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第16番染色体16p13.11内、新規脳発生関連miR‑484の遺伝子改変マウスによる神経発達疾患 モデル動物の確立
研究代表者 藤谷 昌司
大学院大阪大学・金沢大学・浜松医科大学・千葉大学・福井大学 連合小児発達学研究科 助教
研究分担者 なし
研究要旨
近年、精神疾患により医療機関にかかる患者数は大幅に増加しており、特に、統合失 調症患者は入院患者数の大半を占め、医療費への負担は、年々その割合を増している。に もかかわらず、有効な治療法は未だに開発されておらず、統合失調症を初めとする神経発 達疾患の新規治療法の開発研究に社会的要請が年々高まってきている。
また一方で、分子生物学、神経科学の進歩により、神経発達疾患のモデル動物において、
そのシグナル異常を動物個体内で改善することで、行動学的改善が認められることが報告 され、神経発達疾患のモデル動物を用いた分子生物学的治療法の開発が可能であることが 確認されつつある。
申請者はその遺伝子変異が神経発達疾患の原因となる第 16 番染色体短腕 16p13.11 に着 目して、新規の脳発生関連遺伝子 miR‑484 を見いだした。
この研究の目的は、miR‑484 の遺伝子改変マウスを作成し、行動学的解析を行うことで 16p13.11 遺伝子異常に関連する神経発達疾患モデル動物として確立することである。
そこで、神経幹細胞特異的に miR‑484 を in vitro で低下させる方法を確立し、miR‑484 発現低下トランスジェニックマウスの作成を試みた。条件特異的に目的遺伝子を発現可能 とする CALSL システムは、Cre recombinase の存在下で、GFP をレポーターとして動物個体 内でも正しく作動することが確認された。そして、神経幹細胞特異的にノックダウンする ために、Nestin‑Cre マウスと交配し、ダブルトランスジェニックマウスを作成した。ダブ ルトランスジェニックマウスを Nissl 染色により解剖学的に検討したが、各器官形成、皮 質の厚み、層構造、脳梁の厚み等の解剖学的構造に特に顕著な異常は認められなかった。
遅れていた過剰発現トランスジェニックマウスの作成を早急に行おうとした。ファウン ダーマウスを作成することができたが、得られた 3 匹から次世代のトランスジェニックマ ウスを得られることができなかった。また、予定に追加して、miR‑484 のノックアウトマウ スの作成を試みたが、キメラマウスのキメラ率が 10％程度と極めて低く、また、二度にわ たって同様の結果であり、ノックアウトマウスを作成することができなかった。
従って、唯一作成することができた、ノックダウントランスジェニックマウスにおける 行動学的解析を行った。まず、オープンフィールドテストにより、個体数が少ない時には、
多動傾向を示したものの、10 分間に移動する総距離は有意な変化が見られず、多動傾向は 認められなかった。また、中央区画滞在時間が反映すると考えられる、不安様行動につい ては、野生型との違いが認められたが、うつ様行動に関して、尾懸垂試験法、強制水泳試 験法にて解析したところ、特筆すべき有意な変化は認められなかった。今後は、miR‑484 以外のターゲット分子を発見していることから、それらの遺伝子改変マウスを用いての行 動学的テストなどを通じて、16p13.11 領域の重複、欠損による発達障害の病態メカニズム を明らかにしていきたいと考えている。
創薬基盤推進研究事業(創薬総合推進研究事業)
総括研究報告書
A.
大幅に増加して
患者数の大半を占め、医療費への負担は、年々その 割合を増している。にもかかわらず、有効な治療法 は未だに開発されておらず、統合失調症を初めとす る神経発達疾患の新規治療法の開発研究に社会的要 請が年々高まってきている。
神経発達疾患のモデル動物において、そのシグナル 異常を動物個体内で改善することで、行動学的改善 が認められることが報告され、神経発達疾患のモデ ル動物を用いた分子生物学的治療法の開発が可能で あることが確認されつつある。
なる第
の脳発生関連遺伝子 究の目的は、
行動学的解析を行うことで
関連する神経発達疾患モデル動物として確立するこ とである。
A. 研究目的
近年、精神疾患により医療機関にかかる患者数は 大幅に増加して
患者数の大半を占め、医療費への負担は、年々その 割合を増している。にもかかわらず、有効な治療法 は未だに開発されておらず、統合失調症を初めとす る神経発達疾患の新規治療法の開発研究に社会的要 請が年々高まってきている。
また一方で、分子生物学、神経科学の進歩により、
神経発達疾患のモデル動物において、そのシグナル 異常を動物個体内で改善することで、行動学的改善 が認められることが報告され、神経発達疾患のモデ ル動物を用いた分子生物学的治療法の開発が可能で あることが確認されつつある。
申請者はその遺伝子変異が神経発達疾患の原因と なる第 16 番染色体短腕
の脳発生関連遺伝子 究の目的は、miR
行動学的解析を行うことで
関連する神経発達疾患モデル動物として確立するこ とである。
研究目的
精神疾患により医療機関にかかる患者数は 大幅に増加しており、特に、統合失調症患者は入院 患者数の大半を占め、医療費への負担は、年々その 割合を増している。にもかかわらず、有効な治療法 は未だに開発されておらず、統合失調症を初めとす る神経発達疾患の新規治療法の開発研究に社会的要 請が年々高まってきている。
また一方で、分子生物学、神経科学の進歩により、
神経発達疾患のモデル動物において、そのシグナル 異常を動物個体内で改善することで、行動学的改善 が認められることが報告され、神経発達疾患のモデ ル動物を用いた分子生物学的治療法の開発が可能で あることが確認されつつある。
申請者はその遺伝子変異が神経発達疾患の原因と 番染色体短腕 16p13.
