材料および方法

古 紙混 合 汚 泥 コ ンポ ス ト中の植 物 生 長促 成 作 用 に関 わ る 糸状菌 とそれ らの代謝産物

森 本 正 則 ・若 山 晃 子 ・駒 井 功 一 郎

(近畿大 学農学 部農芸 化学科)

The Fungi in Old Paper Mixed Bio-sludge Compost and Its Metabolite and PGPR Effect

Masanori

Department

MORIMOTO, Akiko

of Agricultural Chemistry,

WAKAYAMA

3327-204 Nakamachi,

and Koichiro

Faculty of Agriculture,

Nara 631-8505, Japan

KOMAI

Kinki University,

Synopsis

Sometime, the compost products made from bio-sludge and containing paper strips, showed plant growth promoting effect by field application. We have evaluated to separating various fungi from bio- sludge compost that have PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) effect against some crops by inoculating test into the incubation soil. Test fungi separated from the compost using multiple dilution method and colonization on the PDA agar plate. And, the surface of autoclaved oat serials kept each fungus and inoculated by mixing 3% w/w to incubation soil for PGPF (Plant Growth Promoting Fungi) evaluation. As a result, we have recognized PGPF effect and have identified by 18S-rDNA analysis, following similarity analysis compared with on-line database.

All tested fungi showed PGPF effect against cucumber plant compared from growth of the control plant. The compost made from garbage and old office paper strips by experimental compost machine sat on the faculty of agriculture, Kinki University, Nara city, The most PGPF effective species was identified as Gibberella sp. with 18S-rDNA analyses. And the antibacterial compounds produced by this fungus, was separated as red crystal. This compound identified as javanicin, one of Fusarium pigment by NMR and MS spectrum analyses. The Gibberella sp. did not inhibit the plant growth of J1 susceptible tomato cultivar. These data suggested that various fungi maybe effect on the plants growth promoter in the field. Though, some metabolites produced by these fungi showed antibacterial activity, these metabolites maybe act as suppressor of the soil borne plant disease.

緒 言

活 性 汚 泥 や 食 品 汚 泥 な どの 有 機 性 廃 棄 物 な らび に 古 紙 な どを 加 え た コ ンポ ス トの 施 用 は 、 作 物 の 生 長 を 促 進 す る こ とが 知 られ て い る。 これ ら の 生 長 促 進 要 因 が コ ン ポ ス ト中 に存 在 す る微 生 物 や そ の 代 謝 物 に よ っ て 引 き起 こ さ れ る 可 能 性 を 検 討 す べ く、 これ らの 植 物 に 対 す る生 長 促 進 活 性 を 土f 接 種 試 験 に よ っ て 評 価 した 。 コ ン ポ ス トか ら の 微 生 物 の 分 離 は 、 対 象 コ ン ポ ス ト懸 濁 液 を 生 理 食 塩 水 に よ っ て 段 階 希 釈 した後 に各 種 寒 天 平 板 培 地 を 用 い て 各 種 微 生 物 を 分 離 し た。 分 離 菌 は 、 オ ー ト ク レ イ ブ 処 理 し た オ オ ム ギ 麦 粒 を キ ャ リ ア ー と して 真 砂 土 を 基 本 とす る培 養 土 へ 土 壌 接 種 し た。

生 長 促 進 効 果 の 認 め ら れ た 糸 状 菌 の 同 定 は18S‑

rDNA解 析 を用 い た。

近 畿 大 学 農 学 部 設 置 の発 酵 槽 を 用 い て 作 製 した 古 紙 を 含 む 試 作 コ ン ポ ス トよ り糸 状 菌6種 を 分 離 し、 そ の 植 物 生 長 促 進 効 果 を 評 価 した と こ ろ 、 最 も 高 い 生 長 促 進 効 果 を 示 した 糸 状 菌 は18S‑rDNA 解 析 に よ っ てGibberellasp.と 同 定 し、 本 種 の 生 産 す る 低 分 子 化 合 物 と して 抗 菌 活 性 既 知 化 合 物 で あ るJavanicinを 同 定 し た 。 本 種 が フ ザ リ ウ ム 色 素 を 生 産 す る こ と か ら トマ トに対 して 生 長 阻 害 を 示 す 可 能 性 が 危 惧 さ れ た が 、 フザ リウ ム感 受 性(J1)

トマ トに 対 して も そ の 生 長 を 阻 害 せ ず 、 生 長 促 進 効 果 を 示 した。 この 様 に コ ン ポ ス ト中 に 存 在 す る 多 くの 微 生 物 が 植 物 の 生 長 促 進 効 果 を 示 した こ と か ら、 こ れ ら の コ ン ポ ス トの作 物 生 長 促 進 効 果 へ の こ れ らの 微 生 物 の 関 与 が 伺 え た。 さ ら に分 離 し た 微 生 物 の 中 に は 抗 菌 活 性 を示 す 種 も存 在 す る こ とか ら、 これ らの 抗 菌 活 性 物 質 に よ る 病 害 ス トレ ス 軽 減 効 果 も 予 想 さ れ る。 本 報 告 で は 、 こ れ ら の 糸 状 菌 の 植 物 生 長 促 進 作 用 や 代 謝 産 物 に つ い て 詳 細 な 検討 を 行 った の で 報 告 す る。

