1
第16番染色体16p13.11内、新規脳発生関連miR‑484の遺伝子改変マウスによる神経発達疾患 モデル動物の確立
研究代表者 藤谷 昌司
大学院大阪大学・金沢大学・浜松医科大学・千葉大学・福井大学 連合小児発達学研究科 助教
研究分担者 なし
研究要旨
近年、精神疾患により医療機関にかかる患者数は大幅に増加しており、特に、統合失 調症患者は入院患者数の大半を占め、医療費への負担は、年々その割合を増している。に もかかわらず、有効な治療法は未だに開発されておらず、統合失調症を初めとする神経発 達疾患の新規治療法の開発研究に社会的要請が年々高まってきている。
また一方で、分子生物学、神経科学の進歩により、神経発達疾患のモデル動物において、
そのシグナル異常を動物個体内で改善することで、行動学的改善が認められることが報告 され、神経発達疾患のモデル動物を用いた分子生物学的治療法の開発が可能であることが 確認されつつある。
申請者はその遺伝子変異が神経発達疾患の原因となる第 16 番染色体短腕 16p13.11 に着 目して、新規の脳発生関連遺伝子 miR‑484 を見いだした。
この研究の目的は、miR‑484 の遺伝子改変マウスを作成し、行動学的解析を行うことで 16p13.11 遺伝子異常に関連する神経発達疾患モデル動物として確立することである。
そこで、神経幹細胞特異的に miR‑484 を in vitro で低下させる方法を確立し、miR‑484 発現低下トランスジェニックマウスの作成を試みた。条件特異的に目的遺伝子を発現可能 とする CALSL システムは、Cre recombinase の存在下で、GFP をレポーターとして動物個体 内でも正しく作動することが確認された。そして、神経幹細胞特異的にノックダウンする ために、Nestin‑Cre マウスと交配し、ダブルトランスジェニックマウスを作成した。ダブ ルトランスジェニックマウスを Nissl 染色により解剖学的に検討したが、各器官形成、皮 質の厚み、層構造、脳梁の厚み等の解剖学的構造に特に顕著な異常は認められなかった。
遅れていた過剰発現トランスジェニックマウスの作成を早急に行おうとした。ファウン ダーマウスを作成することができたが、得られた 3 匹から次世代のトランスジェニックマ ウスを得られることができなかった。また、予定に追加して、miR‑484 のノックアウトマウ スの作成を試みたが、キメラマウスのキメラ率が 10％程度と極めて低く、また、二度にわ たって同様の結果であり、ノックアウトマウスを作成することができなかった。
従って、唯一作成することができた、ノックダウントランスジェニックマウスにおける 行動学的解析を行った。まず、オープンフィールドテストにより、個体数が少ない時には、
多動傾向を示したものの、10 分間に移動する総距離は有意な変化が見られず、多動傾向は 認められなかった。また、中央区画滞在時間が反映すると考えられる、不安様行動につい ては、野生型との違いが認められたが、うつ様行動に関して、尾懸垂試験法、強制水泳試 験法にて解析したところ、特筆すべき有意な変化は認められなかった。今後は、miR‑484 以外のターゲット分子を発見していることから、それらの遺伝子改変マウスを用いての行 動学的テストなどを通じて、16p13.11 領域の重複、欠損による発達障害の病態メカニズム を明らかにしていきたいと考えている。
創薬基盤推進研究事業(創薬総合推進研究事業)
総合研究報告書
A.
大幅に増加して
患者数の大半を占め、医療費への負担は、年々その 割合を増している。にもかかわらず、有効な治療法 は未だに開発されておらず、統合失調症を初めとす る神経発達疾患の新規治療法の開発研究に社会的要 請が年々高まってきている。
神経発達疾患のモデル動物において、そのシグナル 異常を動物個体内で改善することで、行動学的改善 が認められることが報告され、神経発達疾患のモデ ル動物を用いた分子生物学的治療法の開発が可能で あることが確認されつつある。
なる第
の脳発生関連遺伝子 究の目的は、
行動学的解析を行うことで
関連する神経発達疾患モデル動物として確立するこ とである。
A. 研究目的
近年、精神疾患により医療機関にかかる患者数は 大幅に増加して
患者数の大半を占め、医療費への負担は、年々その 割合を増している。にもかかわらず、有効な治療法 は未だに開発されておらず、統合失調症を初めとす る神経発達疾患の新規治療法の開発研究に社会的要 請が年々高まってきている。
また一方で、分子生物学、神経科学の進歩により、
神経発達疾患のモデル動物において、そのシグナル 異常を動物個体内で改善することで、行動学的改善 が認められることが報告され、神経発達疾患のモデ ル動物を用いた分子生物学的治療法の開発が可能で あることが確認されつつある。
申請者はその遺伝子変異が神経発達疾患の原因と なる第 16 番染色体短腕
の脳発生関連遺伝子 究の目的は、miR
行動学的解析を行うことで
関連する神経発達疾患モデル動物として確立するこ とである。
研究目的
精神疾患により医療機関にかかる患者数は 大幅に増加しており、特に、統合失調症患者は入院 患者数の大半を占め、医療費への負担は、年々その 割合を増している。にもかかわらず、有効な治療法 は未だに開発されておらず、統合失調症を初めとす る神経発達疾患の新規治療法の開発研究に社会的要 請が年々高まってきている。
また一方で、分子生物学、神経科学の進歩により、
神経発達疾患のモデル動物において、そのシグナル 異常を動物個体内で改善することで、行動学的改善 が認められることが報告され、神経発達疾患のモデ ル動物を用いた分子生物学的治療法の開発が可能で あることが確認されつつある。
請者はその遺伝子変異が神経発達疾患の原因と 番染色体短腕 16p13.
