― 原 著 ―
学 童,中
・高 校 生 の 鉄 欠 乏 性 貧 血 ス ク リ ー ニ ン グ に
お け るhematofluorOmeterを
用 い たzinc
protoporphyrin測
定 の 有 用 性
右田
真 ・福永
慶隆 ・山本正
生
日本医科大学小児科学教室The measurement of zinc protoporphyrin for iron deficiency anemia by hematofluorometer in children
Makoto Migita, Yoshitaka Fukunaga and Masao Yamamoto Department of Pediatrics, Nippon Medical School
Zinc protoporphyrin (ZPP) is generated in the erythrocytes of patients with lead toxication and iron deficiency anemia by the incorporation of zinc instead of ferrous iron into protoporphyrin. Although the measurement of ZPP has been thought to be a potential screening test for evaluating iron deficiency, no simple and reliable ZPP assay method has been available until recently. A newly developed hematofluorometer allows us to quickly determine the level of ZPP in a drop of unprocessed whole blood. In this study, we measured the concentration of ZPP in 732 children including 22 patients with iron deficiency anemia using this
hematofluorometer. The cut off value of whole blood ZPP in children was determined to be 38.2 μg ZPP/dl
whole blood. The level of ZPP showed a good negative correlation with the concentration of hemoglobin. The specificity and the sensitivity of this assay were 97.2% and 81.8%, respectively. These results indicate that this ZPP assay using the newly-developed hematofluorometer is a practical way to screen for iron deficiency anemia.
Key words: zinc protoporphyrin, hematofluorometer, iron deficiency anemia
緒 言 近 年,予 防 医 学 的 面 さ らに は よ り高 い レベ ル の 健 康 状 態 の 確 保 を志 向 して,小 児保 健,学 校 保 健 領 域 で,種 々の マ ス ス ク リー ニ ン グが 本 邦 で も行 わ れ る よ うに な った.そ の 中 で 貧 血 の マ ス ス ク リー ニ ン グ は 未 だ そ の 途 に つ い た ば か りで あ る が,そ の 対 象 の 多 くは 中 学・ 高校 生 の いわ ゆ る思 春 期 鉄 欠 乏 性 貧 血 に 対 す る もの で あ る.し か し, わ が 国 の 鉄 欠 乏 性 貧 血 ス ク リー ニ ン グの 判 定 基 準 は い まだ 明 確 に は 設 定 され て い な い.