C 型肝炎ウイルス レプリコン系
榎 本 信 幸
山梨大学医学部内科学講座第一教室，大学院医学工学総合研究部 要 旨： C 型肝炎ウイルス（hepatitis C virus, HCV）による慢性肝炎は，年間 3 万 5,000 人が死亡 する日本の肝癌の原因の 80 ％を占めている。インターフェロンを機軸とする治療法の進歩により 最近では約 3 分の 2 の患者で HCV の排除が期待できる時代となったが，依然として難治性の症例 が多数存在し新たな治療法の開発が待望されている。これまで HCV はヒトおよび霊長類の肝臓内 でしか増殖せず研究の大きな障害となってきたが，培養細胞内で HCV 増殖過程を再現する HCV replicon の開発により画期的な知見が得られるようになった。HCV replicon を用いて，HCV 増殖 を制御するウイルス側因子，細胞側因子，ウイルスに対する生体反応，あるいはインターフェロン 抵抗性を解析することにより，これらを標的とする治療法の研究開発が進展している。 キーワード C 型肝炎ウイルス，レプリコン，インターフェロン，分子シャペロン，自然免疫 1．HCV replicon の開発 C 型肝炎ウイルスは，発見以来 10 年間，培 養細胞内での増殖系の開発が試みられてきた が，再現性のある結果は得られなかった。ヒト およびチンパンジーの肝臓内でしか増殖しない ため，その詳細な増殖機構とその制御法を分子 生物学的に解析することは困難であった。1999 年ドイツの Bartenschlager らは，HCV の構造 蛋白遺伝子を neomycin 耐性遺伝子に置換した HCV 遺伝子を作成1），これを培養肝癌細胞で ある Huh7 細胞内に導入し neomycin で選択す る こ と に よ り ， 培 養 細 胞 内 で 自 律 増 殖 す る HCV replicon 系を作成，さらに，NS5A 領域に adaptive mutation とよばれる特異な遺伝子変 異を持つ HCV replicon が非常に効率よく培養 細胞内で増殖することが判明し2），安定した培 養細胞内での HCV 増殖系が実現した。以来， この系を用いて HCV の生物学についての研究 が爆発的に進展している。 2．HCV 増殖に関わるウイルス側因子 HCV 遺伝子には蛋白翻訳を制御する 5’UTR （untranslated region）および遺伝子複製を制 御する 3’UTR の間に 3 種の構造蛋白（core, en-velope-1, envelope-2） と 7 種 の 非 構 造 蛋 白 （p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B）をコ ードする領域があり，臨床的には多様な変異が 認められる。 HCV replicon 系は現在，非構造蛋白のみで 構成されており，構造蛋白の増殖に対する影響 を検討することはできない。構造蛋白を含む replicon も作成されており3），core 蛋白は発癌に，envelope 蛋白は interferon signal 伝達に影 響を与えるという単独発現実験の知見につい て，HCV replicon 増殖系においてもそのよう な効果が見られるかを今後，検討する必要があ る。 〒 409-3898 山梨県中巨摩郡玉穂町下河東 1110 受付： 2004 年 6 月 1 日 受理： 2004 年 7 月 15 日
総 説
5’UTR，3’UTR は臨床的には変異の少ない部 分であり，機能的に重要な増殖に必須の部位と 考えられてきた。HCV replicon 系によってこ れがはじめて実証され，5’UTR は HCV 蛋白翻 訳開始に必須であるとともに，これを抑制する エレメントの存在も明らかとなった4）。また，
3’UTR は variable region，polyU，X-tail からな るがいずれもが HCV-RNA の複製開始に必須で あることが示され5），3’UTR に必要な塩基の詳 細な解析も可能となった6）。 NS3 は HCV 蛋白の processing を行う pro-tease であり，NS3 末端の threonine 残基など の切断モチーフの保存が HCV 増殖に必須であ ることが replicon 系により示されている7）。 NS3 については，種々の protease inhibitor が 抗 HCV 薬として開発されていること，そして 後述のように NS3 によって自然免疫に関与す るシグナル伝達分子が切断される結果，HCV の持続感染が成立する可能性が示されたことが 注目される8）。 NS5A に つ い て は replicon 増 殖 に 必 要 な HCV 遺伝子の adaptive mutation の集積部位で もあり HCV replicon に特徴的変異が認められ るが，in vivo ではこれらの変異は HCV 増殖に 対して抑制的に働きその臨床的意義は不明であ る2）。NS5A 蛋白は種々の tyrosine kinase（Hck,
Lck, Lyn, Fyn）の SH3 domain と結合し，その 活 性 を 調 節 し て い る こ と が 示 さ れ9 ）， ま た