の脳発生関連遺伝子 miR‑
miR‑484 の遺伝子改変マウスを作成し、
行動学的解析を行うことで
関連する神経発達疾患モデル動物として確立するこ
精神疾患により医療機関にかかる患者数は おり、特に、統合失調症患者は入院 患者数の大半を占め、医療費への負担は、年々その 割合を増している。にもかかわらず、有効な治療法 は未だに開発されておらず、統合失調症を初めとす る神経発達疾患の新規治療法の開発研究に社会的要 請が年々高まってきている。
また一方で、分子生物学、神経科学の進歩により、
神経発達疾患のモデル動物において、そのシグナル 異常を動物個体内で改善することで、行動学的改善 が認められることが報告され、神経発達疾患のモデ ル動物を用いた分子生物学的治療法の開発が可能で あることが確認されつつある。
申請者はその遺伝子変異が神経発達疾患の原因と 16p13.11 に着目して、新規
‑484 を見いだした。この研 の遺伝子改変マウスを作成し、
行動学的解析を行うことで 16p13.11
関連する神経発達疾患モデル動物として確立するこ 精神疾患により医療機関にかかる患者数は おり、特に、統合失調症患者は入院 患者数の大半を占め、医療費への負担は、年々その 割合を増している。にもかかわらず、有効な治療法 は未だに開発されておらず、統合失調症を初めとす る神経発達疾患の新規治療法の開発研究に社会的要 また一方で、分子生物学、神経科学の進歩により、
神経発達疾患のモデル動物において、そのシグナル 異常を動物個体内で改善することで、行動学的改善 が認められることが報告され、神経発達疾患のモデ ル動物を用いた分子生物学的治療法の開発が可能で 申請者はその遺伝子変異が神経発達疾患の原因と に着目して、新規 を見いだした。この研 の遺伝子改変マウスを作成し、
16p13.11 遺伝子異常に 関連する神経発達疾患モデル動物として確立するこ
3
精神疾患により医療機関にかかる患者数はおり、特に、統合失調症患者は入院 患者数の大半を占め、医療費への負担は、年々その 割合を増している。にもかかわらず、有効な治療法 は未だに開発されておらず、統合失調症を初めとす る神経発達疾患の新規治療法の開発研究に社会的要 また一方で、分子生物学、神経科学の進歩により、
神経発達疾患のモデル動物において、そのシグナル 異常を動物個体内で改善することで、行動学的改善 が認められることが報告され、神経発達疾患のモデ ル動物を用いた分子生物学的治療法の開発が可能で 申請者はその遺伝子変異が神経発達疾患の原因と に着目して、新規 を見いだした。この研 の遺伝子改変マウスを作成し、
遺伝子異常に 関連する神経発達疾患モデル動物として確立するこ
現在 いるが、
統合失調症、精神発達遅滞などの神経発達疾患と関 連する重要な遺伝子座である。そこで申請者は、そ の部位に、病気の原因となる脳発生に関連する候補 遺伝子があると仮定した。そして、個々の遺伝子の 時系列に沿った発現解析を行い、
脳電気穿孔法による
った。その中で、出生前後の発達期の神経新生に重 要と考えられる、
申請者は新規の脳発生関連遺伝子である
神経発達疾患の原因候補遺伝子であると仮定し、具 体的には以下の目標について明らかにしていきたい と考えている。
◯24
の作成と、その脳の発生学的、解剖学的異常の有無 の解析
◯24
析を行うことによる特異的疾患モデル動物としての 確立が可能かどうかの解析。
現在申請者は、
いるが、この部位は
統合失調症、精神発達遅滞などの神経発達疾患と関 連する重要な遺伝子座である。そこで申請者は、そ の部位に、病気の原因となる脳発生に関連する候補 遺伝子があると仮定した。そして、個々の遺伝子の 時系列に沿った発現解析を行い、
脳電気穿孔法による
った。その中で、出生前後の発達期の神経新生に重 要と考えられる、
申請者は新規の脳発生関連遺伝子である
神経発達疾患の原因候補遺伝子であると仮定し、具 体的には以下の目標について明らかにしていきたい と考えている。
24 年度：miR
の作成と、その脳の発生学的、解剖学的異常の有無 の解析
24〜25 年度：神経発達疾患に関連した行動学的解 析を行うことによる特異的疾患モデル動物としての 確立が可能かどうかの解析。
申請者は、16p13.11
この部位は注意欠陥多動性障害
統合失調症、精神発達遅滞などの神経発達疾患と関 連する重要な遺伝子座である。そこで申請者は、そ の部位に、病気の原因となる脳発生に関連する候補 遺伝子があると仮定した。そして、個々の遺伝子の 時系列に沿った発現解析を行い、
脳電気穿孔法による in vivo
った。その中で、出生前後の発達期の神経新生に重 要と考えられる、miR‑484
申請者は新規の脳発生関連遺伝子である
神経発達疾患の原因候補遺伝子であると仮定し、具 体的には以下の目標について明らかにしていきたい と考えている。
miR‑484 の条件特異的遺伝子改変マウス の作成と、その脳の発生学的、解剖学的異常の有無 年度：神経発達疾患に関連した行動学的解 析を行うことによる特異的疾患モデル動物としての 確立が可能かどうかの解析。
16p13.11 に着目して研究を行って 注意欠陥多動性障害
統合失調症、精神発達遅滞などの神経発達疾患と関 連する重要な遺伝子座である。そこで申請者は、そ の部位に、病気の原因となる脳発生に関連する候補 遺伝子があると仮定した。そして、個々の遺伝子の 時系列に沿った発現解析を行い、RNAi
in vivo における機能解析を行 った。その中で、出生前後の発達期の神経新生に重 484 を見いだした。そこで、
申請者は新規の脳発生関連遺伝子である
