度分析に大きく役立つものと 結論された｡ (5)リン脂質マトリックスを用いる肝辞素群の固定化に関する基礎的
検討
Immobilized Artificial Membrane (IAM)は､アミノプロピル化した シリカゲル表面にリン脂質(1-mirystoy1-2[13-carboxyl)tridecanoyl-sn-glycerophosphocholine)をグリセロールのC2位に縮合させた長鎖脂肪 酸の0-カルポキシル基を結合させたもので､長鎖炭化水素に基づく疎水部分 を内側に､リン酸エステルより成る親水部分を外側に配している｡このため､ 酵素は緩和な条件下この人工膜の三次元構造の中に性質変化を伴わずに､か つ高い比活性を保持したまま固定化されるものと期待される｡そこで､ラッ ト肝ミクロソ-ム画分をリン酸緩衝液(pH7.4)中IAMゲルとともに､室温 20分間撹拝して固定化酵素を調製し､モデル基質としてエストラジオールを 取り上げ､ 2位水酸化活性に検討を加えた｡その結果､酵素活性は単位体積当 たりの固定化タンパク量の減少とともに比活性が著しく上昇した｡また､固 定化酵素をミニカラムに従填し､ 0.1mMのNADPHを含む100mMトリス -塩酸緩衝液を移動相に用いるフローシステムでは､連続使用に伴う酵素活 性の低下が､空気の注入によって回復されることが判明した｡現在､グルク ロニルトランスフェラーゼ活性の測定を行っており､これらの成果は､薬物 代謝研究システムとして大きく役立つものと期待される｡
- 4 -研究組織一 研究代表者: 後藤 順一(東北大学薬学部 教授) 研究分担者: 池川 繁男` (東北大学薬学部 助教授)
研究軽費
円 円 円 千 千 千 0 0 0 0 0 0 /hU 6 2 4 1 ′0 度 度 年 年 8 9 計 成 成 平平‥研究発表
(1)学会誌1. Shigeo lkegawa, Manabu ltoh, Naoaki Murao, Hiromi Kijima,
Mio Suzuki, Tomoharu Fujiyama, Junichi Goto and Masahiko Tohma:
Immunoaffinity extraction for liquid chromatographic determination of equilin and its metabolites in plasma･
Biomed. Chromatogr., 1 0, 73-77(1996).
2. Toshifumi Niwa, Kazuhiro Fujita, Toko Kasuya, Shigeo lkegawa and
Junichi Goto:
Enzyme immunoassay fわr ursodeoxycholic acid 7 -〟-acetyl一
glucosaminides in human urine.
Anal. Sci. 1 2, 5651568(1996).
3･ Junichi Goto, Hiroya Miura, Masayuki Ando, Yasuhiro Yamato, Shigeo lkegawa, Toshio Nambara and lsao Makino:
A novel enzyme system fわr the reduction of3-0xo bile acids in human red
blood cells.
Steroids, 6 1,4161420(1996).
ー 5 -/
4･ Shigeo lkegawa, Naoaki Murao, Takashi Motoyama, Takamitsu
Yanagihara, Toshifumi Niwa and Junichi Goto:
Separation and detection of bile acid 3-glucuronides in human urine by
liquid chromatography/elgctrospray ionization-mass spectrometry･
Biomed. Chromatogr., 1 0, 313-317(1996).
5･ Shigeo Ikegawa, Takamitsu Yanagihara, Naoaki Murao, Hiroo Watanabe
and Junichi Goto:
Separatory determination of bile acid 3-sulfates by liquid
chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry･
). Mass Spectrometry, 3 2, 401-407(1997).
6. Toshiaki Momose, Jun Maruyama, Takashi lida, Junichi Goto and
Toshio Nambara:
Comparative abilities and optical conditions for β-glycosidase enzymes to hydrolyse the glucuronide, glucoside, and 〟-acetylglucosaminide
coqugates of bile acids.
Biol. Pharm. Bull., 2 0, 828-833(1997).
7. Shigeo Ikegawa, Naoaki Murao, Junji Oohashi and Junichi Goto:
Separatory determination of diastereomeric ibuprofen glucuronides in human urine by liquid chromatography/electrosprey ionization-mass
SpeCtrOmetry･
Biomed. Chromatogr., in press.
8. Shigeo Ikegawa, Kenji Matsuura, Takehiro Sato, Ni Made Ria Isriyanti,
Toshifumi Niwa, Shinichi Miyairi, Hideo Takashina, Youichi Kawashima
and Junichi Goto:
Enantioselective immunoaffinity extraction fb∫ simultaneous
determination of optically active bufuralol and its metabolites in human
plasma by I廿LC･
J. Pharm. Biomed. Anal., in press.
- 6 -∫
9･ Shigeo lkegawa, Takaaki Goto, Hiroo Watanabe and Junichi Goto:
Stereoisomeric bio-inversion of (25R)- and (25S)13α,7α,12α-trihydroxyl 5β-cholestanonic acid CoA/thioesters in rat liver peroxisome･
EnanEiomer, in press.
10･ Norihiro Kobayashi, Hiroyuki Oiwa and Junichi Goto:
Production and characterization of group-specific monoclonal
antibodies recognlZlng nOn amidated glyclne- and taurine-amidated
ulSOdeoxycholic acid 7lN-acetyl glucosaminides.