本 邦 小 児 科 領 域 で の貧 血 と して 最 も多 い鉄 欠 乏 性 貧 血 につ い て,現 在 ま で 一 般 診 療 の 場 で 生 体 に お け る 鉄 代 謝 を 評 価 す る パ ラ メ ー タ ー と し て 赤 血 球 数(RBC), ヘ モ グ ロ ビ ン(Hb),ヘ マ トク リ ッ ト(Ht),平 均 赤 血 球 容 積(MCV),平 均 赤 血 球 血 色 素 量 (MCH),平 均 赤 血 球 血 色 素 濃 度(MCHC)に 加 え, 血 清 鉄(serum iron, SI),総 鉄 結 合 能(total iron binding capacity, TIBC), transferrin飽 和 率 (transferrin saturation, TS, (SI/TIBC)× 100%),血 清ferritin (serum ferritin, SF)が 用 い ら れ て お り,プ ロ トポ ル フ ィ リ ン は あ ま り用 い ら れ て い な い.赤 血 球 プ ロ トポ ル フ ィ リ ン は,ヘ ム 生 合 成 の 最 終 過 程 に 認 め ら れ る 中 間 生 成 物 で あ り,赤 芽 球 や 網 状 赤 血 球 内 の ミ トコ ン ド リ ア に 存 在 す る フ ェ ロ ケ ラ タ ー ゼ に よ っ て 鉄 原 子 の 挿 入 を 受 け,ヘ ム と な る.鉄 欠 乏 性 貧 血,鉛 中 毒 に お い Correspondence to Makoto Migita, Department of
Pediatrics, Nippon Medical School First Hospital, 3-5-5 Iidabashi, Chiyoda-ku, Tokyo 102, Japan
て赤 血 球 中 の プ ロ トポ ル フ ィ リンが 増 加 す る こ と は,い くつ か報 告1∼7)され て い る.し か し,従 来 の 方 法 で の 測 定 に は大 量 の検 体 と煩 雑 な操 作 を 必 要 とす るた め に,一 般 の 臨 床 検 査 と して は制 約 が あ った. 今 回,我 々は,当 初 鉛 中毒 に よ る貧 血 の ス ク リー ニ ン グに 用 い られ た微 量 の 全血 検 体 で 測 定 が 可 能 で,し か も操 作 が簡 便 で あ るhematofluorometer を 用 い,亜 鉛 プ ロ トポ ル フ ィ リン(zinc protopor-phyrin, ZPP)を 測 定 し,既 存 の 測 定 方 法 との 比 較 を 行 っ た.ま た,小 児 にお け る正 常 値 を設 定 し, さ ら に 鉄 欠 乏 性 貧 血 ス ク リー ニ ン グ の パ ラ メ ー タ ー と して の有 用 性 に つ い て検 討 した の で報 告 す る. 研 究 対 象 お よ び方 法 (1) 対 象 1) Hematofluorometerと 既 存 の方 法 で あ る高 性 能 液 体 ク ロマ トグ ラ フ ィ ー法7,8)(HPLC法)と の測 定 値 の比 較 は,後 述 す るWHOの 鉄 欠 乏 性 貧 血 を示 唆 す る指 標,す なわ ちHb, MCHC, SI, TS, さ ら にTIBC, SFを 加 え,鉄 欠 乏 性 貧血 を認 め な い22∼37歳 の 健 常 成 人10名(男 性4名,女 性6 名,い ず れ も医 療 従 事 者 で鉛 な どの重 金 属 へ の曝 露 の な い東 京 お よ びそ の近 郊 に往 ん で い る者)に お い て 施 行 した. 2) 本 測 定 法 に よ るZPPの 正 常 値 の 設 定 に は, 小 児 の 貧 血 の ス ク リー ニ ン グ の ため に集 団 貧血 検 査 を 受 け た 静 岡県 沼 津 市 の小 児 を対 象 と した.そ の 内 訳 は 小 学 校4年 生209名(男 子99名,女 子 110名),中 学 校2年 生166名(男 子81名,女 子85 名),高 校1年 生350名(男 子143名,女 子207名) で あ る.さ らにZPPの 鉄 欠 乏 性 貧 血 に 対 す る パ ラ メ ー タ ー と して の 有 用 性 につ いて の検 討 は集 団 貧血 検 査 を 受 け た 小 児 に加 え,当 科 を受 診 した鉄 欠乏 性 貧血 の 高校 生 男 子1名,女 子6名 を対 象 と した. (2) 方 法 1) ZPP 検 体 は 静脈 採 血 し,2K-EDTAを 加 え た全 血 検 体 を50μlを 使 用 した.Hematofluorometerは,
Fig. 1 Schematic diagram of the system of hematofluorometer