神経発達疾患の原因候補遺伝子であると仮定し、具 体的には以下の目標について明らかにしていきたい の条件特異的遺伝子改変マウス の作成と、その脳の発生学的、解剖学的異常の有無 年度：神経発達疾患に関連した行動学的解 析を行うことによる特異的疾患モデル動物としての 確立が可能かどうかの解析。
に着目して研究を行って 注意欠陥多動性障害、てんかん、
統合失調症、精神発達遅滞などの神経発達疾患と関 連する重要な遺伝子座である。そこで申請者は、そ の部位に、病気の原因となる脳発生に関連する候補 遺伝子があると仮定した。そして、個々の遺伝子の RNAi と子宮内胎児 における機能解析を行 った。その中で、出生前後の発達期の神経新生に重 を見いだした。そこで、
申請者は新規の脳発生関連遺伝子である miR‑484 神経発達疾患の原因候補遺伝子であると仮定し、具 体的には以下の目標について明らかにしていきたい の条件特異的遺伝子改変マウス の作成と、その脳の発生学的、解剖学的異常の有無 年度：神経発達疾患に関連した行動学的解 析を行うことによる特異的疾患モデル動物としての
に着目して研究を行って
、てんかん、
統合失調症、精神発達遅滞などの神経発達疾患と関 連する重要な遺伝子座である。そこで申請者は、そ の部位に、病気の原因となる脳発生に関連する候補 遺伝子があると仮定した。そして、個々の遺伝子の と子宮内胎児 における機能解析を行 った。その中で、出生前後の発達期の神経新生に重 を見いだした。そこで、
484 が 神経発達疾患の原因候補遺伝子であると仮定し、具 体的には以下の目標について明らかにしていきたい の条件特異的遺伝子改変マウス の作成と、その脳の発生学的、解剖学的異常の有無 年度：神経発達疾患に関連した行動学的解 析を行うことによる特異的疾患モデル動物としての
Ｂ．研究方法 １
１
ニックマウスに準じた方法で、マウスを作成する。
具体的には、
な初期胚からの過剰発現ではなく、条件特異的に 過剰発現
そこで、
下に発現を誘導できるベクターを受精卵にインジ ェクションすることでトランスジェニックマウス を作成する
によりスクリーニングした後に、
nestin Cre 異的 討
胞密度といった解剖学的な発生異常を検討する。
１
The Wellcome Trust Sanger Institute よる
作成プロジェクト 45(2011))
の初期胚にインジェクションし、キメラマウスを作 成する。キメラマウスのキメラ率を算出し、キメラ 率の高いマウスを優先的に野生型マウスと交配させ ることで、
胞由来の遺伝子伝播を
２ ２ cm
Ｂ．研究方法 １遺伝子改変
１‑１条件特異的過剰発現マウスの作成
平成24年度に作成した、発現低下トランスジェ ニックマウスに準じた方法で、マウスを作成する。
具体的には、
な初期胚からの過剰発現ではなく、条件特異的に 過剰発現させることが必要であると考えられる そこで、Cre
下に発現を誘導できるベクターを受精卵にインジ ェクションすることでトランスジェニックマウス を作成する（図
によりスクリーニングした後に、
nestin Creマウスとの交配により、神経幹細胞特 異的miR‑484
討、行動学的検討
胞密度といった解剖学的な発生異常を検討する。
１‑２ノックアウトマウス作成
The Wellcome Trust Sanger Institute よるmicroRNA
作成プロジェクト
45(2011))により作成された
の初期胚にインジェクションし、キメラマウスを作 成する。キメラマウスのキメラ率を算出し、キメラ 率の高いマウスを優先的に野生型マウスと交配させ ることで、F1
胞由来の遺伝子伝播を
２ 行動学的解析法
２‑１オープンフィールドテスト
解析装置は、小原医科産業株式会社製。
cm のフィールドを、防音箱で取り囲み、フィールド Ｂ．研究方法
遺伝子改変マウス作製
条件特異的過剰発現マウスの作成
年度に作成した、発現低下トランスジェ ニックマウスに準じた方法で、マウスを作成する。
具体的には、胎生致死を避けるために、非特異的 な初期胚からの過剰発現ではなく、条件特異的に させることが必要であると考えられる Cre‑loxpシステムを利用し、
下に発現を誘導できるベクターを受精卵にインジ ェクションすることでトランスジェニックマウス
（図1）。ファウンダーマウス によりスクリーニングした後に、
マウスとの交配により、神経幹細胞特 484過剰発現マウスを作成し、解剖学的検
、行動学的検討を行う。
胞密度といった解剖学的な発生異常を検討する。
ノックアウトマウス作成
The Wellcome Trust Sanger Institute
microRNAに対する網羅的なノックアウトマウス 作成プロジェクト(Nature Biotechnology 29 840
により作成された
の初期胚にインジェクションし、キメラマウスを作 成する。キメラマウスのキメラ率を算出し、キメラ 率の高いマウスを優先的に野生型マウスと交配させ
F1マウスを作出する。
胞由来の遺伝子伝播をPCR
行動学的解析法
オープンフィールドテスト
解析装置は、小原医科産業株式会社製。
のフィールドを、防音箱で取り囲み、フィールド
条件特異的過剰発現マウスの作成
年度に作成した、発現低下トランスジェ ニックマウスに準じた方法で、マウスを作成する。
胎生致死を避けるために、非特異的 な初期胚からの過剰発現ではなく、条件特異的に させることが必要であると考えられる
システムを利用し、
下に発現を誘導できるベクターを受精卵にインジ ェクションすることでトランスジェニックマウス
ファウンダーマウス によりスクリーニングした後に、
マウスとの交配により、神経幹細胞特 過剰発現マウスを作成し、解剖学的検 を行う。皮質の厚みや、神経細 胞密度といった解剖学的な発生異常を検討する。