の脳発生関連遺伝子 miR‑
miR‑484 の遺伝子改変マウスを作成し、
行動学的解析を行うことで
関連する神経発達疾患モデル動物として確立するこ 精神疾患により医療機関にかかる患者数は おり、特に、統合失調症患者は入院 患者数の大半を占め、医療費への負担は、年々その 割合を増している。にもかかわらず、有効な治療法 は未だに開発されておらず、統合失調症を初めとす る神経発達疾患の新規治療法の開発研究に社会的要 請が年々高まってきている。
また一方で、分子生物学、神経科学の進歩により、
神経発達疾患のモデル動物において、そのシグナル 異常を動物個体内で改善することで、行動学的改善 が認められることが報告され、神経発達疾患のモデ ル動物を用いた分子生物学的治療法の開発が可能で あることが確認されつつある。
請者はその遺伝子変異が神経発達疾患の原因と 16p13.11 に着目して、新規
‑484 を見いだした。この研 の遺伝子改変マウスを作成し、
行動学的解析を行うことで 16p13.11
関連する神経発達疾患モデル動物として確立するこ 精神疾患により医療機関にかかる患者数は おり、特に、統合失調症患者は入院 患者数の大半を占め、医療費への負担は、年々その 割合を増している。にもかかわらず、有効な治療法 は未だに開発されておらず、統合失調症を初めとす る神経発達疾患の新規治療法の開発研究に社会的要 また一方で、分子生物学、神経科学の進歩により、
神経発達疾患のモデル動物において、そのシグナル 異常を動物個体内で改善することで、行動学的改善 が認められることが報告され、神経発達疾患のモデ ル動物を用いた分子生物学的治療法の開発が可能で 請者はその遺伝子変異が神経発達疾患の原因と に着目して、新規 を見いだした。この研 の遺伝子改変マウスを作成し、
16p13.11 遺伝子異常に 関連する神経発達疾患モデル動物として確立するこ 精神疾患により医療機関にかかる患者数は おり、特に、統合失調症患者は入院 患者数の大半を占め、医療費への負担は、年々その 割合を増している。にもかかわらず、有効な治療法 は未だに開発されておらず、統合失調症を初めとす る神経発達疾患の新規治療法の開発研究に社会的要 また一方で、分子生物学、神経科学の進歩により、
神経発達疾患のモデル動物において、そのシグナル 異常を動物個体内で改善することで、行動学的改善 が認められることが報告され、神経発達疾患のモデ ル動物を用いた分子生物学的治療法の開発が可能で 請者はその遺伝子変異が神経発達疾患の原因と に着目して、新規 を見いだした。この研 の遺伝子改変マウスを作成し、
遺伝子異常に 関連する神経発達疾患モデル動物として確立するこ
現在 いるが、
統合失調症、精神発達遅滞などの神経発達疾患と関 連する重要な遺伝子座である。そこで申請者は、そ の部位に、病気の原因となる脳発生に関連する候補 遺伝子があると仮定した。そして、個々の遺伝子の 時系列に沿った発現解析を行い、
脳電気穿孔法による
った。その中で、出生前後の発達期の神経新生に重 要と考えられる、
申請者は新規の脳発生関連遺伝子である
神経発達疾患の原因候補遺伝子であると仮定し、具 体的には以下の目標について明らかにしていきたい と考えている。
◯24
の作成と、その脳の発生学的、解剖学的異常の有無 の解析
◯24
析を行うことによる特異的疾患モデル動物としての 確立が可能かどうかの解析。
現在申請者は、
いるが、この部位は
統合失調症、精神発達遅滞などの神経発達疾患と関 連する重要な遺伝子座である。そこで申請者は、そ の部位に、病気の原因となる脳発生に関連する候補 遺伝子があると仮定した。そして、個々の遺伝子の 時系列に沿った発現解析を行い、
脳電気穿孔法による
った。その中で、出生前後の発達期の神経新生に重 要と考えられる、
申請者は新規の脳発生関連遺伝子である
神経発達疾患の原因候補遺伝子であると仮定し、具 体的には以下の目標について明らかにしていきたい と考えている。
24 年度：miR
の作成と、その脳の発生学的、解剖学的異常の有無 の解析
24〜25 年度：神経発達疾患に関連した行動学的解 析を行うことによる特異的疾患モデル動物としての 確立が可能かどうかの解析。
申請者は、16p13.11
この部位は注意欠陥多動性障害
統合失調症、精神発達遅滞などの神経発達疾患と関 連する重要な遺伝子座である。そこで申請者は、そ の部位に、病気の原因となる脳発生に関連する候補 遺伝子があると仮定した。そして、個々の遺伝子の 時系列に沿った発現解析を行い、
脳電気穿孔法による in vivo
った。その中で、出生前後の発達期の神経新生に重 要と考えられる、miR‑484
申請者は新規の脳発生関連遺伝子である
神経発達疾患の原因候補遺伝子であると仮定し、具 体的には以下の目標について明らかにしていきたい と考えている。
miR‑484 の条件特異的遺伝子改変マウス の作成と、その脳の発生学的、解剖学的異常の有無 年度：神経発達疾患に関連した行動学的解 析を行うことによる特異的疾患モデル動物としての 確立が可能かどうかの解析。
16p13.11 に着目して研究を行って 注意欠陥多動性障害
統合失調症、精神発達遅滞などの神経発達疾患と関 連する重要な遺伝子座である。そこで申請者は、そ の部位に、病気の原因となる脳発生に関連する候補 遺伝子があると仮定した。そして、個々の遺伝子の 時系列に沿った発現解析を行い、RNAi
in vivo における機能解析を行 った。その中で、出生前後の発達期の神経新生に重 484 を見いだした。そこで、
申請者は新規の脳発生関連遺伝子である
神経発達疾患の原因候補遺伝子であると仮定し、具 体的には以下の目標について明らかにしていきたい の条件特異的遺伝子改変マウス の作成と、その脳の発生学的、解剖学的異常の有無 年度：神経発達疾患に関連した行動学的解 析を行うことによる特異的疾患モデル動物としての 確立が可能かどうかの解析。
に着目して研究を行って 注意欠陥多動性障害、てんかん、
統合失調症、精神発達遅滞などの神経発達疾患と関 連する重要な遺伝子座である。そこで申請者は、そ の部位に、病気の原因となる脳発生に関連する候補 遺伝子があると仮定した。そして、個々の遺伝子の RNAi と子宮内胎児 における機能解析を行 った。その中で、出生前後の発達期の神経新生に重 を見いだした。そこで、
申請者は新規の脳発生関連遺伝子である miR‑484 神経発達疾患の原因候補遺伝子であると仮定し、具 体的には以下の目標について明らかにしていきたい の条件特異的遺伝子改変マウス の作成と、その脳の発生学的、解剖学的異常の有無 年度：神経発達疾患に関連した行動学的解 析を行うことによる特異的疾患モデル動物としての
に着目して研究を行って
、てんかん、
統合失調症、精神発達遅滞などの神経発達疾患と関 連する重要な遺伝子座である。そこで申請者は、そ の部位に、病気の原因となる脳発生に関連する候補 遺伝子があると仮定した。そして、個々の遺伝子の と子宮内胎児 における機能解析を行 った。その中で、出生前後の発達期の神経新生に重 を見いだした。そこで、
484 が 神経発達疾患の原因候補遺伝子であると仮定し、具 体的には以下の目標について明らかにしていきたい の条件特異的遺伝子改変マウス の作成と、その脳の発生学的、解剖学的異常の有無 年度：神経発達疾患に関連した行動学的解 析を行うことによる特異的疾患モデル動物としての
B.
vitro
できているかどうかを検討した。
1.
