カ ン ピ ロ バ ク タ ー の 寒 天 平 板 希 釈 法 と 微 量 液 体 希 釈 法 に よ る 各 種 薬 剤 の
最 小 発 育 阻 止 濃 度
小 澤 真 名 緒 、 比 企 基 高 、 川 西 路 子 、 臼 井 優 1、 浅 井 鉄 夫 2、 小 池 良 治 （ 平 成 2 7 年 6 月 8 日 受 付 、 平 成 2 7 年 9 月 1 7 日 受 理 ） 1 現 酪 農 学 園 大 学 獣 医 学 群 2 現 岐 阜 大 学 大 学 院 連 合 獣 医 学 研 究 科 〔 T E C H N I C A L R E P O R T 〕M i n i m u m I n h i b i t o r y C o n c e n t r a t i o n o f S e v e r a l A n t i m i c r o b i a l s f o r
C a m p y l o b a c t e r i s o l a t e s u s i n g A g a r D i l u t i o n a n d B r o t h M i c r o d i l u t i o n
M e t h o d s
M a n a o O Z A W A , M o t o t a k a H I K I , M i c h i k o K A W A N I S H I , M a s a r u U S U I1, T e t s u o A S A I2, R y o j i K O I K ENational Veterinary Assay Laboratory, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, 1-15-1 Tokura, Kokubunji-Shi, Tokyo,185-8511 Japan
(Received 8th June 2015, Accepted 17th September 2015)
1 School of Veterinary Medicine, Rakuno Gakuen University
2 Department of Applied Veterinary Science, The United Graduate School of Veterinary Science, Gifu University
Abstract
To utilize broth microdilution methods for monitoring antimicrobial resistance in Campylobacter isolates from food-producing animals, we compared minimum inhibitory concentrations (MICs) of several antimicrobials obtained using an agar dilution method or broth microdilution method.
Although the agreement rates between the MICs obtained from the two methods were relatively low, there were good agreements among the resistance rates of antimicrobials belonging to the same class. Therefore, broth microdilution appears to be an appropriate method for monitoring Campylobacter in the Japanese Veterinary Antimicrobial Resistance Monitoring System program.
要 旨
健 康 家 畜 か ら 分 離 さ れ た カ ン ピ ロ バ ク タ ー を 対 象 と し た 薬 剤 耐 性 菌 の モ ニ タ リ ン グ へ の 微 量 液 体 希 釈 法 の 導 入 を 検 討 す る た め に 、 微 量 液 体 希 釈 法 と 寒 天 平 板 希 釈 法 に よ る 各 種 薬 剤 の 最 小 発 育 阻 止 濃 度（MIC）を 比 較 し た 。両 試 験 方 法 に よ る MIC の 一 致 率 及 び 相 関 は 比 較 的 低 か っ た