ノックアウトマウス作成
The Wellcome Trust Sanger Institute
に対する網羅的なノックアウトマウス (Nature Biotechnology 29 840 により作成されたES細胞を購入し、マウス の初期胚にインジェクションし、キメラマウスを作 成する。キメラマウスのキメラ率を算出し、キメラ 率の高いマウスを優先的に野生型マウスと交配させ
マウスを作出する。F1マウスへの PCR法により確認する（図
オープンフィールドテスト
解析装置は、小原医科産業株式会社製。
のフィールドを、防音箱で取り囲み、フィールド 条件特異的過剰発現マウスの作成
年度に作成した、発現低下トランスジェ ニックマウスに準じた方法で、マウスを作成する。
胎生致死を避けるために、非特異的 な初期胚からの過剰発現ではなく、条件特異的に させることが必要であると考えられる
システムを利用し、CAG promoter 下に発現を誘導できるベクターを受精卵にインジ ェクションすることでトランスジェニックマウス
ファウンダーマウスをPCR によりスクリーニングした後に、最終的には、
マウスとの交配により、神経幹細胞特 過剰発現マウスを作成し、解剖学的検 皮質の厚みや、神経細 胞密度といった解剖学的な発生異常を検討する。
The Wellcome Trust Sanger Instituteのチームに に対する網羅的なノックアウトマウス
(Nature Biotechnology 29 840 細胞を購入し、マウス の初期胚にインジェクションし、キメラマウスを作 成する。キメラマウスのキメラ率を算出し、キメラ 率の高いマウスを優先的に野生型マウスと交配させ
マウスへのES 法により確認する（図2
解析装置は、小原医科産業株式会社製。40cm のフィールドを、防音箱で取り囲み、フィールド
年度に作成した、発現低下トランスジェ ニックマウスに準じた方法で、マウスを作成する。
胎生致死を避けるために、非特異的 な初期胚からの過剰発現ではなく、条件特異的に させることが必要であると考えられる.
CAG promoter 下に発現を誘導できるベクターを受精卵にインジ ェクションすることでトランスジェニックマウス PCR法 最終的には、
マウスとの交配により、神経幹細胞特 過剰発現マウスを作成し、解剖学的検 皮質の厚みや、神経細 胞密度といった解剖学的な発生異常を検討する。
のチームに に対する網羅的なノックアウトマウス (Nature Biotechnology 29 840‑8 細胞を購入し、マウス の初期胚にインジェクションし、キメラマウスを作 成する。キメラマウスのキメラ率を算出し、キメラ 率の高いマウスを優先的に野生型マウスと交配させ ES細 2）。
X 40 のフィールドを、防音箱で取り囲み、フィールド
の真上にカメラを設置し、全自動でマウスの動きを データ化する。
ような
クスに統一して実験を行った。
少なくとも実験直前の
るような実験用の別の箱内で、マウスの状態を安定 化させる。その後に、
実験をスタート には
が高 間行った。
(立 間・
２
準備は、オープンフィールドテストと同様に行う。。
専用の尾懸垂シールを尾に貼り付け、図のように吊 下具に引っ掛ける。（図
被験体は、
ラで
映像をコンピュータ ーの画像キャプチャ ーボードを介してと りこまれる。
5分間の間に、無 動
で判定し、時間を計 測する
遺伝子型は、測定者 には明示されておら ず、ブラインドで 測定した。
２‑
解析装置は、尾懸垂試験用のものと同じ。またマウ スの準備は２−２と同様である。右記に示すシリンダ
（図
の真上にカメラを設置し、全自動でマウスの動きを データ化する。
ような障害物や
クスに統一して実験を行った。
少なくとも実験直前の
るような実験用の別の箱内で、マウスの状態を安定 化させる。その後に、
実験をスタート には壁際に滞在 高いものでは 行った。行動距離 立ち上がり)・回転行動
・中央区画滞在時間
２‑２尾懸垂試験法 解析装置は、
準備は、オープンフィールドテストと同様に行う。。
専用の尾懸垂シールを尾に貼り付け、図のように吊 下具に引っ掛ける。（図
被験体は、CCD ラで撮影され、この 映像をコンピュータ ーの画像キャプチャ ーボードを介してと りこまれる。
分間の間に、無 動となる時間を目視 で判定し、時間を計 測する。マウスの 遺伝子型は、測定者 には明示されておら ず、ブラインドで 測定した。
‑３強制水泳試験法
解析装置は、尾懸垂試験用のものと同じ。またマウ スの準備は２−２と同様である。右記に示すシリンダ
（図
3）
の真上にカメラを設置し、全自動でマウスの動きを データ化する。（図 3）実験箱内部
や突起などがな クスに統一して実験を行った。
少なくとも実験直前の 30
るような実験用の別の箱内で、マウスの状態を安定 化させる。その後に、被験体を実験箱の中央に置き、
実験をスタートする。新規条件 滞在することが
いものでは中央部を行き来する。
行動距離・平均速度
・回転行動(
中央区画滞在時間を算出した。
尾懸垂試験法
解析装置は、小原医科産業株式会社製。
準備は、オープンフィールドテストと同様に行う。。
専用の尾懸垂シールを尾に貼り付け、図のように吊 下具に引っ掛ける。（図
CCDカメ 撮影され、この 映像をコンピュータ ーの画像キャプチャ ーボードを介してと りこまれる。
分間の間に、無 となる時間を目視 で判定し、時間を計
。マウスの 遺伝子型は、測定者 には明示されておら ず、ブラインドで
強制水泳試験法
解析装置は、尾懸垂試験用のものと同じ。またマウ スの準備は２−２と同様である。右記に示すシリンダ の真上にカメラを設置し、全自動でマウスの動きを