１
した皮質のみを単離し、トリプシンで 理する。
化し、ピペッティングにより神経細胞を完全に分離 する。トリパンブルー染色にて生細胞と死細胞を染 め分け、生細胞のみを、ポリ
培養皿に播種し培養する。
１ 法
皮 質 神 経 細 胞 を
Nuclefector solution 100 し、更にプラスミドを２
ベットに入れ、電気穿孔を行なった後に、培養液 中に播種した。４時間から
に交換し、１，２日培養した。
１
るとされるプライマ
伝子導入した皮質神経細胞から、トリゾール試薬、
RNeasy kit
た後に、上記のプライマーを用いて 産物が５０ｂｐと大変小さいために、
用いて電気泳動し、
２ ２
マウスとの交配により、神経幹細胞特異的 過剰発現マウスを作成し、解剖学的
特に、統合失調症モデル動物としては、脳体積の低 下などが報告され
B. 研究方法
トランスジェニックマウス作製にあたり、
vitro 実験を行うことで、発現プラスミドが適切に できているかどうかを検討した。
1. In vitro
１‑１神経細胞培養法 胎生14日から
した皮質のみを単離し、トリプシンで 理する。10％
化し、ピペッティングにより神経細胞を完全に分離 する。トリパンブルー染色にて生細胞と死細胞を染 め分け、生細胞のみを、ポリ
培養皿に播種し培養する。
１‑２遺伝子導入法
神経細胞に、遺伝子導入する際には、電気穿孔 法nucleofection
皮 質 神 経 細 胞 を
Nuclefector solution 100 し、更にプラスミドを２
ベットに入れ、電気穿孔を行なった後に、培養液 中に播種した。４時間から
に交換し、１，２日培養した。
１‑３RT‑PCR microRNA‑
るとされるプライマ
伝子導入した皮質神経細胞から、トリゾール試薬、
RNeasy kitを用いて
た後に、上記のプライマーを用いて 産物が５０ｂｐと大変小さいために、
用いて電気泳動し、
２. 遺伝子改変マウス
２‑１条件特異的遺伝子改変マウスの作成（過剰発現）
子宮内胎児脳
析スクリーニングにより、発達期の神経幹細胞の 分化、細胞移動を制御する因子として、
が見いだされた。現在そのターゲット分子を探索 中であるが、一般的にマイクロ
ーゲットmRNA
胎生致死を避けるために、非特異的な初期胚から の過剰発現ではなく、条件特異的に過剰発現並び に、発現を低下させることが必要であると考えら れる.そこで、
promoter下に発現を誘導できるベクターを受精 卵にインジェクションすることでトランスジェ ニックマウスを作成する。最終的には、
マウスとの交配により、神経幹細胞特異的 過剰発現マウスを作成し、解剖学的
特に、統合失調症モデル動物としては、脳体積の低 下などが報告され
研究方法
トランスジェニックマウス作製にあたり、
実験を行うことで、発現プラスミドが適切に できているかどうかを検討した。
In vitro 実験法 神経細胞培養法
日から16日のマウス胎児より、髄膜を切離 した皮質のみを単離し、トリプシンで
％FBS含有DMEM
化し、ピペッティングにより神経細胞を完全に分離 する。トリパンブルー染色にて生細胞と死細胞を染 め分け、生細胞のみを、ポリ
培養皿に播種し培養する。
遺伝子導入法(nucleofection)
神経細胞に、遺伝子導入する際には、電気穿孔 nucleofection法を用いた。
皮 質 神 経 細 胞 を 5 x10 Nuclefector solution 100 し、更にプラスミドを２
ベットに入れ、電気穿孔を行なった後に、培養液 中に播種した。４時間から
に交換し、１，２日培養した。
PCR法
‑484のmature
るとされるプライマ—を用いた。サン
伝子導入した皮質神経細胞から、トリゾール試薬、
を用いてRNA
た後に、上記のプライマーを用いて 産物が５０ｂｐと大変小さいために、
用いて電気泳動し、バンドを 遺伝子改変マウス作製
条件特異的遺伝子改変マウスの作成（過剰発現）
子宮内胎児脳電気穿孔法による
析スクリーニングにより、発達期の神経幹細胞の 分化、細胞移動を制御する因子として、
が見いだされた。現在そのターゲット分子を探索 中であるが、一般的にマイクロ
mRNAを持つと考えられている。従って、
胎生致死を避けるために、非特異的な初期胚から の過剰発現ではなく、条件特異的に過剰発現並び に、発現を低下させることが必要であると考えら
そこで、Cre‑loxp
下に発現を誘導できるベクターを受精 卵にインジェクションすることでトランスジェ ニックマウスを作成する。最終的には、
マウスとの交配により、神経幹細胞特異的 過剰発現マウスを作成し、解剖学的
特に、統合失調症モデル動物としては、脳体積の低 下などが報告され(Neuron 2007 Clapcote
トランスジェニックマウス作製にあたり、
実験を行うことで、発現プラスミドが適切に できているかどうかを検討した。
日のマウス胎児より、髄膜を切離 した皮質のみを単離し、トリプシンで
DMEMにてトリプシンを不活性 化し、ピペッティングにより神経細胞を完全に分離 する。トリパンブルー染色にて生細胞と死細胞を染 め分け、生細胞のみを、ポリLリシンコートされた 培養皿に播種し培養する。
(nucleofection)
神経細胞に、遺伝子導入する際には、電気穿孔 法を用いた。1.1で単離培養した
5 x106個 用 い た 。
Nuclefector solution 100μlに神経細胞を再懸濁 し、更にプラスミドを２μg〜３μ
ベットに入れ、電気穿孔を行なった後に、培養液 中に播種した。４時間から16時間後に無血清培地 に交換し、１，２日培養した。
mature 配列を特異的に認識す を用いた。サン
伝子導入した皮質神経細胞から、トリゾール試薬、
RNA を採取し、逆転写を行なっ た後に、上記のプライマーを用いて
産物が５０ｂｐと大変小さいために、
バンドを確認した。
作製
条件特異的遺伝子改変マウスの作成（過剰発現）
電気穿孔法による
析スクリーニングにより、発達期の神経幹細胞の 分化、細胞移動を制御する因子として、
が見いだされた。現在そのターゲット分子を探索 中であるが、一般的にマイクロRNA
を持つと考えられている。従って、
胎生致死を避けるために、非特異的な初期胚から の過剰発現ではなく、条件特異的に過剰発現並び に、発現を低下させることが必要であると考えら
loxpシステムを利用し、
下に発現を誘導できるベクターを受精 卵にインジェクションすることでトランスジェ ニックマウスを作成する。最終的には、
マウスとの交配により、神経幹細胞特異的 過剰発現マウスを作成し、解剖学的検討を行う 特に、統合失調症モデル動物としては、脳体積の低
(Neuron 2007 Clapcote トランスジェニックマウス作製にあたり、in
実験を行うことで、発現プラスミドが適切に
日のマウス胎児より、髄膜を切離 した皮質のみを単離し、トリプシンで37℃30分間処 にてトリプシンを不活性 化し、ピペッティングにより神経細胞を完全に分離 する。トリパンブルー染色にて生細胞と死細胞を染 リシンコートされた