が 、 耐 性 率 は 良 好 な 一 致 が 認 め ら れ た 。 し た が っ て 、 微 量 液 体 希 釈 法 は JVARM に お け る カ ン ピ ロ バ ク タ ー の モ ニ タ リ ン グ に 適 切 な 方 法 で あ る と 考 え ら れ た 。 諸 言 カ ン ピ ロ バ ク タ ー は 細 菌 性 食 中 毒 の 主 な 起 因 菌 で あ り 、 鶏 を は じ め 牛 、 豚 な ど の 家 畜 の 腸 管 内 に 生 息 し て い る 。 カ ン ピ ロ バ ク タ ー 食 中 毒 の 原 因 食 品 と し て は 、 食 肉 （ 特 に 鶏 肉 ） が 大 き な 割 合 を 占 め て お り 、 食 肉 処 理 過 程 に お け る 食 肉 の カ ン ピ ロ バ ク タ ー 汚 染 が 問 題 と な っ て い る 。 カ ン ピ ロ バ ク タ ー 感 染 症 で は 、 一 般 的 に 抗 菌 薬 を 用 い た 治 療 は 行 わ れ な い が 、 重 篤 な 症 状 や 敗 血 症 な ど を 呈 し た 患 者 で は 、 対 症 療 法 と 共 に 適 切 な 抗 菌 薬 を 用 い た 治 療 が 必 要 で あ る 。 治 療 薬 と し て は 、フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 抗 菌 薬 に 対 す る カ ン ピ ロ バ ク タ ー 耐 性 率 が 高 ま っ て い る た め（ カ ン ピ ロ バ ク タ ー ・ レ フ ァ レ ン ス グ ル ー プ 2006） 、 エ リ ス ロ マ イ シ ン 等 の マ ク ロ ラ イ ド 系 抗 生 物 質 や ホ ス ホ マ イ シ ン が 選 択 さ れ る（ 相 楽 2005）。し か し 、感 染 性 腸 炎 の 初 診 時 に 、経 験 的 治 療 と し て 抗 菌 薬 が 選 択 さ れ る 場 合 に は 、フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 抗 菌 薬 が 投 与 さ れ る こ と が あ る（ 相 楽 2005）。こ の よ う に 、抗 菌 薬 に 対 す る 耐 性 菌 の 出 現・存 在 が 、カ ン ピ ロ バ ク タ ー 感 染 症 の 治 療 に 影 響 を 与 え て い る 。
日 本 で は 、1999 年 に 家 畜 由 来 細 菌 の 薬 剤 耐 性 モ ニ タ リ ン グ（ Japanese Veterinary Antimicrobial Resistance Monitoring System: JVARM）が 構 築 さ れ 、耐 性 菌 の 発 現 状 況 が 継 続 的 に 調 査 さ れ て い る 。JVARM で は 、 カ ン ピ ロ バ ク タ ー は 食 品 媒 介 性 病 原 細 菌 と し て 調 査 の 対 象 菌 種 と 位 置 づ け ら れ て お り 、 薬 剤 感 受 性 試 験 と し て 、 基 本 的 に 臨 床 検 査 標 準 委 員 会 （Clinical and Laboratory Standards Institute（ CLSI）、旧 NCCLS）法 に 準 拠 し た 寒 天 平 板 希 釈 法 が 用 い ら れ て き た 。し か し 、2006 年 に CLSI か ら 、栄 養 要 求 性 の 厳 し い 菌 種 の 薬 剤 感 受 性 試 験 の 標 準 法 と し て document M45-A が 発 行 さ れ 、そ の 中 で カ ン ピ ロ バ ク タ ー の 微 量 液 体 希 釈 法 が 規 定 さ れ た（ CLSI 2006）。 ま た 、米 国 に お け る National Antimicrobial Resistance Monitoring System （ NARMS）や 、デ ン マ ー ク に お け る Danish Integrated Antimicrobial Resistance Monitoring and Research Programme （DANMAP） の 薬 剤 耐 性 調 査 に お い て も 、 微 量 液 体 希 釈 法 が 採 用 さ れ て い る （ DANMAP 2013; NARMS 2011） 。 寒 天 平 板 希 釈 法 は 、 薬 剤 の 希 釈 や 寒 天 平 板 の 作 製 等 多 大 な 労 力 が 必 要 と な る が 、 微 量 液 体 希 釈 法 は あ ら か じ め 薬 剤 が 段 階 希 釈 さ れ た 市 販 の プ レ ー ト を 用 い る こ と で 、 よ り 効 率 的 に 薬 剤 感 受 性 試 験 を 行 う こ と が で き る 。 