実験箱内部には
などがない。また、光量は クスに統一して実験を行った。
30 分間は、
るような実験用の別の箱内で、マウスの状態を安定 被験体を実験箱の中央に置き、
新規条件におびえている することが多く、アクティビ
を行き来する。
平均速度・軌跡 (右回り/左回り を算出した。
小原医科産業株式会社製。
準備は、オープンフィールドテストと同様に行う。。
専用の尾懸垂シールを尾に貼り付け、図のように吊 下具に引っ掛ける。（図4）
解析装置は、尾懸垂試験用のものと同じ。またマウ スの準備は２−２と同様である。右記に示すシリンダ の真上にカメラを設置し、全自動でマウスの動きを には特異点になる い。また、光量は 70 分間は、70 ルクスとな るような実験用の別の箱内で、マウスの状態を安定 被験体を実験箱の中央に置き、
におびえている場合 アクティビティー を行き来する。1 試行は 10
軌跡・リアリング 左回り)・無動時
小原医科産業株式会社製。マウスの 準備は、オープンフィールドテストと同様に行う。。
専用の尾懸垂シールを尾に貼り付け、図のように吊
解析装置は、尾懸垂試験用のものと同じ。またマウ スの準備は２−２と同様である。右記に示すシリンダ
（図
4）
の真上にカメラを設置し、全自動でマウスの動きを になる 70 ル ルクスとな るような実験用の別の箱内で、マウスの状態を安定 被験体を実験箱の中央に置き、
場合 ティー 10 分
・リアリング
・無動時
マウスの 準備は、オープンフィールドテストと同様に行う。。
専用の尾懸垂シールを尾に貼り付け、図のように吊
解析装置は、尾懸垂試験用のものと同じ。またマウ スの準備は２−２と同様である。右記に示すシリンダ
）
ーは透明アクリル 製であり、
シリンダー水槽 寸法は直径 高さ
（図
実験前日より 準備した、
°C 張り 強制水泳を 実施する。
無動時間は
のセッションの後半 4
状態を計測する。
上動かなくなるまでの時間を測定する。
C．研究結果 １
(図１ in vitro 胎生
神経細胞に、
子導入を行 ター
2 日後に回収したサンプルにて、
が、
依存的に起こることを 確認した。（図
トランスフェク ション効率を考え ると十分に過剰発現 されていると考えら れた。
左から Cre(
Cre Cre 2
を共発現させること で、
miR ２
ファウンダーマウスは候補が 結果、
あった。（図
ーは透明アクリル 製であり、
シリンダー水槽 寸法は直径10cm 高さ25cmである
（図5）
実験前日より 準備した、21
°Cの水を 8 張り, 6 分間の 強制水泳を 実施する。
無動時間は,この のセッションの後半
4 分間に生じる 状態を計測する。
上動かなくなるまでの時間を測定する。
．研究結果
１ 遺伝子改変マウス 図１)で示されるとおり、
in vitro において有効に働くことを確認するために、
胎生 15 日齢のマウスの皮質より単離培養した皮質 神経細胞に、Amaxa
子導入を行った。
ター、pCALSLmiR484
日後に回収したサンプルにて、
が、Cre ベクター 依存的に起こることを 確認した。（図
トランスフェク ション効率を考え ると十分に過剰発現 されていると考えら れた。
左から Cre(‑) Cre 0.２μg Cre 2 μg
を共発現させること で、Cre2μg を用いると、
miR‑484 が約
２ ファウンダーマウスの ファウンダーマウスは候補が 結果、
下図
に示されるとおり、あった。（図 7
ーは透明アクリル シリンダー水槽
10cm である 実験前日より
21〜23 cm 分間の
この6 分間 のセッションの後半
じる無動
状態を計測する。また、測定開始後、初めて１秒以 上動かなくなるまでの時間を測定する。
遺伝子改変マウス作製 で示されるとおり、
において有効に働くことを確認するために、
日齢のマウスの皮質より単離培養した皮質 Amaxa 社製 nucleofector
った。コントロールベクターと pCALSLmiR484 ベクター
日後に回収したサンプルにて、
ベクター 依存的に起こることを 確認した。（図 6）
トランスフェク ション効率を考え ると十分に過剰発現 されていると考えら
g を共発現させること
を用いると、
が約 1．5 倍に増加させることができた。
ファウンダーマウスの ファウンダーマウスは候補が
に示されるとおり、
7）
（図
また、測定開始後、初めて１秒以 上動かなくなるまでの時間を測定する。
作製
で示されるとおり、Cre‑Loxp システムが
において有効に働くことを確認するために、
日齢のマウスの皮質より単離培養した皮質 nucleofector
コントロールベクターと ベクターの遺伝子導入 日後に回収したサンプルにて、miR‑
を用いると、
倍に増加させることができた。
ファウンダーマウスの PCR 結果
ファウンダーマウスは候補が 10 匹生まれた。
に示されるとおり、2 匹のオスが陽性で
0
0.5 1 1.5 2
（図
7）
また、測定開始後、初めて１秒以 上動かなくなるまでの時間を測定する。
システムがまず、
において有効に働くことを確認するために、
日齢のマウスの皮質より単離培養した皮質 nucleofector を用いて遺伝 コントロールベクターと Cre ベク の遺伝子導入を行い、
‑484 の過剰発現
倍に増加させることができた。
匹生まれた。PCR 匹のオスが陽性で
（図
5
5
また、測定開始後、初めて１秒以まず、
において有効に働くことを確認するために、
日齢のマウスの皮質より単離培養した皮質 を用いて遺伝 ベク を行い、
の過剰発現
倍に増加させることができた。
PCR の 匹のオスが陽性で
3.