(nucleofection)
神経細胞に、遺伝子導入する際には、電気穿孔 で単離培養した 個 用 い た 。 Mouse Neuron
に神経細胞を再懸濁 μg懸濁し、キュ ベットに入れ、電気穿孔を行なった後に、培養液 時間後に無血清培地
配列を特異的に認識す を用いた。サンプルは1.2で遺 伝子導入した皮質神経細胞から、トリゾール試薬、
を採取し、逆転写を行なっ た後に、上記のプライマーを用いてPCRを行い、
産物が５０ｂｐと大変小さいために、3.5％ゲルを 確認した。
条件特異的遺伝子改変マウスの作成（過剰発現）
電気穿孔法によるin vivo機能解 析スクリーニングにより、発達期の神経幹細胞の 分化、細胞移動を制御する因子として、miR‑
が見いだされた。現在そのターゲット分子を探索 RNAは、複数のタ を持つと考えられている。従って、
胎生致死を避けるために、非特異的な初期胚から の過剰発現ではなく、条件特異的に過剰発現並び に、発現を低下させることが必要であると考えら
システムを利用し、
下に発現を誘導できるベクターを受精 卵にインジェクションすることでトランスジェ ニックマウスを作成する。最終的には、nestin Cre
マウスとの交配により、神経幹細胞特異的miR‑
検討を行う（図 特に、統合失調症モデル動物としては、脳体積の低
(Neuron 2007 Clapcoteら)皮質の in 実験を行うことで、発現プラスミドが適切に
日のマウス胎児より、髄膜を切離 分間処 にてトリプシンを不活性 化し、ピペッティングにより神経細胞を完全に分離 する。トリパンブルー染色にて生細胞と死細胞を染 リシンコートされた
神経細胞に、遺伝子導入する際には、電気穿孔 で単離培養した Mouse Neuron に神経細胞を再懸濁
懸濁し、キュ ベットに入れ、電気穿孔を行なった後に、培養液 時間後に無血清培地
配列を特異的に認識す で遺 伝子導入した皮質神経細胞から、トリゾール試薬、
を採取し、逆転写を行なっ を行い、PCR
％ゲルを
条件特異的遺伝子改変マウスの作成（過剰発現）
機能解 析スクリーニングにより、発達期の神経幹細胞の
‑484 が見いだされた。現在そのターゲット分子を探索 は、複数のタ を持つと考えられている。従って、
胎生致死を避けるために、非特異的な初期胚から の過剰発現ではなく、条件特異的に過剰発現並び に、発現を低下させることが必要であると考えら システムを利用し、CAG 下に発現を誘導できるベクターを受精 卵にインジェクションすることでトランスジェ nestin Cre
‑484
（図1）。 特に、統合失調症モデル動物としては、脳体積の低
皮質の
厚みや、神経細胞密度といった解剖学的な発生異常 を検討する。
２‑
次に、内在性の マイクロ
Biotech 2007 Nat Methods 2009
の優れているところは、複数の遺伝子座から発現す るマイクロ
ることが可能であることである。また、トランスジ ェニックマウスを作成する方法と全く同等に簡便に 作成することができるため、条件特異的ノックアウ トマウスよりも優先して、作成するべきと考えられ た(
２‑
The Wellcome Trust Sanger Institute よる
ス 作 成 プ ロ ジ ェ ク ト 840
マウスの初期胚にインジェクションし、キメラマウ スを作成する。キメラマウスのキメラ率を算出し、
キメラ率の高いマウスを優先的に野生型マウスと交 配させることで、
の ES
（図
厚みや、神経細胞密度といった解剖学的な発生異常 を検討する。
‑２条件特異的遺伝子改変マウスの作成（発現低下）
次に、内在性の マイクロRNA吸着性
Biotech 2007 Nat Methods 2009
の優れているところは、複数の遺伝子座から発現す るマイクロRNA
ることが可能であることである。また、トランスジ ェニックマウスを作成する方法と全く同等に簡便に 作成することができるため、条件特異的ノックアウ トマウスよりも優先して、作成するべきと考えられ
(図2)。
‑３ノックアウトマウス作成
The Wellcome Trust Sanger Institute よる microRNA
ス 作 成 プ ロ ジ ェ ク ト 840‑845(2011))
マウスの初期胚にインジェクションし、キメラマウ スを作成する。キメラマウスのキメラ率を算出し、
キメラ率の高いマウスを優先的に野生型マウスと交 配させることで、
ES 細胞由来の遺伝子伝播を
（図 3）。
(図3)
厚みや、神経細胞密度といった解剖学的な発生異常
条件特異的遺伝子改変マウスの作成（発現低下）
次に、内在性のmiR‑484の発現を低下させるために、
吸着性GFP融合蛋白発現を行う。
Biotech 2007 Nat Methods 2009
の優れているところは、複数の遺伝子座から発現す RNAであっても、全て吸着して、低下させ ることが可能であることである。また、トランスジ ェニックマウスを作成する方法と全く同等に簡便に 作成することができるため、条件特異的ノックアウ トマウスよりも優先して、作成するべきと考えられ
ノックアウトマウス作成
The Wellcome Trust Sanger Institute
microRNA に対する網羅的なノックアウトマウ ス 作 成 プ ロ ジ ェ ク ト (Nature Biotechnology 29
845(2011))により作成された
マウスの初期胚にインジェクションし、キメラマウ スを作成する。キメラマウスのキメラ率を算出し、
キメラ率の高いマウスを優先的に野生型マウスと交 配させることで、F1 マウスを作出する。
細胞由来の遺伝子伝播を
3)
厚みや、神経細胞密度といった解剖学的な発生異常
条件特異的遺伝子改変マウスの作成（発現低下）
の発現を低下させるために、
融合蛋白発現を行う。
Biotech 2007 Nat Methods 2009 Genter
の優れているところは、複数の遺伝子座から発現す であっても、全て吸着して、低下させ ることが可能であることである。また、トランスジ ェニックマウスを作成する方法と全く同等に簡便に 作成することができるため、条件特異的ノックアウ トマウスよりも優先して、作成するべきと考えられ
ノックアウトマウス作成
The Wellcome Trust Sanger Institute
に対する網羅的なノックアウトマウ (Nature Biotechnology 29 により作成された ES
マウスの初期胚にインジェクションし、キメラマウ スを作成する。キメラマウスのキメラ率を算出し、
キメラ率の高いマウスを優先的に野生型マウスと交 マウスを作出する。
細胞由来の遺伝子伝播を PCR 法により確認する 厚みや、神経細胞密度といった解剖学的な発生異常
条件特異的遺伝子改変マウスの作成（発現低下）
の発現を低下させるために、