以 上 の よ う な 状 況 か ら 、JVARM に お け る カ ン ピ ロ バ ク タ ー の 薬 剤 感 受 性 試 験 を 、 寒 天 平 板 希 釈 法 か ら 市 販 の マ イ ク ロ プ レ ー ト を 用 い た 微 量 液 体 希 釈 法 に 変 更 す る 必 要 が あ る と 考 え ら れ た 。 そ こ で 、 変 更 に 先 立 ち 、 両 試 験 法 に よ る 各 種 抗 菌 剤 に お け る 最 小 発 育 阻 止 濃 度 （MIC） の 相 関 性 、 耐 性 又 は 感 受 性 の 判 定 の 同 一 性 等 に つ い て 検 討 を 行 っ た の で 、 そ の 結 果 を 報 告 す る 。 材 料 と 方 法
供 試 菌 株 ： 2009 年 度 に JVARM で 収 集 し た 、健 康 家 畜 由 来 Campylobacter jejuni（牛由来 31 株 、肉 用 鶏 由 来 19 株 ）及 び Campylobacter coli（牛由来 6 株、豚由来 39 株、肉用鶏由来
3 株 ）の 計 98 株 を 用 い た 。株 は 試 験 に 供 す る ま で -80°C で15%グ リ セ リ ン 添 加 Buffered peptone water（ Oxoid） 中 に 保 存 し た 。
寒 天 平 板 希 釈 法：CLSI の ガ イ ド ラ イ ン（ CLSI 2008）に 準 拠 し た 寒 天 平 板 希 釈 法 に よ り MIC を 測 定 し た 。抗 菌 性 物 質 は 、ア ン ピ シ リ ン（ABPC）、エ リ ス ロ マ イ シ ン（ EM）、ゲ ン タ マ
イ シ ン（GM）、オ キ シ テ ト ラ サ イ ク リ ン（ OTC）、ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル（ CP）、ナ リ ジ ク ス 酸 （NA） 及 び エ ン ロ フ ロ キ サ シ ン （ ERFX） を 用 い た 。 培 養 は O2－CO2 培 養 器 （CPO2-1802 型 、 株 式 会 社 ヒ ラ サ ワ ） を 用 い て 、 O25%、 CO210%の 微 好 気 条 件 で 、 37°C で 48 時 間 培 養 し た 。 微 量 液 体 希 釈 法：供 試 菌 株 は 、5%羊 脱 繊 維 素 血 液 添 加 ミ ュ ラ ー ヒ ン ト ン 培 地 で 42°C、48 時 間 培 養 し 、 そ の 後 培 地 上 の 菌 体 を 滅 菌 生 理 食 塩 水 に 懸 濁 し て McFarland 標 準 濁 度 液 1 と 同 じ 濁 度 に 合 わ せ た 。 こ の 菌 液 0.025 ml を 、 あ ら か じ め 溶 血 球 液 （ ス ト レ プ ト ・ ヘ モ サ プ リ メ ン ト ‘ 栄 研 ’ （ 栄 研 化 学 株 式 会 社 ） を 添 付 文 書 に 従 っ て 1 バ イ ア ル 当 た り 5.5 ml の 滅 菌 蒸 留 水 で 溶 解 し た も の ）1 ml を 添 加 し た ミ ュ ラ ー ヒ ン ト ン ブ イ ヨ ン‘ 栄 研 ’（ 12 ml）（ 栄 研 化 学 株 式 会 社 ） に 加 え 、 均 等 に 浮 遊 さ せ て 接 種 用 菌 液 と し た 。
薬 剤 の MIC は 、 CLSI の ガ イ ド ラ イ ン （CLSI 2006） に 準 拠 し た 微 量 液 体 希 釈 法 （ ド ラ イ プ レ ー ト ‘ 栄 研 ’ 、 栄 研 化 学 株 式 会 社 ） に よ り 測 定 し た 。 薬 剤 は 、ABPC、EM、GM、テ ト ラ サ イ ク リ ン （TC） 、 CP、 NA 及 び シ プ ロ フ ロ キ サ シ ン （ CPFX） を 選 定 し た 。 精 度 管 理
は 、C. jejuni ATCC 33560 株を用いて実施した。薬剤濃度、精度管理限界値は Table 1 に示