HELENA研 究 所 よ り提 供 さ れ たPROTOFLU-OR-Zを 使 用 し た.本 法 はPROTOFLUOR-Z Ope-rator's Manualに 従 い10),全 血 検 体50μlを カ バ ー グ ラ ス に 滴 下 し てPROTOFLUOR試 薬100 μlを 加 え,よ く混 和 す る.こ れ に よ り赤 血 球 内 の ZPPを 抽 出 し,415nmの 波 長 で 励 起 さ せ,595 nmで の 螢 光 強 度 を 測 定 す る も の で あ る(Fig. 1).な お,測 定 に あ た り,2種 のZPPの キ ャ リ ブ レ ー タ ー(40,86μgZPP/dl whole blood)を 用 い て 校 正 し た.こ の 際,測 定 さ れ た 実 測 値 はHt 値 を42%に 想 定 し て い る た め,以 下 の 式 で 換 算 し た. 換 算 値(μg ZPP/dl whole blood)= 実 測 値(μg ZPP/dl whole blood) ×検 体 のHt値/42 HPLC法 に よ るZPPの 測 定 は,Evanceら8)の 方 法 に 従 い 施 行 し た. 2) 末 梢 血 一 般 血 球 算 定 EDTA-2K加 静 脈 血 を 使 用 し,自 動 血 球 算 定 装 置,シ ス メッ ク スE3000に て 測 定 し た. 3) SI, TIBC, TS, SF 自 動 分 析 装 置,日 立736を 用 い 比 色 法11)に て SI,不 飽 和 鉄 結 合 能(unsaturated iron-binding capacity, UIBC)を 測 定 し た.TIBCはUIBC+ SIで,TSは(SI/TIBC)×100%で 算 出 し た.SF は ダ イ ナボ ッ トIMxを 用 い てEIA法12)に て 測 定
4) 各 パ ラメ ー タ ーの 基 準 値 に つ いて 鉄 欠 乏 性 貧 血 の 定 義 は,必 ず し も普 遍 的 な も の とな っ て い るわ けで は な い が,Hb, MCHC, SI, TSに つ い て は,WHOの 鉄 欠 乏 性 貧 血 を 示 唆 す る指 標13)に従 い,Hbは 小 学4年 生,中 学2年 生, 高 校1年 生 の 女 子 で は12g/dl未 満 を異 常 と し, 高 校1年 生 男 子 は13g/dl未 満 を 異 常 と し た. MCHCは31%未 満 を,SIは50μg/dl未 満 を,TS は15%未 満 を,TIBCは400μg/Fe/dl以 上 を異 常 と した.SFは 報 告 に よ りか な り幅 が あ るが,今 回 は教 室 の 守 田7)の報 告 に 従 い,比 較 的 厳 格 な10 ng/ml未 満 を異 常 と した.鉄 欠 乏 性 貧 血 の診 断 基 準 はHb, MCHCがWHOの 指 標 を 満 た し,さ ら にSI, TS, TIBC, SFの うち2つ 以 上 を満 たす も の と した. 結 果 1. HematofluorometerとHPLC法 に よ る ZPP測 定 値 の 比 較 検 討(Fig. 2) Hematofluorometerに よ る測 定 値 とHPLC法 に よ る測 定 値 に お い て,相 関 係数r=0.885,有 意 確 率p<0.05,と 有 意 な 相 関 を 示 し,回 帰 式 はy= 1.28x-10.1で あ っ た. 2. 学 年 男 女 別 グ ル ー プ の 各 パ ラ メ ー タ ー の 平 均 値(Table 1)と 貧 血 者 の 頻 度(Table 2) 各 パ ラ メ ー タ ー の 平 均 値 お よ び 標 準 偏 差 を Table 1に 示 し た.ま た,Table 2に 示 す よ うに, 小 学4年 生 の3.3%(男 子2.0%,女 子4.5%),中 学2年 生 の1.8%(男 子1.2%,女 子2.3%),高 校 1年 生 の4.3%(男 子0.7%,女 子6.8%)に 貧 血 を 認 め,高 校1年 生 の 女 子 が 最 も頻 度 が 高 か っ た. そ の うち,前 述 の 鉄 欠 乏 性 貧 血 の 診 断 基 準 を 満 た す も の は 小 学4年 生 で は 女 子1名,中 学2年 生 で は 男 子1名,女 子2名,高 校1年 生 で は 女 子 が11 名 で,延 べ15名 で あ っ た. 3. ZPPの 正 常 値 の 設 定 検 討 の 対 象 をWHOの 指 標 に よ り,貧 血 を 認 め な い 小 学4年 生202名,中 学2年 生163名,高 校 1年 生335名 延 べ700名 と し て,ZPP値 の 分 布 に 点 検 を 施 行 し た と こ ろ,対 数 変 換 値 が 正 規 分 布 に
Fig. 2 Correlationship between ZPP levels determined by hematofluorometer