配
オスのファウンダーマウスが得られ、
明瞭な結果であったため、過剰発現トランスジェニ ックマウスが作成されたと考え、交配を開始した。
メスの
念なことに、合計約
が、トランスジーンを持ったマウスが生まれず、
条件等も可能な限りの条件を試したが、改善されな かったため、作成の継続を断念した。
4.
MMRRC(Mutant Mouse Regional Resource Centers) より
初期胚にインジェクションして、キメラマウスを作 成した。キメラマウスのキメラ率は、一回目：
以下が 二回目：
と極めてキメラ率が低いマウスが得られたが、時に、
非常に低いキメラ率のキメラマウスから生殖系列 経て次世代に遺伝子が伝播される可能性があるため、
それぞれ、約 採取後、
トロールとして、
り、右から
ントロールに対して、仔 使っての
右から、
別のゲルにて 2〜
5 レーン：ネガティブコン
5．行動学的検査 5−0
生後
イピングにおいて行動学的に雌雄差を認めなかった ため、雌雄共に使用した。遺伝子型は基本的に同腹 仔を用いて実験を行った。それぞれの個体数は、
〜8
5）
3. ファウンダーマウスと
オスのファウンダーマウスが得られ、
明瞭な結果であったため、過剰発現トランスジェニ ックマウスが作成されたと考え、交配を開始した。
メスの Nestin‑
念なことに、合計約
が、トランスジーンを持ったマウスが生まれず、
条件等も可能な限りの条件を試したが、改善されな かったため、作成の継続を断念した。
. ノックアウトマウス作成
ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を 作 成 す る た め に MMRRC(Mutant Mouse Regional Resource Centers) より ES 細胞を購入し、遺伝子型、増殖能を確認後、
初期胚にインジェクションして、キメラマウスを作 成した。キメラマウスのキメラ率は、一回目：
以下が 2 匹
二回目：10％以下が
と極めてキメラ率が低いマウスが得られたが、時に、
非常に低いキメラ率のキメラマウスから生殖系列 経て次世代に遺伝子が伝播される可能性があるため、
それぞれ、約 30
採取後、ES 細胞から採取した トロールとして、
り、右から 2 番めの ントロールに対して、仔 使っての PCR は約
右から、1 レーン：マーカー、１ 別のゲルにて 1
〜3 レーン陰性
レーン：ネガティブコン
．行動学的検査 0 使用したマウス 生後 3〜5 ヶ月齢
イピングにおいて行動学的に雌雄差を認めなかった ため、雌雄共に使用した。遺伝子型は基本的に同腹 仔を用いて実験を行った。それぞれの個体数は、
8 確保することができた。
Wild type:
N‑Cre：ネスチンプロモーター下に するトランスジェニックマウス Calsl:平成
特異的にノックダウンするマウス。
と交配させない時は、ワイルドタイプマウスと 同様。
DTG ：脳内で、
ンする遺伝子改変マウス。ダブルトランスジェ ニックマウス
ファウンダーマウスと
オスのファウンダーマウスが得られ、
明瞭な結果であったため、過剰発現トランスジェニ ックマウスが作成されたと考え、交配を開始した。
‑Cre マウスと交配させた。しかし、残 念なことに、合計約 50 匹ほどの仔マウスを作成した が、トランスジーンを持ったマウスが生まれず、
条件等も可能な限りの条件を試したが、改善されな かったため、作成の継続を断念した。
ノックアウトマウス作成
ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を 作 成 す る た め に MMRRC(Mutant Mouse Regional Resource Centers) 細胞を購入し、遺伝子型、増殖能を確認後、
初期胚にインジェクションして、キメラマウスを作 成した。キメラマウスのキメラ率は、一回目：
％以下が 1 匹
と極めてキメラ率が低いマウスが得られたが、時に、
非常に低いキメラ率のキメラマウスから生殖系列 経て次世代に遺伝子が伝播される可能性があるため、
30〜50 匹ずつの仔マウスを得て、
細胞から採取した
トロールとして、PCR を行ったが、（図 番めの 3000bp
ントロールに対して、仔マウスから採取した
は約 130 匹ほど、全てが陰性であった。
レーン：マーカー、１ 1 レーン：マーカー
レーン陰性 4 レーンポジティブコントロール レーン：ネガティブコン
．行動学的検査 使用したマウス
ヶ月齢 成体のマウス。全てのジェノタ イピングにおいて行動学的に雌雄差を認めなかった ため、雌雄共に使用した。遺伝子型は基本的に同腹 仔を用いて実験を行った。それぞれの個体数は、
確保することができた。
Wild type:野生型
：ネスチンプロモーター下に するトランスジェニックマウス
平成 24 年度に作成した、
特異的にノックダウンするマウス。
と交配させない時は、ワイルドタイプマウスと
：脳内で、miR‑484
ンする遺伝子改変マウス。ダブルトランスジェ ニックマウス(DTG)。
（図
8
ファウンダーマウスと nestin‑Cre オスのファウンダーマウスが得られ、
明瞭な結果であったため、過剰発現トランスジェニ ックマウスが作成されたと考え、交配を開始した。
マウスと交配させた。しかし、残 匹ほどの仔マウスを作成した が、トランスジーンを持ったマウスが生まれず、
条件等も可能な限りの条件を試したが、改善されな かったため、作成の継続を断念した。
ノックアウトマウス作成
ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を 作 成 す る た め に MMRRC(Mutant Mouse Regional Resource Centers) 細胞を購入し、遺伝子型、増殖能を確認後、
初期胚にインジェクションして、キメラマウスを作 成した。キメラマウスのキメラ率は、一回目：
と極めてキメラ率が低いマウスが得られたが、時に、