材料および方法

1.供 試 コ ン ポ ス トか ら の 微 生 物 分 離

供 試 コ ン ポ ス トを10倍 量 の0.8%食 塩 水 で 懸 濁 後 、10倍 段 階 希 釈 し平 板PDA培 地 上 に 均 一 に塗 布 し た。 そ の 後 、26℃ で 培 養 を 行 い 出現 し た糸 状 菌 の コ ロ ニ ー を 釣 菌 し試 験 管 上 の 斜 面 培 地 にA〜F

と して 保 存 した(Plate1)。

2.コ ン ポ ス ト由 来 糸 状 菌 の 植 物 生 長 促 進 活 性 試 験

分 離 した 糸 状 菌A〜Fの 植 物 生 長 促 進 試 験 を 実 施 し た。 ま ず 、供 試 菌 種 をPDA平 板 培 地 上 に 植 菌 後2日 間26℃ で 培 養 した 。 菌 の 生 育 の 盛 ん な 部 分

Plate 1 Isolated fungi from test compost by PDA plate medium (All optical microscopic images: X 600)

を コ ル ク ボ ー ラ ー で 適 量 打 ち抜 き 、 オ ー トク レイ ブ した 有 殻 大 麦 粒(の ぞ み 二 条)へ 投 入 した 。 そ の 後 は26℃ で 菌 糸 が 麦 粒 全 体 に生 育 す る ま で10日 間 培 養 を 行 っ た。 そ の 後 、 トレー 上 に 菌 糸 の 回 っ た 麦 粒 を 移 し、 無 風 下 で 余 分 な 水 分 を 蒸 発 さ せ た。

こ の 様 に して 得 られ た供 試 菌 種 を 保 持 した 乾 燥 麦 粒 は 密 閉容 器 中4℃ で 保 存 し た。 土f混 和 条 件 は、

真 砂 土 に重 量 比2%で 調 製 した供 試 菌 を 保 持 さ せ た 乾 燥 麦 粒 を 混 和 した 。 コ ン トロ ー ル に は 同 様 な 操 作 で 作 成 した 麦 粒 を 用 い た 。 検 定 植 物 と し て キ ュ ウ リ(品 種:節 成 胡 瓜)を 用 い 、 そ の生 育 程 度 を 観 察 した1)。

3.コ ン ポ ス ト由 来 糸 状 菌 の 生 産 す る 抗 菌 活 性 物 質

3‑1菌 の 培 養 と抗 菌 活 性 物 質 の 抽 出

近 畿 大 学 農 学 部 に 設 置 の 発 酵 槽 を 用 い て 作 製 し た 古 紙 を 含 む 試 作 コ ン ポ ス トよ り分 離 した6種 類 の 糸 状 菌 の う ち数 種 が 色 素 を生 産 して お り、 そ の 内 の1種F(Gibberellasp.)が 抗 菌 活 性 物 質 を 生 産 して い る可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 そ こで 、5リ ッ トル 容 量 の 三 角 フ ラ ス コ にPD液 体 倍 地 約500mlを 分 注 しGibberellasp.を 植 菌 した。28℃で静 置 培 養 し、

培 養 期 間 の 目安 と して 液 体 倍 地 が 赤 色 に 変 色 した 時 を 培 養 の 終 点 と し た。 減 圧 濾 過 に よ っ て 菌 体 と 液 体 倍 地 を 分 離 し、 そ れ ぞ れ ク ロ ロホ ル ム を 用 い て抽 出 を行 っ た。

3‑2抗 菌 活 性 物 質 の 単 離 ・同 定

静 置 培 養 に よ っ て 得 られ た培 養 液 お よ び 菌 体 抽 出 物 に お い て 抗 菌 活 性 を示 す 画 分 は ク ロ ロ ホ ル ム 可 溶 画 分 で あ り、 シ リ カ ゲ ル カ ラ ム ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー に よ っ て 赤 色 色 素 を 単 離 し た。 単 離 した 赤 色 結 晶 の抗 菌 活 性 成 分 は各 種 機 器 分 析 に よ っ て 構 造 解 析 を行 っ た。

3‑3抗 菌 試 験

菌 体 の ク ロ ロ ホ ル ム 抽 出 物 に含 まれ る 主 要 な 赤 色 化 合 物 の 抗 菌 試 験 に は10%DMSOを 含 む1.B液 体 培 地 を 用 い、各 種 サ ンプ ル濃 度 お よびDMSO10%

液 体 培 地 を コ ン トロ ー ル と し た マ イ ク ロ プ レ ー ト 法 で行 っ た。 最 小 阻 害 濃 度 は 、2日 後 の 菌 の 発 生 を 目視 で確 認 し 最 小 阻 止 濃 度(MIC,ppm)と した。