融合蛋白発現を行う。(Nat Genterら)この方法 の優れているところは、複数の遺伝子座から発現す であっても、全て吸着して、低下させ ることが可能であることである。また、トランスジ ェニックマウスを作成する方法と全く同等に簡便に 作成することができるため、条件特異的ノックアウ トマウスよりも優先して、作成するべきと考えられ
The Wellcome Trust Sanger Institute のチームに に対する網羅的なノックアウトマウ (Nature Biotechnology 29
ES 細胞を購入し、
マウスの初期胚にインジェクションし、キメラマウ スを作成する。キメラマウスのキメラ率を算出し、
キメラ率の高いマウスを優先的に野生型マウスと交 マウスを作出する。F1 マウスへ 法により確認する 厚みや、神経細胞密度といった解剖学的な発生異常
条件特異的遺伝子改変マウスの作成（発現低下）
の発現を低下させるために、
(Nat この方法 の優れているところは、複数の遺伝子座から発現す であっても、全て吸着して、低下させ ることが可能であることである。また、トランスジ ェニックマウスを作成する方法と全く同等に簡便に 作成することができるため、条件特異的ノックアウ トマウスよりも優先して、作成するべきと考えられ
のチームに に対する網羅的なノックアウトマウ (Nature Biotechnology 29
細胞を購入し、
マウスの初期胚にインジェクションし、キメラマウ スを作成する。キメラマウスのキメラ率を算出し、
キメラ率の高いマウスを優先的に野生型マウスと交 マウスへ 法により確認する
３ ３
み込んでいるため、
の発現確認ができない。従って、
と交配させることにより、脳内特異的に ムが適切に働いているかを確認する。
るため、
PFA い、
クライオスタットにて４０ 切片をスライドにのせ、
た。
3−
染色を行い、切片の写真を
し、写真を専用のソフトウェアを用いて連結した。
弱拡大の一枚の写真として層構造などを比較検討し た。
４ ４ cm
の真上にカメラを設置し、全自動でマウスの動きを データ化する。
ような
クスに統一して実験を行った。
るような実験用の別の箱内で、マウスの状態を安定 化させる。その後に、
実験をスタート には
が 間 (立 間
３ 解剖学的解析法
３‑１ GFP免疫染色法による （図１、2）
み込んでいるため、
の発現確認ができない。従って、
と交配させることにより、脳内特異的に ムが適切に働いているかを確認する。
具体的には、目的配列は
るため、GFP蛋白が脳内で発現すると考えられる。
産まれてきたトランスジェニックマウスを、４％
PFAで灌流固定し、
い、OCTコンパウンドに包埋し、組織を凍結した後、
クライオスタットにて４０ 切片をスライドにのせ、
た。
−2 Nissl また、解剖学的に 染色を行い、切片の写真を
し、写真を専用のソフトウェアを用いて連結した。
弱拡大の一枚の写真として層構造などを比較検討し た。
４ 行動学的解析法
４‑１オープンフィールドテスト
解析装置は、小原医科産業株式会社製。
cm のフィールドを、防音箱で取り囲み、フィールド の真上にカメラを設置し、全自動でマウスの動きを データ化する。
ような障害物
クスに統一して実験を行った。
少なくとも実験直前の
るような実験用の別の箱内で、マウスの状態を安定 化させる。その後に、
実験をスタート には壁際に滞在 が高いものでは 間行った。行動距離
立ち上がり)
間・中央区画滞在時間
解剖学的解析法
免疫染色法による
）に示されるとおり
み込んでいるため、Creを発現させないと目的遺伝子 の発現確認ができない。従って、
と交配させることにより、脳内特異的に ムが適切に働いているかを確認する。
具体的には、目的配列は
蛋白が脳内で発現すると考えられる。
産まれてきたトランスジェニックマウスを、４％
で灌流固定し、30％スクロースにて凍結防止を行 コンパウンドに包埋し、組織を凍結した後、
クライオスタットにて４０ 切片をスライドにのせ、GFP
Nissl染色法
、解剖学的に脳構造を解析するために、
染色を行い、切片の写真を
し、写真を専用のソフトウェアを用いて連結した。
弱拡大の一枚の写真として層構造などを比較検討し
行動学的解析法
オープンフィールドテスト
解析装置は、小原医科産業株式会社製。
のフィールドを、防音箱で取り囲み、フィールド の真上にカメラを設置し、全自動でマウスの動きを データ化する。（図 4）実験箱内部
障害物や突起などがな クスに統一して実験を行った。
少なくとも実験直前の
るような実験用の別の箱内で、マウスの状態を安定 化させる。その後に、被験体を実験箱の中央に置き、
実験をスタートする。新規条件 滞在することが
いものでは中央部を行き来する。
行動距離・平均速度 )・回転行動
中央区画滞在時間を算出した。
免疫染色法によるCALSLシステムの確認 に示されるとおりstop
を発現させないと目的遺伝子 の発現確認ができない。従って、Nestin
と交配させることにより、脳内特異的に ムが適切に働いているかを確認する。
具体的には、目的配列はGFPのmRNA
蛋白が脳内で発現すると考えられる。
産まれてきたトランスジェニックマウスを、４％
％スクロースにて凍結防止を行 コンパウンドに包埋し、組織を凍結した後、
クライオスタットにて４０μm厚に薄切し、凍結浮遊 GFPに対する免疫染色を行っ
脳構造を解析するために、
染色を行い、切片の写真をKEYENCE BD
し、写真を専用のソフトウェアを用いて連結した。
弱拡大の一枚の写真として層構造などを比較検討し
オープンフィールドテスト
解析装置は、小原医科産業株式会社製。
のフィールドを、防音箱で取り囲み、フィールド の真上にカメラを設置し、全自動でマウスの動きを
実験箱内部には
などがない。また、光量は クスに統一して実験を行った。
少なくとも実験直前の 30 分間は、
るような実験用の別の箱内で、マウスの状態を安定 被験体を実験箱の中央に置き、
新規条件におびえている することが多く、アクティビティー
を行き来する。
平均速度・軌跡
・回転行動(右回り/左回り を算出した。
システムの確認 stop配列をloxpで挟 を発現させないと目的遺伝子 Nestin‑Creマウス と交配させることにより、脳内特異的にCALSLシステ ムが適切に働いているかを確認する。
mRNAと融合されてい 蛋白が脳内で発現すると考えられる。
産まれてきたトランスジェニックマウスを、４％
％スクロースにて凍結防止を行 コンパウンドに包埋し、組織を凍結した後、
厚に薄切し、凍結浮遊 に対する免疫染色を行っ
脳構造を解析するために、Nissl KEYENCE BD‑9000にて取得 し、写真を専用のソフトウェアを用いて連結した。
弱拡大の一枚の写真として層構造などを比較検討し
解析装置は、小原医科産業株式会社製。40cm のフィールドを、防音箱で取り囲み、フィールド の真上にカメラを設置し、全自動でマウスの動きを には特異点になる い。また、光量は 70 分間は、70 ルクスとな るような実験用の別の箱内で、マウスの状態を安定 被験体を実験箱の中央に置き、