非常に低いキメラ率のキメラマウスから生殖系列 経て次世代に遺伝子が伝播される可能性があるため、
匹ずつの仔マウスを得て、
細胞から採取した DNA をポジティブコン を行ったが、（図
bp 付近に確認される陽性コ マウスから採取した
匹ほど、全てが陰性であった。
レーン：マーカー、１6 レーン全て陰性。
レーン：マーカー
レーンポジティブコントロール レーン：ネガティブコントロール
成体のマウス。全てのジェノタ イピングにおいて行動学的に雌雄差を認めなかった ため、雌雄共に使用した。遺伝子型は基本的に同腹 仔を用いて実験を行った。それぞれの個体数は、
確保することができた。
：ネスチンプロモーター下に するトランスジェニックマウス
年度に作成した、miR 特異的にノックダウンするマウス。
と交配させない時は、ワイルドタイプマウスと 484 を特異的にノックダウ ンする遺伝子改変マウス。ダブルトランスジェ
。
8）
Cre マウスとの交 オスのファウンダーマウスが得られ、PCR 結果も 明瞭な結果であったため、過剰発現トランスジェニ ックマウスが作成されたと考え、交配を開始した。
マウスと交配させた。しかし、残 匹ほどの仔マウスを作成した が、トランスジーンを持ったマウスが生まれず、PCR 条件等も可能な限りの条件を試したが、改善されな かったため、作成の継続を断念した。
ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を 作 成 す る た め に MMRRC(Mutant Mouse Regional Resource Centers) 細胞を購入し、遺伝子型、増殖能を確認後、
初期胚にインジェクションして、キメラマウスを作 成した。キメラマウスのキメラ率は、一回目：30
と極めてキメラ率が低いマウスが得られたが、時に、
非常に低いキメラ率のキメラマウスから生殖系列 経て次世代に遺伝子が伝播される可能性があるため、
匹ずつの仔マウスを得て、DNA をポジティブコン を行ったが、（図 8）に示す通 付近に確認される陽性コ マウスから採取した DNA 匹ほど、全てが陰性であった。
レーン全て陰性。
レーンポジティブコントロール
成体のマウス。全てのジェノタ イピングにおいて行動学的に雌雄差を認めなかった ため、雌雄共に使用した。遺伝子型は基本的に同腹 仔を用いて実験を行った。それぞれの個体数は、
：ネスチンプロモーター下に Cre を発現
miR‑484 を条件 特異的にノックダウンするマウス。Cre マウス と交配させない時は、ワイルドタイプマウスと を特異的にノックダウ ンする遺伝子改変マウス。ダブルトランスジェ マウスとの交 結果も 明瞭な結果であったため、過剰発現トランスジェニ ックマウスが作成されたと考え、交配を開始した。
マウスと交配させた。しかし、残 匹ほどの仔マウスを作成した PCR 条件等も可能な限りの条件を試したが、改善されな
ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を 作 成 す る た め に MMRRC(Mutant Mouse Regional Resource Centers) 細胞を購入し、遺伝子型、増殖能を確認後、
初期胚にインジェクションして、キメラマウスを作 30％
と極めてキメラ率が低いマウスが得られたが、時に、
非常に低いキメラ率のキメラマウスから生殖系列を 経て次世代に遺伝子が伝播される可能性があるため、
DNA をポジティブコン
）に示す通 付近に確認される陽性コ DNA を 匹ほど、全てが陰性であった。
レーン全て陰性。
レーンポジティブコントロール
成体のマウス。全てのジェノタ イピングにおいて行動学的に雌雄差を認めなかった ため、雌雄共に使用した。遺伝子型は基本的に同腹 仔を用いて実験を行った。それぞれの個体数は、5
を発現 を条件 マウス と交配させない時は、ワイルドタイプマウスと を特異的にノックダウ ンする遺伝子改変マウス。ダブルトランスジェ
5−1 オープンフィールドテスト
結論からは、シングルトランスジェニックマウス (N‑Cre および、calsl)と比較して、有意に変化があ るパラメーターは認められなかった。唯一、野生型 マウスと比較した時に、中央部における滞在時間が DTG に お い て 長 い 傾 向 が 認 め ら れ た 。 (Center Region(%)と Center Region Time(s))このことは、
不安や抑うつを感じにくい可能性が示唆されたため、
より特異的な検査法である、尾懸垂試験と強制水泳 試験を施行した。
5−2 尾懸垂試験
尾懸垂試験を施行したところ、どの遺伝子型にお いても、5 分間の間に、概ね、半分ほどの時間を無 動を示したが、それぞれの群間に、有意な差は認め られなかった。
wild type N-Cre
calsl DTG 0
500 1000 1500 2000
Total Distance in 10 mins(cm)
wild type NCre
calsl dtg 0
2 4 6 8 10
Center Region(%)
wild type NCre
calsl DTG 0
50 100 150 200
total movement duration(s)
wild type NCre
calsl DTG 0
20 40 60
Center Region Time(s)
wild type NCre
calsl DTG 0
5 10 15
Distance per movement(cm)
female wt female NCre
female calsl female dtg 0.0
0.5 1.0 1.5 2.0
Duration Per Movements(s)
wild type NCre
calsl DTG 0.0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Total Cycling number
wild type NCre