Table 1 Average values of hematological parameters in age and sex groups
Table 2 Incidence of low Hb concentration
従 う こ とが示 唆 され た.そ こで対 数 変 換 を 施 した 変 換 値 のmean±2SD以 下 を 正 常 範 囲 と し,ZPP の 正 常 値 を38.2μg ZPP/dl whole blood未 満 と 設 定 した. 4. 鉄 欠 乏性 貧血 の程 度 とZPP値 の 相 関(Fig. 3) 本 論 文 で の 鉄 欠 乏 性 貧 血 群 は集 団貧 血 ス ク リー ニ ン グ に お いて 鉄 欠 乏 性 貧 血 と診 断 さ れ た15名 に 加 え当 科 を 受 診 した 鉄 欠 乏 性 貧 血 の 高校 生 男 子 1名,女 子6名 の 延 べ22名 と した.Fig. 3の よ う
Fig. 3 Correlationship between ZPP level and Hb concentration に,相 関 係 数r=-0.748, p<0.001で 負 の 相 関 を 示 し,回 帰 式 はy=-15.3x+219.6で あ っ た. 5. 鉄 欠 乏 性 貧 血 者 に お け る 各 パ ラ メ ー タ ー 間 の 相 関(Table 3) こ の 検 討 の 対 象 と な っ た 集 団 は22名 の 鉄 欠 乏
Table 3 Correlation coefficients within pairs of hematological parameters with iron deficiency anemia
Table 4 Sensitivity and specificity for iron deficiency anemia 性 貧 血 群 で あ る.ZPPはHb, TSと の 間 に 負 の相 関 が 認 め られ た が,SFと の 相 関 は 認 め られ な か っ た.p<0.001の 高 い 相 関 性 が 認 め られ た の は,ZPPとHb, TIBCとSF, SIとTSの 間 で あ う た. 6. ZPPの 鉄 欠 乏 性 貧 血 に対 す る特 異 度 と敏 感 度(Table 4) こ の 検 討 の 対 象 と な っ た 集 団 は 集 団 貧 血 ス ク リー ニ ン グを 受 けた725名 を受 診 した 鉄 欠 乏 性 貧 血 の7名 を 加 えた 延 べ732名 と し,今 回 の 基 準 値 で の 鉄 欠 乏 性 貧 血 に対 す る各 パ ラ メ ー タ ーの 特 異 度 と敏 感 度 を 検 討 した. 結 果 は,特 異 度 に関 して は,ZPPが97.2%と 最 も優 れ て い た.敏 感 度 に 関 して はSFが95.4%と 最 も優 れ,ZPPは81.8%で あ った. 考 案 今 回 の 集 団 貧 血 ス ク リー ニ ング に お け る 貧血 者 の 頻 度 は,中 学2年 生 男 子 が1.2%,女 子 が2.4%, 高 校1年 生 男 子 が0.7%,女 子 が6.8%で あ った. 以 上 の 結 果 を 諸 家14∼17)の小 児 を 対 象 と した 集 団 貧 血 検 査 の 報 告 と とも にTable 5に 示 した.こ れ らの 結 果 は,測 定 方 法 が 同一 で な い こ と,栄 養 状 態 に 地 域 差 が あ る こ とな どを 考 慮 しな けれ ば な ら ない が,植 田14)の報 告 と比較 す る と貧 血 の頻 度 は, 減 少 して お り,わ が 国 の 栄 養 状 態 が 充 実 し普 遍 化 しつ つ あ る こ とに起 因 して い る と思 わ れ た. 鉄 欠 乏 性 貧 血 は,生 体 に お け る鉄 の供 給 と需 要 の バ ラン スが 種 々の 原 因 で くず れ,負 に傾 く こ と で 出現 す る病 態 とされ て い る.臨 床 症 状 と して は, そ の 病 期 が 進 行 し完 成 され る と,顔 色 不 良,動 悸, 息 切 れ,頭 重 感,易 疲 労 性 な どが 出現 し,血 液 検 査 で は,小 球 性 低 色 素 性 貧 血 を認 め る.し か し, 鉄 欠 乏 性 状 態 が,す ぐに特 徴 的 な小 球 性 低 色 素 性 貧 血 を呈 す る訳 で は な く,進 行 の過 程 と して一 般 に,下 記 の ご と く3期 に分 け られ る. (1) 第1期(鉄 消耗 期);SFな どの貯 蔵 鉄 が 減 少 す る時 期.