し た 。培 養 は 、ア ネ ロ パ ッ ク・微 好 気（ 三 菱 ガ ス 化 学 株 式 会 社 ）を 用 い て ジ ャ ー 内 で 行 い 、 37°C で 48 時 間 培 養 し た 。 ブ レ ー ク ポ イ ン ト：ブ レ ー ク ポ イ ン ト は 、CLSI が 定 め た も の に つ い て は そ の 値 と し 、CLSI で 規 定 さ れ て い な い 薬 剤 に つ い て は 、JVARM で 定 め ら れ て い る 値 を 用 い た （ Table 1） 。 寒 天 平 板 希 釈 法 と 微 量 液 体 希 釈 法 に よ る MIC の比較：両試験法による MIC は、テトラ サ イ ク リ ン 系 及 び フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 を 除 き 同 一 成 分 間 で 耐 性 率 、MIC の 一 致 率 及 び Spearman の 相 関 係 数 を 用 い て 比 較 し た 。OTC 及 び ERFX に つ い て は 、ド ラ イ プ レ ー ト‘ 栄 研 ’ の 添 付 文 書 の 作 成 可 能 な 製 品 リ ス ト
（http://www.info.pmda.go.jp/downfiles/ivd/PDF/170005_09A2X10001000028_A_02_07.pdf）の 別 表 ― 1 「 構 成 製 品 一 覧 」 ） 中 に 含 ま れ て い な か っ た た め 、 同 表 に あ る 同 系 成 分 で あ る TC 及 び CPFX と 比 較 し た 。 さ ら に 、 両 試 験 法 に よ る 耐 性 率 の 一 致 度 を 判 定 す る た め 、 κ 統 計 量（Kappa statistic）を 算 出 し た 。相 関 係 数 及 び κ 統 計 量 は R（ version 3.0.3）（ R Core Team 2014） に よ っ て 算 出 し た 。 な お 、 MIC の 一 致 率 、相 関 係 数 及 び κ 統 計 量 は C. jejuni 及び C. coli を合わせて算出した。
結 果
各 種 薬 剤 の MIC の 測 定 結 果 を Table 2 に 示 し た 。 両 試 験 法 で GM 以 外 の 薬 剤 の MIC の 分 布 は 二 峰 性 を 示 し た 。 各 薬 剤 の 耐 性 率 は 両 試 験 法 間 で ほ ぼ 同 じ 値 を 示 し た 。 両 試 験 法 の MIC の 一 致 率 は 、Table 3 の と お り 8.2～ 48.0%と 低 く 、±1 管 差 ま で の 一 致 率 で も 26.5～ 89.8%で あ っ た 。±2 管 差 ま で の 一 致 率 は 、3 薬 剤 で 90%を 超 え る も の の 、OTC/TC （66.3%） 及 び EM（ 77.6%） で は 低 か っ た 。 相 関 係 数 は 、 0.466～ 0.848、 κ 統 計 量 は 0.831 ～0.936 で あ っ た 。GM と ERFX/CPFX を 除 い て は 、微 量 液 体 希 釈 法 の MIC が 寒 天 平 板 希 釈 法 の MIC よ り も 低 い 傾 向 が 認 め ら れ た 。 考 察 健 康 家 畜 か ら 得 ら れ た カ ン ピ ロ バ ク タ ー を 用 い て 寒 天 平 板 希 釈 法 と 微 量 液 体 希 釈 法 で 得
ら れ た MIC を 比 較 し た と こ ろ 、 相 関 係 数 は 低 い 値 を 示 し た が 、 κ 統 計 量 は 高 い 値 を 示 し 、 耐 性 率 も 両 試 験 法 で ほ ぼ 同 じ 値 で あ っ た 。 し た が っ て 、 微 量 液 体 希 釈 法 は 寒 天 平 板 希 釈 法 と 同 様 に JVARM の カ ン ピ ロ バ ク タ ー の モ ニ タ リ ン グ の た め の 手 法 と し て 利 用 可 能 と 考 え ら れ た 。 κ 統 計 量 は 、 主 に 観 察 者 間 の 診 断 の 一 致 度 （ reproducibility） を 評 価 す る 際 に 用 い ら れ る 指 標 で あ る 。 値 が 1 に 近 い ほ ど 、 一 致 度 が 高 い と 判 定 さ れ る 。 今 回 、 寒 天 平 板 希 釈 法 と 微 量 液 体 希 釈 法 の 一 致 度 の 判 定 に κ 統 計 量 を 用 い た と こ ろ 、0.831～ 0.936 と 高 い 値 を 示 し 、両 試 験 法 に お け る 耐 性 、 感 受 性 の 判 定 の 一 致 度 は 高 い こ と が 示 さ れ た 。 MIC の 一 致 率 及 び 相 関 が 低 か っ た こ と に つ い て は 、 カ ン ピ ロ バ ク タ ー は 発 育 に 微 好 気 条 件 が 必 要 で あ り 、 ま た 、 発 育 速 度 が 遅 い た め 、 培 養 環 境 の 影 響 を 受 け や す く 、 両 試 験 法 の 培 養 環 境 の 違 い が MIC の 違 い と し て 現 れ た も の と 考 え ら れ た 。