calsl DTG 0
20 40
60 rearing number
wild type NCre
calsl DTG 0
20 40 60 80
Total Episode Number
wild type NCre
calsl DTG 0
50 100 150
Total movement episode Number
wild type NCre
calsl DTG 0
1 2 3 4
Average Speed(cm/s)
wild type NCre
calsl DTG 0
5 10 15
Moving Speed(cm/s)
7
一方、尾懸垂試験によって抑鬱様行動が検出できな くても、強制水泳試験によって、変化を来す場合が あり、多角的に抑鬱様行動を評価するために、強制 水泳試験を行った。
5−3 強制水泳試験
強制水泳試験を施行したところ、シングルトラン スジェニックマウスと若干の差は認められたものの、
野生型と比較しても変化は認められなかった。
Ｄ．考察 及び 結論
1. トランスジェニックマウスおよびノックア ウトマウスについて
トランスジェニックマウスに関しては、5 種類以 上のプライマーを試して確認したが、トランスジー ンの伝播は確認できなかった。ファウンダーマウス のトランスジーンも PCR がかかりにくい場合があり、
発現プラスミドの骨格の問題である可能性も高い。
いずれにせよ、過剰発現トランスジェニックマウス が樹立できなかった。
ノックアウトマウスに関しては、購入した ES 細胞 の質の問題であると考えられた。元々、MMRRC より は 2 ラインの ES 細胞を購入する手はずとしていた が、1 ラインは MMRRC の方で、増やすことができな かったため、手に入れることができず、やむを得ず、
1 ラインを用いてのインジェクションとなった。ま た、元々の ES 細胞が、C57BL6N 系統であったことも、
キメラ率に影響があった可能性もある。いずれにせ よ、多くの産仔の PCR を施行したが、ポジティブは 得られず、ノックアウトマウスの樹立は断念した。
3. 行動学的検査
(ア) オープンフィールドテストについて
新奇環境における自発的活動性や不安様行動など を評価したが、有意な所見は認められなかった。た だ中央区各滞在時間においては、野生型のマウスに 比較して長い傾向があり、むしろ、不安、抑鬱様行 動が少ない可能性が示唆された。このことから、以 下に示す、抑鬱様行動を評価するための、行動試験 を行った。
(イ) 尾懸垂試験および、強制水泳試験。
どちらの検査においても、有意な所見は認められ なかった。このことから、まず、抑鬱様行動と不安 様行動を明確に区別するために、明暗箱試験、高架 式十字迷路試験を行う必要があると考えられた。た だ、少数例のマウスを用いた、明暗箱試験の結果で
は、有意な所見が認められなかったことから、社会 的行動に関しても今後スクリーニングする必要性が あると考えられた。2 年間という極めて限られた時 間の中で、多くのテストバッテリーを組むことは、
物理的に障害が大きかったが、今後は、miR‑484 以 外のターゲット分子を発見している。それらの遺伝 子改変マウスを用いての行動学的テストなどを通じ て、16p13.11 領域の重複、欠損による発達障害の病 態メカニズムを明らかにしていきたいと考えている。
Ｆ．健康危険情報 特になし
Ｇ．研究発表 1. 論文発表
①Gallagher D, Norman AA, Woodard CL, Yang G, Gauthier‑ Fisher A, Fujitani M, Vessey JP,Cancino GI, N, Woltjen K, Fatt MP, Morshead CM,Kaplan DR, Miller FD Transient maternal IL‑ 6 mediates long‑
lasting changes in neural stem cell pools by deregulating an endogenous self‑ renewal pathway.
Cell stem cell 2013 13(5) 564‑576
②Fujiki, R., Sato, A., Fujitani, M. and Yamashita, T
A proapoptotic effect of valproic acid on progenitors of embryonic stem cell derived glutamatergic neur Sachewski ons. Cell death dis 2013 20(4) e677
２.学会発表
① 平成26年1月9日 International Symposiumon Glyco‑ Neuroscience 淡路夢舞台
ポスター：microRNA‑ 484 located in chromosome 16p13.11 locus, controls cortical
development. 発表者：藤谷 昌司
② 平成25年08月03日第二回大阪大学神経難病フォ ーラム 大阪大学 16番染色体16p13に着目した 新規脳発生関連分子の発見と小児神経疾患モデ ル動物作成の試み 発表者：藤谷 昌司
③ 平成26年03月13日大阪大学
16 番染色体関連 miR484 は PCDH19 を介して 神経幹細胞の分化を制御する。 第七回神経発 生討論会 発表者：藤谷 昌司
④ 平成25年08月31日 microRNA‑ 484は皮質神経前 駆細胞の分化を制御する 第14回 ORIGIN 神経 科学研究会 下呂温泉発表者：藤谷 昌司 Ｈ．知的財産権の出願・登録状況
（予定を含む。）
1. 特許取得 なし
2. 実用新案登録 なし
3.その他 なし
FST latency(s)
wt Ncre
calsl DTG 0
10 20 30 40 50
FST immoblie time (s) in last 4 minutes
wt Ncre
calsl DTG 0
50 100 150 200 250