Table 5 Incidence of iron deficiency anemia at the mass-screening test for anemia in adolescents
(2) 第2期(貧 血 を 伴 わ な い 鉄 欠 乏 期);SIや TSが 低 下 し,TIBCが 上 昇 す る 時 期. (3) 第3期(貧 血 を 伴 う鉄 欠 乏 期);小 球 性 低 色 素 性 貧 血 が 出 現 す る 時 期. 第1, 2期 は 潜 在 性 鉄 欠 乏 状 態 と 呼 ば れ る.鉄 欠 乏 状 態 に お け る プ ロ トポ ル フ ィ リ ン の 上 昇 は, 鉄 供 給 の 不 足 に よ り二 次 的 に 生 じ,第3期 に な り 上 昇 す る と い わ れ て い る18,19). ポ ル フ ィ リン 体 は,ヘ ム 生 合 成 過 程 の 中 間 生 成 物 で,4個 の ピ ロ ー ル が,環 状 に 結 合 し た テ トラ ピ ロ ー ル で あ り,プロ トポ ル フ イ リ ン は,ヘ ム へ の 最 終 中 間 生 成 物 で 鉄 と錯 塩 を 形 成 し て ヘ ム と な る19,20).鉄欠 乏 性 貧 血 に お い て は,プ ロ トポ ル フ ィ リ ン が 鉄 と 結 合 し て ヘ ム に な る と こ ろ で 鉄 が 不 足 し て い る た め に,ヘ ム 生 合 成 が 成 さ れ ず 鉄 の 代 わ りに 亜 鉛 と錯 塩 を 形 成 しZPPと な り,ZPPを 有 す る 赤 血 球 が 増 加 す る19∼21). ポ ル フ ィ リン 体 は,一 部 の ポ ル フ ィ リア 症 を 除 い て は,大 半 が 赤 血 球 中 に 存 在 し て お り鉄 欠 乏 性 貧 血 で は,そ の う ち の99%以 上 が,プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン で あ る22,23).プ ロ トポ ル フ ィ リ ン に は, ZPPと 遊 離 型 プ ロ トポ ル フ ィ リ ン と が あ る が,健 常 人,鉄 欠 乏 性 貧 血 患 者 に お い て は,全 体 の90% 以 上 がZPPと し て 存 在 し,赤 血 球 寿 命 が 続 く 限 り安 定 し て い る と さ れ て い る21,24). プ ロ トポ ル フ ィ リ ン の 定 量 は 以 前 よ りHPLC 法8,9)と螢 光 測 定 法25,26)が用 い ら れ て い る が,前 者 は ポ ル フ ィ リ ン 体 の 分 画 の 測 定 が 可 能 で あ る が, 大 量 の 検 体 と 煩 雑 な 操 作 を 必 要 と し た.後 者 は, ポ ル フ ィ リ ン 体 が,400nm付 近 の 波 長 に 強 い 吸 収 極 大 を 有 し,550∼600nmに 弱 い 吸 収 極 大 を 有 し, 400nm付 近 の 紫 外線に よ り励 起 さ れ る と赤 色 の 螢 光 を 発 す る 性 質 を 利 用 し 測 定 す る も の で あ る. Piomelli法25)に よ り 微 量 全 血 検 体 で 測 定 が 可 能 と な っ た が,プ ロ トポ ル フ ィ リ ン の 抽 出 に は 煩 雑 な 操 作 を 要 し た.こ れ に 対 し,Blumbergら26)に よ るhematofluorometerを 用 い た 方 法 は,微 量 な 全 血 検 体 で の 簡 単 な 測 定 を 可 能 と し た.た だ し,測 定 時 の 酸 化 の 程 度 に よ り デ ー タ の ば ら つ き が あ る と い わ れ て い る26).今回,使 用 したPROTOFLUOR-Z は,全 血 検 体 にPROTOFLUOR試 薬 を 加 え る こ と よ りこの 点 を改 善 して い る. 