J･ Steroid Biochem･ Molec･ Biol･, in press･
1 1 ･ Junichi Goto, Naoaki Murao, Chifumi Nakada, Takashi Motoyama,
Takamitsu Yanagihara, Toshifumi Niwa and Shigeo lkegawa:
Separation and characterization of carboxyHinked glucuronides of bile
acids in incubation mixture of rat liver microsomes.
Steroids, in press.
12･ Junichi Goto, Naoaki Murao, Junji Oohashi and Shigeo Ikegawa:
Synthesis of bile acid 24-acyl glucuronides.
Steroids, in press. (2)口頭発表 1.村尾尚昭､池川繁男､後藤順一:ラット肝ミクロソ-ムにおける胆汁酸24位エステ ルグルクロニドの生成 1996年3月:日本薬学会第116年会(金沢) 2.後藤貴章､渡辺博夫､池川繁男､後藤順一:ラット肝ベルオキシソ-ムにおけるC27 胆汁酸β酸化の基質選択性 1996年3月:日本薬学会第116年会(金沢)
3･ Shigeo Ikegawa, Naoaki Murao, Takashi Motoyama, Takamitsu
Yanagihara, Toshifumi Niwa and Junichi Goto : Liquid Chromatographic
Separation of Glucuronides of Bile Acids Combined with Mass
- 7 -∫
Spectrometric Detection.
1996年8月: Seventh international Symposium on Pharmaceutical and
Biomedical Analysts 4.池川繁男､山口 聡､後藤順一:固定化サイトゾルを用いるLC/MS用検出指向誘導 体化法の開発 1996年9月:日本分析化学会第第45年会(仙台) 5.石川浩士､大岩弘幸､渡辺博夫､後藤貴幸､池川繁男､後藤順一:ラット肝ミクロソ TムにおけるC27胆汁酸アデニレートの生成 1997年3月:日本薬学会第117年会(東京) 6.村尾尚昭､大橋潤二､池川繁男､後藤順一:LC/MSによるイブプロフェンエステル グルクロニドの測定 1997年3月:日本薬学会第117年会(東京) 7.佐々木晃､池川繁男､後藤順一: C29胆汁酸の合成とLC/APCLMSにおける挙動 1997年3月:日本薬学会第117年会(東京) 8.池川繁男:薬物代謝研究における固定化抗体の利用 1997年4月:日本薬物動態学会第11回ワークショップ(東京) 9.村尾尚昭､大橋潤二､山本千文､池川繁男､後藤順一:胆汁酸24-エステルグルクロ ニドのLC/MSにおける挙動 1997年6月:第4回クロマトグラフィーシンポジウム(仙台) 10.大橋潤二､村尾尚昭､山本千文､池川繁男､後藤順一:ラット肝ミクロソ-ム画分に おける胆汁酸24-エステルグルクロニドの生成 1997年6月:第17回東北胆汁酸研究会(盛岡) ll.池川繁男:ハイフアネテッド･マススペクトロメトリーにおける生体試料中薬物のク リーンナップ法 1997年7月:第24回BMSコンファレンス(京都) 12.村尾尚昭､大橋潤二､山本千文､池川繁男､後藤順一:LC/MSによる胆汁酸及びイ ブプロフェンエステルグルクロニドの測定
- 8 -∫ 1997年8月:第12回生体成分の分析化学シンポジウム(広島) 13.後藤貴章､渡辺博夫､池川繁男､後藤順一:肝ベルオキシソ-ムにおけるC27胆汁 酸25位生体内異性化 1997年12月:第19回胆汁酸研究会(大阪) 14.後藤順一:質量分析法の新展開 1998年2月:第10回21世紀の薬学を探る京都シンポジウム(京都) 15.池川繁男､北田泰崇､後藤順一､永田 清､山添 康:固定化リコンビナントスルホ 羊ランスフェラーゼを用いるReversed Derivatizationに関する基礎的検討 1998年3月:日本薬学会第118年会(京都) 16.後藤貴幸､池川繁男､後藤順一:C27胆汁酸24､ 25位脱水素反応におけるラット 肝アシルCoAオキシダーゼの基質選択性 1998年3月:日本薬学会第118年会(京都) 17.村尾尚昭､大橋潤二､酒井美保子､池川繁男､後藤順一: MALDI-TOFMSによる胆 汁酸一蛋白付加体生成の測定 1998年3月:日本薬学会第118年会(京都) 18.大橋潤二､村尾尚昭､池川繁男､後藤順一:LC/ESLMSによる胆汁酸24-アシルグ ルクロニドの測定 1998年3月:日本薬学会第118年会(京都) 19.石川浩士､池川繁男､後藤順一､古崎輝也､後藤田正晴､浅川直樹:ラット肝ミクロ ソ-ムにおけるコール酸アデニレートの生成 1998年3月:日本薬学会第118年会(京都) 20.飯田さやか､鈴木恵真子､中込まどか､松木容彦､小野 宏､池川繁男: V79細胞微小管ネットワークに対する合成エストロゲン誘導体の作用 1998年3月:日本薬学会第118年会(京都) 論文別刷
- 9 -TOUR ： Tohoku University Repository コメント・シート 本報告書収録の学術雑誌等発表論文は本ファイルに登録しておりません。なお、このうち東北大学 在籍の研究者の論文で、かつ、出版社等から著作権の許諾が得られた論文は、個別にTOUR に登録 しております。 TOUR http://ir.library.tohoku.ac.jp/