こ れ ま で に カ ン ピ ロ バ ク タ ー で 両 試 験 法 の 比 較 を 行 っ た 報 告 に お い て も 、MIC の 一 致 率 及 び 相 関 係 数 は 今 回 の 結 果 と 類 似 し た 値 を 示 し て い る（Halbert ら 2005; Luber ら 2003）。ま た 、今 回 、寒 天 平 板 希 釈 法 で は O2-CO2培 養 器 を 用 い て 培 養 し 、微 量 液 体 希 釈 法 で は 酸 素 吸 収・炭 酸 ガ ス 発 生 剤 を 用 い て ジ ャ ー で 培 養 し た 。 こ れ は 、JVARM に お い て は MIC の 測 定 が 行 わ れ る の は 各 都 道 府 県 で あ り 、 そ の 場 合 、O2-CO2培 養 器 を 保 有 し て い る と こ ろ は 少 な く 、 ジ ャ ー で 培 養 さ れ る こ と が 多 い と い う 実 態 を 考 慮 し た も の で あ る 。 ジ ャ ー で の 培 養 は 、O2-CO2培 養 器 で 培 養 し た 場 合 と 比 較 し て 、 酸 素 濃 度 が 下 が っ て 微 好 気 状 態 に な る ま で に 時 間 が か か る た め 、 菌 が 死 滅 あ る い は 増 殖 が 抑 制 さ れ る こ と に よ り MIC が 低 く な る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。
特 に MIC の 一 致 率 が 低 か っ た 成 分 と し て OTC/TC 及 び EM が あ げ ら れ る 。 OTC/TC に つ い て は 、2 倍 以 内 の MIC を 示 し た 株 の 割 合 が 低 く 、 OTC と TC の 抗 菌 活 性 の 違 い の 影 響 も あ る と 考 え ら れ た 。EM に つ い て は 、供 試 し た す べ て の 株 で 、微 量 液 体 希 釈 法 の 値 が 寒 天 平 板 希 釈 法 の 値 以 下 に な っ て い た 。EM に お い て は 、原 因 は 不 明 で あ る が 、ジ ャ ー の 培 養 に よ る 影 響 が 大 き く 現 れ た も の と 考 え ら れ た 。 ま と め 今 回 の 成 績 か ら 、 両 試 験 法 に お け る 耐 性 、 感 受 性 の 判 定 の 一 致 度 が 高 い こ と が 示 さ れ 、 微 量 液 体 希 釈 法 が 寒 天 平 板 希 釈 法 と 同 様 に JVARM の カ ン ピ ロ バ ク タ ー の モ ニ タ リ ン グ の た め の 試 験 法 と し て 利 用 可 能 と 考 え ら れ た 。 た だ し 、 カ ン ピ ロ バ ク タ ー は 培 養 条 件 の 影 響 を 受 け や す い と 考 え ら れ る こ と か ら 、 各 都 道 府 県 に お け る 培 養 条 件 の 均 一 化 等 の さ ら な る 手 法 の 平 準 化 が 必 要 で あ る と 考 え ら れ た 。 謝 辞 今 回 の 試 験 に 用 い た 株 を 分 離 し て い た だ き ま し た 、全 国 の 家 畜 保 健 衛 生 所 等 の 職 員 の 皆 様 に 深 謝 い た し ま す 。 引 用 文 献 カ ン ピ ロ バ ク タ ー ・ レ フ ァ レ ン ス グ ル ー プ （2006） わ が 国 に お け る 腸 炎 由 来 Campylobacter jejuni の 血 清 型 別 検 出動 向 お よ びキ ノ ロ ン 剤に 対 す る 耐性 菌 の 出 現状 況 － カ ンピ ロ バ ク タ ー ・ 146
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157
Acceptable quality control range (mg/L)
Campylobacter jejuni ATCC 33560
Ampicillin
0.125-256
-
32
Gentamicin
0.125-256
0.5-2
-Erythromycin
0.125-128
0.5-2
32
*Oxytetracycline
0.125-512
2-16
16
Tetracycline
0.125-128
0.25-2
16
*Chloramphenicol
0.125-256
1-8
16
Nalidixic acid
0.125-128
4-16
32
Enrofloxacin