NS5A が PI3kinase の SH3 domain に結合して， PI3K を活性化し抗 apoptosis 作用を示すことが 報告されている10）。NS5A はアミノ末端で小胞 体 膜 に anchor さ れ て お り1 1 ）， こ の 構 造 は replicon 増殖に必須である。NS5A と NS5B の 相互作用が HCV replicon 増殖に必須であるこ とも示された12）。しかし，依然としてこれら の知見は断片的であり，NS5A 蛋白の機能の全 貌は未だ明らかとはなっておらず，臨床的には HCV 増殖を減弱させる NS5A 変異が，replicon 系では増殖を促進しており，NS5A が HCV 増 殖においていかなる役割を持っているのか解明 されていない。NS5A 蛋白が HCV 増殖の中心 にあり，生体内の正常肝細胞と replicon が増 殖する培養肝癌細胞での細胞側因子の相違が NS5A の adaptive mutation の作用の差異をもた らしていると想定され，今後の研究の焦点と考 えられる。 NS5B は RNA polyemerase であり，NS5B に ついても HCV 増殖に重要な残基のマッピング が replicon 系により可能となった13）。特に，C 末端側の NS5B と膜を結合する領域の 21 アミ ノ酸は増殖に必須である14,15）。 HCV の遺伝子型によりその増殖や治療反応 性が大きく異なることは周知の事実であるが， いかなる機序によるのかはこれまでほとんど明 らかではなかった。異なる遺伝子型の間でのア ミノ酸相同性は 80 ％程度であり，どの蛋白の 性質の違いによって臨床像に違いが生じるかを 明らかとすることはこれまで不可能であった。 最近，HCV-1b のみならず，1a16,17）あるいは 2a18）などの異なる遺伝子型の HCV replicon が 作成され，遺伝子型の違いによる治療反応性の 違いがいかなるウイルス蛋白機能によるのかを 明らかとすることが可能になると期待される。 3．HCV 増殖に関わる細胞側因子 HCV replicon 系により培養細胞内で増殖す る HCV に必要な細胞側因子についての検討も 可能となった。HCV replicon 増殖は細胞増殖 と関連しており，対数増殖期にある培養細胞内 で増殖が亢進する19）。これは何らかの細胞周 期に関連した因子が必要であることを示してい るが，実際の肝炎肝臓内の細胞周期と HCV 増 殖がいかなる関係にあるか検討が必要である。 HCV replicon 増殖は membrane raft と呼ば れる小胞体膜が窪んだ compartment 内で行わ れていることが示され，小胞体膜蛋白である caveolin あるいは hVAP33 と非構造蛋白との相 互 作 用 も 検 討 さ れ て い る20–22）。 こ の よ う な
HCV replicon 増殖は小胞体（endoplasmic retic-ulum, ER）上で行われることから，ER stress23）
し，蛋白質の正常の折りたたみに必要な分子シ ャペロン蛋白の転写を活性化する。後述するよ う に HCV replicon 増 殖 抑 制 効 果 を 示 す cy-closporin24,25）は分子シャペロンの阻害剤であ り，新たな HCV 増殖制御の target となる可能 性がある。 当初，HCV replicon は培養肝癌細胞株であ る Huh7 細胞内でのみ増殖したが，これ以外の 細胞株で増殖する HCV replicon も作成され， これらは特有の adaptive mutation を持ってい る 。 Huh7 細胞以外の細胞で増殖する HCV replicon の開発は HCV 増殖に必要な細胞因子 の解明につながると考えらる26,27）。 4．HCV に対する生体反応 HCV は一本鎖の RNA virus であるが，複製 中間体として 2 本鎖 RNA が細胞内に出現する と想定される。現在，注目されている Toll-like receptor（TLR）などを介する自然免疫はこれ らの病原体特異的な構成成分を認識して細胞内 に IRF，NF-kB などを介して炎症性シグナルを 送る。HCV では，NS3 protease が TLR 下流の シグナル伝達分子を切断することにより，この ような自然免疫反応を抑制して HCV 増殖を可 能とするシステムが明らかとなっている8）。実 際 ， DNA microarray を 用 い た 解 析 で HCV replicon 細胞では interferon 誘導遺伝子の変動 が少ない28）ことが明らかとなっており，HCV replicon は上述のように何らかの抗ウイルス作 用を回避するメカニズムを持っていることが示 唆されている。 HCV による発癌に関しては，これまで，発 癌に関与している HCV 蛋白は core 蛋白が主体 であると考えられているが，core 蛋白を発現 する HCV replicon は開発されているものの3） これを用いた詳細な検討はほとんどなされてい ない。core 蛋白はアポトーシス，ミトコンド リア機能，脂質代謝，シグナル伝達などさまざ まな肝細胞の機能障害を来して，炎症，発癌を 修飾していると考えられているが，これまでの 実験はすべて，core 蛋白質の単独発現系でな さ れ て お り ， こ れ ら の 成 績 を 構 造 蛋 白 発 現 HCV replicon 系で再検討することが core 蛋白 の生体内での病原性を解明する上で必須と考え られる。同様に envelope 蛋白の作用について も，HCV replicon においてはほとんど解明さ れていない。