におびえている場合 アクティビティー を行き来する。1 試行は 10
軌跡・リアリング 左回り)・無動時
（図4 システムの確認
で挟 を発現させないと目的遺伝子 マウス システ と融合されてい 蛋白が脳内で発現すると考えられる。
産まれてきたトランスジェニックマウスを、４％
％スクロースにて凍結防止を行 コンパウンドに包埋し、組織を凍結した後、
厚に薄切し、凍結浮遊 に対する免疫染色を行っ
Nissl にて取得 し、写真を専用のソフトウェアを用いて連結した。
弱拡大の一枚の写真として層構造などを比較検討し
X 40 のフィールドを、防音箱で取り囲み、フィールド の真上にカメラを設置し、全自動でマウスの動きを になる 70 ル ルクスとな るような実験用の別の箱内で、マウスの状態を安定 被験体を実験箱の中央に置き、
場合 アクティビティー 10 分
・リアリング
・無動時
４‑
解析装置は、
準備は、オープンフィールドテストと同様に行う。。
専用の尾懸垂シールを尾に貼り付け、図のように吊 下具に引っ掛ける。（図
被験体は、
ラで
映像をコンピュータ ーの画像キャプチャ ーボードを介してと りこまれる。
5分間の間に、無 動となる時間を目視 で判定し、時間を計 測する
遺伝子型は、測定者 には明示されておら ず、ブラインドで 測定した。
４‑
解析装置は、尾懸垂試験用のものと同じ。またマウ スの準備は２−２と同様である。右記に示すシリンダ ーは透明アクリル
製であり、
シリンダー水槽 寸法は直径 高さ
（図
実験前日より 準備した、
°C 張り 強制水泳を 実施する。
無動時間は
のセッションの後半 4
状態を計測する。
上動かなくなるまでの時間を測定する。
C.
１．
1 成(
が に、まず
低下遺伝子改変マウスを作成することを優先して行 った。
た皮質神経細胞に、
入を行い、コントロールベクターと 4）
‑２尾懸垂試験法 解析装置は、
準備は、オープンフィールドテストと同様に行う。。
専用の尾懸垂シールを尾に貼り付け、図のように吊 下具に引っ掛ける。（図
被験体は、CCD ラで撮影され、この 映像をコンピュータ ーの画像キャプチャ ーボードを介してと りこまれる。
分間の間に、無 となる時間を目視 で判定し、時間を計 測する。マウスの 遺伝子型は、測定者 には明示されておら ず、ブラインドで 測定した。
‑３強制水泳試験法
解析装置は、尾懸垂試験用のものと同じ。またマウ スの準備は２−２と同様である。右記に示すシリンダ ーは透明アクリル
製であり、
シリンダー水槽 寸法は直径10cm 高さ25cmである
（図6）
実験前日より 準備した、21〜
°Cの水を 8 cm 張り, 6 分間の 強制水泳を 実施する。
無動時間は,この のセッションの後半
4 分間に生じる 状態を計測する。
上動かなくなるまでの時間を測定する。
研究結果
１．遺伝子改変マウス 1−1 miR‑484
(図１、2)で示されるとおり、
が in vivo において有効に働くことを確認するため に、まず GFP と共に発現させることができる、発現 低下遺伝子改変マウスを作成することを優先して行 った。 胎生 15
た皮質神経細胞に、
入を行い、コントロールベクターと 尾懸垂試験法
解析装置は、小原医科産業株式会社製。
準備は、オープンフィールドテストと同様に行う。。
専用の尾懸垂シールを尾に貼り付け、図のように吊 下具に引っ掛ける。（図5）
CCDカメ 撮影され、この 映像をコンピュータ ーの画像キャプチャ ーボードを介してと
分間の間に、無
となる時間を目視 で判定し、時間を計
。マウスの 遺伝子型は、測定者 には明示されておら ず、ブラインドで
強制水泳試験法
解析装置は、尾懸垂試験用のものと同じ。またマウ スの準備は２−２と同様である。右記に示すシリンダ ーは透明アクリル
シリンダー水槽 10cm である
〜23 cm 分間の
この6 分間 のセッションの後半
じる無動
状態を計測する。また、測定開始後、初めて１秒以 上動かなくなるまでの時間を測定する。
研究結果
遺伝子改変マウス作製
484 条件特異的ノックダウンマウスの作 で示されるとおり、
において有効に働くことを確認するため と共に発現させることができる、発現 低下遺伝子改変マウスを作成することを優先して行 15 日齢のマウスの皮質より単離培養し た皮質神経細胞に、nucleofector
入を行い、コントロールベクターと 小原医科産業株式会社製。
準備は、オープンフィールドテストと同様に行う。。
専用の尾懸垂シールを尾に貼り付け、図のように吊
）
解析装置は、尾懸垂試験用のものと同じ。またマウ スの準備は２−２と同様である。右記に示すシリンダ
また、測定開始後、初めて１秒以 上動かなくなるまでの時間を測定する。
作製
条件特異的ノックダウンマウスの作 で示されるとおり、Cre‑
において有効に働くことを確認するため と共に発現させることができる、発現 低下遺伝子改変マウスを作成することを優先して行 日齢のマウスの皮質より単離培養し nucleofector を用いて遺伝子導 入を行い、コントロールベクターと
小原医科産業株式会社製。マウスの 準備は、オープンフィールドテストと同様に行う。。
専用の尾懸垂シールを尾に貼り付け、図のように吊
解析装置は、尾懸垂試験用のものと同じ。またマウ スの準備は２−２と同様である。右記に示すシリンダ
また、測定開始後、初めて１秒以 上動かなくなるまでの時間を測定する。
条件特異的ノックダウンマウスの作
‑Loxp システム において有効に働くことを確認するため と共に発現させることができる、発現 低下遺伝子改変マウスを作成することを優先して行 日齢のマウスの皮質より単離培養し を用いて遺伝子導 入を行い、コントロールベクターと GFPmiR484T X4
（図5）
（図6）
マウスの 準備は、オープンフィールドテストと同様に行う。。
専用の尾懸垂シールを尾に貼り付け、図のように吊
解析装置は、尾懸垂試験用のものと同じ。またマウ スの準備は２−２と同様である。右記に示すシリンダ
また、測定開始後、初めて１秒以
条件特異的ノックダウンマウスの作 システム において有効に働くことを確認するため と共に発現させることができる、発現 低下遺伝子改変マウスを作成することを優先して行 日齢のマウスの皮質より単離培養し を用いて遺伝子導 GFPmiR484T X4
）
）
発現ベクターをそれぞれ過剰発現した。皮質神経細 胞には
ーン目で確認されるとおり、
ンドが４０ｂｐ〜６０ るが、一方、
る GFP PCR 7）
過剰発現することにより、
異的に低下させることができると考え、この発現ベ クターを用いてまずトランスジェニックマウスを作
成した。
ベクターの遺伝子導入の有り無しにより、
現が明瞭にコントロールされていることが確認され ている。
1−
示されるベクターを構築し、
ず、
胎生 経細胞に、
入を行 pCALSLmiR484
回収したサンプルにて、
ベクター依存的に起こることを確認した。（図 ランスフェクション効率を考えると十分に過剰発現 されていると考えられた。