0.03-128
≦
0.25
2
Ciprofloxacin
0.03-64
0.06-0.25
4
* - : Not determinedTable 1 Antimicrobial dilution range, acceptable quality control range and breakpoints
Antimicrobials
dilution range
Antimicrobial
Breakpoint
(mg/L)
*: Breakponts defined in CLSI M45-A.
<0.125 0.25 0. 5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 (>128 ) * 512 >512 agar dilution 3 10 18 22 19 10 3 10 2 1 4 64 16 broth microdilution 4 91 41 72 01 27373 2 4 64 15 agar dilution 3 14 39 24 18 0.5 2 broth microdilution 3 11 35 30 16 2 1 0.5 2 agar dilution 12 20 28 10452 17 2 >512 19 broth microdilution 12 21 18 13 13 4 1 3 13 0.5 >128 16 Oxytetracycline agar dilution 31 21 2 5 5 2 4 10 12 10 11 6 6 32 512 59 Tetracycline broth microdilution 25 7 7 1 1 6 14 13 20 4 32 128 57 agar dilution 2 5 56 18 7 5 4 2 32 9 broth microdilution 4 8 35 29 13 1 7 2 32 8 agar dilution 6 24 14 10 1 6 24 13 16 256 44 broth microdilution 2 6 28 16 6 3 18 16 3 8 128 40 Enrofloxacin agar dilution 48 8 3 18 19 2 0.25 8 42 Ciprofloxacin broth microdilution 42 13 3 3 2 19 14 2 0.25 16 37
Vertical lines indicate breakpoints for resistance. * Underlined isolates showed the MIC in parenthesis. ** n=97
Table 2 Comparative susceptibilities of
Campylobacter
spp. to antimicrobial agents by the agar dilution and broth microdilution methods (n=98)
agent MIC determination method MIC (mg/L) MIC 50 MIC 90
No. of resistant isolates (%)
Ampicillin Gentamicin Erythromycin
Chloramphenicol
**
Nalidixic acid
<-2
-2
-1
0
1
2
2<
Same
±1
±2
ABPC
98
7
18
24
30
14
3
2
30.6
69.4
90.8
0.761
0.885
GM
98
1
2
26
32
30
3
4
32.7
89.8
94.9
0.466
EM
98
22
50
18
8
0
0
0
8.2
26.5
77.6
0.848
0.896
OTC/TC
98
33
18
20
13
11
3
0
13.3
44.9
66.3
0.819
0.831
CP
97
5
14
42
34
2
0
0
35.1
80.4
94.8
0.683
0.936
NA
98
8
7
23
47
11
0
2
48.0
82.7
89.8
0.674
0.834
ERFX/CPFX
98
7
0
5
27
42
14
3
27.6
75.5
89.8
0.679
0.852
microdilution result was
1-0.60, moderate agreement;
2
dilution differences to
Campylobacter
spp. and MIC correration between the agar dilution and broth microdilution methods