本 測 定 法 は,ZPPを 他 の ポ ル フ イ リン体 と分 別 す る た めに,415nmの 波 長 で 励 起 し,595nmで 螢 光 強 度 を 測 定 して い る. 今 回 の検 討 で は,本 測 定 法 とHPLC法 とは有 意 な相 関 を示 した. ZPPは,正 常 赤 血 球 膜 内 で 酸 素 の供 給 を 必 要 と せ ず,そ の寿 命 が 続 く限 り安 定 して い る.こ の よ うな性 質 を 有 す るZPPは 鉄 代 謝 に お い て 非 常 に 安 定 した パ ラ メー タ ーで あ り,赤 血 球 の造 血,成 熟 も加 味 した 機 能 的 パ ラ メ ー タ ー と考 え られ る. 今 回 の 貧 血 ス ク リー ニ ン グ で は,ZPPは 鉄 欠 乏 性 貧 血 に対 し,他 の パ ラ メ ー タ ー と比 較 しHb値 と高 い相 関 性 を示 し,さ ら に鉄 欠 乏 性 貧 血 の診 断 に 対 し て も他 の パ ラ メ ー タ ー と比 べ て 遜 色 は な か った. 以 上 よ り,ZPPは 赤 血 球 の 造 血 を 加 味 した 鉄 欠 乏 状 態 を 評 価 す る有 用 で安 定 した パ ラ メ ー タ ーで あ る こ とが 確 認 され た.学 童,中 学 ・高 校 の 男 女 を 対 象 と した 場 合,ZPPの 異 常 高 値 は,38.2μg/ ZPP/dl whole blood以 上 で あ った.ま た, hematofluorometerに よ るZPPの 測 定 は,既 存 の 測 定 方 法 と比 較 して微 量 な 全 血 検 体 で簡 便 な 操 作 で 短 時 間 に 測 定 が 可 能 で あ り,さ らに安 価 で あ り,今 後 一 般 の 臨 床 検 査 と して 有 用 と思 わ れ る. 結 論 Hematofluorometerを 用 い て,集 団 貧 血 検 査 を うけ た 沼 津 市 の 小 学4年 生,中 学2年 生,高 校1 年 生 お よ び当 科 に て加 療 した 鉄 欠 乏 性 貧 血 の 小 児 を 対 象 にZPPを 測 定 し,以 下 の結 論 を 得 た. 1) Hematofluorometerに よ り 測 定 し たZPP 値 は,HPLC法 に よ る測 定 値 と有 意 な相 関 を示 し た. 2) 貧 血 を 認 め な か っ た 小 児 に つ い て, hematofluorometerで 測 定 し たZPP値 の 正 常 値 は38.2μgZPP/dl whole blood未 満 で あ った. 3) Hematofluorometerに よ り測 定 し たZPP 値 に お い て,鉄 欠 乏 性 貧 血 患 児 の診 断 に 対 す る特 異 度 は97.2%で,敏 感 度 は81.8%で あ っ た. 4) Hematofluorometerに よ るZPPの 測 定 は,
50μlの 微 量 な 全 血 検 体 で 迅 速 か つ 簡 便 な 操 作 で 測 定 が で き,一 般 の 臨 床 検 査 と し て 有 用 で あ る . 稿 を 終 え る にあ た り,御 指 導,御 協 力頂 き ま した沼 津市 医師 会 杉 谷正 東 先 生,国 立 東 静 病院 小 児科 守 田 利 貞先 生, 日本 医 科 大学 小 児 科 教 室員 各 位,生 化 学第2教 室平 井 幸 彦 講師 に厚 くお礼 申 し上 げ る と と もに御 校 閲 を戴 い た平 山恒 夫教 授 に感 謝 いた し ます. な お,本 論 文 の 要 旨は 第94回 日本 小 児 科 学 会学 術 集 会 (1991年5月),第33回 日本 小 児 血液 学 会(1991年9月) にて報 告 した. 文 献
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