Cre Vector 無し
発現ベクターをそれぞれ過剰発現した。皮質神経細 胞には microRNA
ーン目で確認されるとおり、
ンドが４０ｂｐ〜６０ るが、一方、
る(Nat Biotech 2007 Nat GFP‑miR484TX4
PCR バンドが消失していることが確認されている
）。このことにより、この発現プラスミドを脳内で 過剰発現することにより、
異的に低下させることができると考え、この発現ベ クターを用いてまずトランスジェニックマウスを作
成した。
また、図 8 に示されるとおり、皮質神経細胞に ベクターの遺伝子導入の有り無しにより、
現が明瞭にコントロールされていることが確認され ている。
−2 miR‑484条件特異的過剰発現マウス作成 次に、過剰発現を条件特異的に行うために、図 示されるベクターを構築し、
ず、in vitro
胎生15日齢のマウスの皮質より単離培養した皮質神 経細胞に、Amaxa
入を行った。
pCALSLmiR484
回収したサンプルにて、
ベクター依存的に起こることを確認した。（図 ランスフェクション効率を考えると十分に過剰発現 されていると考えられた。
Cre Vector 有り
Cre Vector 無し
(図8)
発現ベクターをそれぞれ過剰発現した。皮質神経細 microRNA‑484 が発現していることから、１レ ーン目で確認されるとおり、
ンドが４０ｂｐ〜６０bp
るが、一方、miR‑484 を吸着させることが期待され (Nat Biotech 2007 Nat
miR484TX4 を発現させることにより、
バンドが消失していることが確認されている
。このことにより、この発現プラスミドを脳内で 過剰発現することにより、
異的に低下させることができると考え、この発現ベ クターを用いてまずトランスジェニックマウスを作
に示されるとおり、皮質神経細胞に ベクターの遺伝子導入の有り無しにより、
現が明瞭にコントロールされていることが確認され
条件特異的過剰発現マウス作成 に、過剰発現を条件特異的に行うために、図 示されるベクターを構築し、
in vitroにおいて有効に働くことを確認した。
日齢のマウスの皮質より単離培養した皮質神 Amaxa社製nucleofector
った。コントロールベクターと pCALSLmiR484ベクターの遺伝子導入 回収したサンプルにて、
ベクター依存的に起こることを確認した。（図 ランスフェクション効率を考えると十分に過剰発現 されていると考えられた。
(図7)
発現ベクターをそれぞれ過剰発現した。皮質神経細 が発現していることから、１レ ーン目で確認されるとおり、microRNA
bp の間にはっきりと認められ を吸着させることが期待され (Nat Biotech 2007 Nat Methods 2009 Genter
を発現させることにより、
バンドが消失していることが確認されている
。このことにより、この発現プラスミドを脳内で 過剰発現することにより、miR‑484 の発現を条件特 異的に低下させることができると考え、この発現ベ クターを用いてまずトランスジェニックマウスを作
に示されるとおり、皮質神経細胞に ベクターの遺伝子導入の有り無しにより、
現が明瞭にコントロールされていることが確認され
条件特異的過剰発現マウス作成 に、過剰発現を条件特異的に行うために、図 示されるベクターを構築し、Cre‑Loxp
において有効に働くことを確認した。
日齢のマウスの皮質より単離培養した皮質神 nucleofectorを用いて遺伝子導 コントロールベクターと
の遺伝子導入を行い、
回収したサンプルにて、miR‑484の過剰発現が、
ベクター依存的に起こることを確認した。（図 ランスフェクション効率を考えると十分に過剰発現 されていると考えられた。
発現ベクターをそれぞれ過剰発現した。皮質神経細 が発現していることから、１レ
microRNA‑484 の PCR の間にはっきりと認められ を吸着させることが期待され
Methods 2009 Genter を発現させることにより、miR‑484 バンドが消失していることが確認されている（図
。このことにより、この発現プラスミドを脳内で の発現を条件特 異的に低下させることができると考え、この発現ベ クターを用いてまずトランスジェニックマウスを作
に示されるとおり、皮質神経細胞に ベクターの遺伝子導入の有り無しにより、GFP の発 現が明瞭にコントロールされていることが確認され
条件特異的過剰発現マウス作成 に、過剰発現を条件特異的に行うために、図
Loxpシステムが において有効に働くことを確認した。
日齢のマウスの皮質より単離培養した皮質神 を用いて遺伝子導 コントロールベクターとCreベクター
を行い、2日後に の過剰発現が、
ベクター依存的に起こることを確認した。（図9）ト ランスフェクション効率を考えると十分に過剰発現 発現ベクターをそれぞれ過剰発現した。皮質神経細 が発現していることから、１レ PCR バ の間にはっきりと認められ を吸着させることが期待され Methods 2009 Genter ら)
484 の バンドが消失していることが確認されている（図
。このことにより、この発現プラスミドを脳内で の発現を条件特 異的に低下させることができると考え、この発現ベ クターを用いてまずトランスジェニックマウスを作
に示されるとおり、皮質神経細胞に Cre の発 現が明瞭にコントロールされていることが確認され
に、過剰発現を条件特異的に行うために、図1に システムがま において有効に働くことを確認した。
日齢のマウスの皮質より単離培養した皮質神 を用いて遺伝子導 ベクター、
日後に の過剰発現が、Cre
）ト ランスフェクション効率を考えると十分に過剰発現
左から Cre(
Cre Cre 2
を共発現させること で、
を用いると、
miR 約
させることができた。
過剰発現
ファウンダーマウスは候補が 結果、
あった。（図
ファウンダーマウスと
オスのファウンダーマウスが得られ、
明瞭な結果であったため、過剰発現トランスジェニ ックマウスが作成されたと考え、交配を開始した。
メスの
念なことに、合計約
が、トランスジーンを持ったマウスが生まれず、
条件等も可能な限りの条件を試したが、改善されな かったため、作成の継続を断念した。
1‑3
MMRRC(Mutant Mouse Regional Resource Centers) より
初期胚にインジェクションして、キメラマウスを作 成した。キメラマウスのキメラ率は、一回目：
以下が 二回目：
と極めてキメラ率が低いマウスが得られたが、時に、
非常に低いキメラ率のキメラマウスから生殖系列を 経て次世代に遺伝子が伝播される可能性があるため、
それぞれ、約 採取後、
トロールとして、
り、右から
ントロールに対して、仔 使っての
右から、
別のゲルにて 2〜
5 レーン：ネガティブコントロール 左から
Cre(‑) Cre 0.２μg Cre 2 μg
を共発現させること で、Cre2μg を用いると、