特に，HCV 粒子の生成過程ある いは感染過程は HCV についてはまったく未知 であり，培養細胞内で効率よく増殖する HCV 全 遺 伝 子 を 含 ん だ 配 列 を も つ 構 造 蛋 白 発 現 replicon による解析が期待される。 細胞側の HCV replicon 増殖に対する反応と して，HCV 感染肝臓内と同様に酸化ストレス 反応が認められ，活性酸素は HCV replicon に 対しては抑制的に働く29）。NS5A 蛋白が酸化ス トレスを介して NF-kB を誘導するという知見 に関しても replicon system を用いて確認され ている30）。 新たな知見として，HCV replicon 増殖細胞 では HLA 分子の細胞表面への表出が低下して いるとの報告もなされている31）。一方，HCV replicon 増殖細胞と HLA を一致させた CTL を 用いて細胞障害性を in vitro で検討可能である と の 成 績 も あ り32）， HCV replicon を 用 い た HCV に対する免疫反応の解析はさらに検討が 必要である。 5．HCV の増殖制御メカニズム 臨床的には C 型慢性肝炎は interferon で HCV が排除され治癒するものから，全くウイ ルス量の減少しない難治性のものまで様々であ るが，この反応の多様性は十分に検討されてい ない。HCV replicon は interferon に対する感 受性が高く33），少量の interferon でもその増殖 は著明に減弱する。HCV replicon 増殖に必須 の NS5A 変異は臨床的には interferon 感受性亢 進と関連しており34），HCV 増殖あるいは inter-feron 抵抗性に深く関わっているものと考えら れる。Interferon の HCV replicon 抑制作用に 関しては DNA microarray を使用して
interfer-on 誘導蛋白 6–16，STAT3 などが重要であるこ とが示されている35）。Interferon-gamma も HCV 増殖抑制作用が認められ36），IL-1 が ERK 活性化を介して HCV replicon 増殖を抑制する ことも報告されている37）。一方，TNF-alpha は HCV replicon 抑 制 効 果 は な く ， 種 々 の cy-tokine がいかなる effector 分子の活性化により どのように HCV 増殖を抑制しているかを明ら かとすることが重要である。 飲酒は C 型慢性肝炎進展の risk factor である が，HCV replicon においても ethanol は NF-kB 活性化を介して HCV replicon 増殖を促進し，in-terferon の効果を阻害することが示されている38）。 6．HCV 治療法の開発への応用 HCV replicon 系の開発により HCV 治療薬の 開発にも拍車がかかっている。種々の化合物の 抗 HCV 効果の screening が容易になった。特 に ， NS3 protease 阻 害 薬19,40,41）お よ び NS5B polymerase 阻害薬42）の開発は大きく進行して いる。HCV replicon は protease 阻害薬43）の耐 性変異の in vitro での同定にも利用可能である。 Ribavirin と interferon の相乗作用が ribavirin の HCV 遺伝子変異促進効果によることは， ribavirin の耐性機構の解明，治療効果の向上の ために有用な情報となる44）。さらに，HCV-1a の ribavirin の耐性変異として NS5B の変異が同 定され，replicon を用いて ribavirin に対する感 受性の低下が示されている45）。今後，ribavirin の臨床効果と HCV 遺伝子変異との関連が臨床 データおよび replicon での検証の両面から明 らかとなることが期待される。 Replicon を利用して新たな核酸アナログの 開発も行われ46,47），またアザチオプリン48），多 価不飽和脂肪酸にも HCV 増殖抑制効果がある ことが指摘されている49）。今後も HCV 増殖抑 制効果を示す化合物は次々に見つかると考えら る。例えば，免疫抑制剤 cyclosporin の HCV 抑 制効果が複数のグループから報告されており， cyclophilin などの HCV 蛋白の folding に必須 の分子シャペロンを標的とした治療への展開が 期待される24,25）。
さらに，HCV replicon は siRNA （short in-terfering RNA）などの新たな遺伝子治療の開 発応用を可能にした50–53）。siRNA は短い 2 本鎖 RNA を利用した配列特異的な RNA 破壊作用で あり，HCV のような RNA ウイルスに対しては 特に有効と想定され，HCV の増殖を非常に有 効に抑えることができる。 7．ま と め 本稿では HCV replicon 系の開発によって明 らかとなった，HCV 研究の新たな展開を中心 に述べた。2000 年以来，HCV replicon を用いた 研究は既に150 編以上の論文となっており，HCV replicon を用いた研究により HCV の基礎研究 は今後も急速に進展するものと考えられる。 文 献
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