miR‑484 が 約 1．5 倍に増加 させることができた。
過剰発現ファウンダーマウスの ファウンダーマウスは候補が 結果、
下図
に示されるとおり、あった。（図 10
ファウンダーマウスと
オスのファウンダーマウスが得られ、
明瞭な結果であったため、過剰発現トランスジェニ ックマウスが作成されたと考え、交配を開始した。
メスの Nestin‑
念なことに、合計約
が、トランスジーンを持ったマウスが生まれず、
条件等も可能な限りの条件を試したが、改善されな かったため、作成の継続を断念した。
3 ノックアウトマウス作成
ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を 作 成 す る た め に MMRRC(Mutant Mouse Regional Resource Centers) より ES 細胞を購入し、遺伝子型、増殖能を確認後、
初期胚にインジェクションして、キメラマウスを作 成した。キメラマウスのキメラ率は、一回目：
以下が 2 匹
二回目：10％以下が
と極めてキメラ率が低いマウスが得られたが、時に、
非常に低いキメラ率のキメラマウスから生殖系列を 経て次世代に遺伝子が伝播される可能性があるため、
それぞれ、約 30
採取後、ES 細胞から採取した トロールとして、
り、右から 2 番めの ントロールに対して、仔 使っての PCR は約
右から、1 レーン：マーカー、１ 別のゲルにて 1
〜3 レーン陰性
レーン：ネガティブコントロール
を共発現させること 倍に増加 させることができた。
ファウンダーマウスの ファウンダーマウスは候補が
に示されるとおり、
10）
ファウンダーマウスと nestin
オスのファウンダーマウスが得られ、
明瞭な結果であったため、過剰発現トランスジェニ ックマウスが作成されたと考え、交配を開始した。
‑Cre マウスと交配させた。しかし、残 念なことに、合計約 50 匹ほどの仔マウスを作成した が、トランスジーンを持ったマウスが生まれず、
条件等も可能な限りの条件を試したが、改善されな かったため、作成の継続を断念した。
ノックアウトマウス作成
ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を 作 成 す る た め に MMRRC(Mutant Mouse Regional Resource Centers) 細胞を購入し、遺伝子型、増殖能を確認後、
初期胚にインジェクションして、キメラマウスを作 成した。キメラマウスのキメラ率は、一回目：
％以下が 1 匹
と極めてキメラ率が低いマウスが得られたが、時に、
非常に低いキメラ率のキメラマウスから生殖系列を 経て次世代に遺伝子が伝播される可能性があるため、
30〜50 匹ずつの仔マウスを得て、
細胞から採取した
トロールとして、PCR を行ったが、（図 番めの 3000bp
ントロールに対して、仔マウスから採取した
は約 130 匹ほど、全てが陰性であった。
レーン：マーカー、１ 1 レーン：マーカー
レーン陰性 4 レーンポジティブコントロール レーン：ネガティブコントロール
0.5 1.5
（図10
ファウンダーマウスの PCR 結果 ファウンダーマウスは候補が 10 匹生まれた。
に示されるとおり、2 匹のオスが陽性で
nestin‑Cre マウスとの交配 オスのファウンダーマウスが得られ、
明瞭な結果であったため、過剰発現トランスジェニ ックマウスが作成されたと考え、交配を開始した。
マウスと交配させた。しかし、残 匹ほどの仔マウスを作成した が、トランスジーンを持ったマウスが生まれず、
条件等も可能な限りの条件を試したが、改善されな かったため、作成の継続を断念した。
ノックアウトマウス作成
ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を 作 成 す る た め に MMRRC(Mutant Mouse Regional Resource Centers) 細胞を購入し、遺伝子型、増殖能を確認後、
初期胚にインジェクションして、キメラマウスを作 成した。キメラマウスのキメラ率は、一回目：
と極めてキメラ率が低いマウスが得られたが、時に、
非常に低いキメラ率のキメラマウスから生殖系列を 経て次世代に遺伝子が伝播される可能性があるため、
匹ずつの仔マウスを得て、
細胞から採取した DNA をポジティブコ を行ったが、（図
bp 付近に確認される陽性コ マウスから採取した
匹ほど、全てが陰性であった。
レーン：マーカー、１6 レーン全て陰性。
レーン：マーカー
レーンポジティブコントロール レーン：ネガティブコントロール
0 0.5 1 1.5 2
10）
結果
匹生まれた。PCR 匹のオスが陽性で
マウスとの交配 オスのファウンダーマウスが得られ、PCR 結果も 明瞭な結果であったため、過剰発現トランスジェニ ックマウスが作成されたと考え、交配を開始した。
マウスと交配させた。しかし、残 匹ほどの仔マウスを作成した が、トランスジーンを持ったマウスが生まれず、PCR 条件等も可能な限りの条件を試したが、改善されな かったため、作成の継続を断念した。
ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を 作 成 す る た め に MMRRC(Mutant Mouse Regional Resource Centers) 細胞を購入し、遺伝子型、増殖能を確認後、
初期胚にインジェクションして、キメラマウスを作 成した。キメラマウスのキメラ率は、一回目：30
と極めてキメラ率が低いマウスが得られたが、時に、
非常に低いキメラ率のキメラマウスから生殖系列を 経て次世代に遺伝子が伝播される可能性があるため、
匹ずつの仔マウスを得て、DNA をポジティブコ を行ったが、（図 11）に示す通
付近に確認される陽性コ マウスから採取した DNA 匹ほど、全てが陰性であった。
レーン全て陰性。
レーンポジティブコントロール
（図9）
PCR の 匹のオスが陽性で
マウスとの交配 結果も 明瞭な結果であったため、過剰発現トランスジェニ ックマウスが作成されたと考え、交配を開始した。
マウスと交配させた。しかし、残 匹ほどの仔マウスを作成した PCR 条件等も可能な限りの条件を試したが、改善されな
ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を 作 成 す る た め に MMRRC(Mutant Mouse Regional Resource Centers) 細胞を購入し、遺伝子型、増殖能を確認後、
初期胚にインジェクションして、キメラマウスを作 30％
と極めてキメラ率が低いマウスが得られたが、時に、
非常に低いキメラ率のキメラマウスから生殖系列を 経て次世代に遺伝子が伝播される可能性があるため、
DNA をポジティブコン
）に示す通 付近に確認される陽性コ DNA を 匹ほど、全てが陰性であった。
レーン全て陰性。
レーンポジティブコントロール