結 果

1.供 試 コ ン ポ ス ト か ら の 微 生 物 分 離 ・お よ び 同 定

コ ン ポ ス ト よ り 得 ら れ た6種 の 菌 種 の う ち3種 は 、 菌 床 が 赤 色 を 呈 す る 糸 状 菌 で あ っ た(Plate 1)。 こ れ ら の 光 学 顕 微 鏡 観 察 と18S‑rDNA解 析 よ

りA:Penicilliumsp.,B:未 同 定,C:未 同 定,D:

Hypocreasp.(Trichodermasp),E:Fusarium sp.,F:Gibberellasp.と 同 定 し た 。

2.コ ン ポ ス ト由 来 の 糸 状 菌 導 入 に よ る 植 物 生 長 促 進 効 果

供 試 菌 を 接 種 し た キ ュ ウ リの 生 長 は コ ン トロー ル と比 較 し て 、 す べ て の 供 試 菌 導 入 区 で 生 育 促 進 効 果 が 認 め られ た(Fig.1,Plate2)。 最 も 良 好 な 生 育 促 進 活 性 を 示 した 菌 種 はFで あ り、 特 に 地 下 部 の 生 長 を 促 進 す る 傾 向 が 認 め られ た(Fig.1, Plate2)。 糸 状 菌Fは18S‑rDNA解 析 よ り フ サ リ ウ ム属 に 近 縁 の 種 で あ り、 フ サ リ ウ ム 色 素 で あ る Javanicinを 生 産 す る こ とか ら フサ リ ウム 病 感 受 性 トマ ト(J1)に 対 す る罹 病 性 を併 せ て 検 討 し た と こ ろ 、 発 病 は 認 め られ な か っ た。 反 対 に 有 機 質 を 菌 導 入 の 代 替 と し た処 理 区 と比 較 して も、 供 試 植 物 の 生 育 促 進 が 認 め られ た(Plate3)。 この 様 に植 物 病 原 性 微 生 物 と し て 知 られ る が 、 実 際 毒 性 を 持 た な い 種 が 植 物 の 生 長 促 進 や 病 害 抵 抗 性 に 寄 与 す る とい う報 告 も 多 くあ り、 数 種 の 微 生 物 が 微 生 物 農 薬 資 材 と して 注 目さ れ て い る。

3.Gibbere〃asp.の 生 産 す る 抗 菌 活 性 物 質 抗 菌 活 性 を 示 す 赤 色 結 晶 物 の 最 小 生 育 阻 止 濃 度 (MIC)は 、E.coliに お い て7.8ppm、B.subtillis に お い て は62.5ppmで あ り、 抗 菌 活 性 が 認 め ら れ た 化 合 物 は 、 各 種 機 器 分 析 の 結 果 よ り フ ザ リ ウ ム 色 素 で あ る ナ フ ト キ ノ ン 誘 導 体Javanicinと 同 定 し た2)(Fig.2)。 こ の 化 合 物 は 、 寄 生 性 雑 草 で あ る Strigasp.に 対 し て 発 芽 阻 害 活 性 を 示 す こ と が 知 ら れ て お り 、 こ れ ら を 生 産 す る フ ザ リ ウ ム 菌 が 微 生 物 除 草 剤 と し て 利 用 で き る 可 能 性 が あ る3)。

65

Plate 2 Plant growth promoting effect of test fungi inoculation on the growth of cucumber

Fig. 1 Plant growth promoting effect of test fungi inoculation on the growth of cucumber.

Javanicin:赤 色 結 晶m.p.:195‑198℃,EIMS

(70eV):290(100%),248(74.2%),UV(CHCl3);

λmax(nm):240,302,478,506,544,lHNMRδ

(ppm):13.2(IH,s),12.8(1H,s),6.2(1H,s),3.9

(3H,s),3.8(2H,s),2.3(3H,s),2.1(3H,s),13C NMRδ(ppm):148.9,128.8,110.1,79.1,50.3,38.1,

37.4,37.2,35.8,34.4,28.5,27.6,25.9,22.2,18.7,

15.7. Fig. 2 Chemical structure of Javanicin.

Including Organic Matter Sand Only

Plate31noculationtestofGめ わereZZαsp.againstF召8αr如 ηLJIsusceptibleTomato.

考 察

古 紙 と厨 芥 を 原 料 と して 作 製 さ れ た コ ン ポ ス ト よ り6種 の 微 生 物 を 分 離 した 。 これ らの 微 生 物 は 植 物 生 長 促 進 活 性 を 示 した こ とか ら、 供 試 コ ン ポ ス トを 施 用 した 時 の 植 物 生 長 促 進 効 果 が 期 待 で き る。 今 回 分 離 し た 菌 種 は 、Peπ̀c̀Z伽msp.や 7r6cんoder〃}αsp.な どのPGPRと し て 知 ら れ る 菌 種 や 、翫8α 磁msp.や そ の 亜 種 で あ る α 飴e漉rα sp.な ど糸 状 菌 類 が 多 か っ た。Peπ̀c̀ZZ如配sp.は 汚 泥 コ ン ポ ス ト中 か ら も植 物 生 長 促 進 微 生 物 と し て分 離 さ れ 、 抗 菌 活 性 物 質 を 生 産 す る こ とが 報 告 さ れ て い る1)。 ま た 微 生 物 は 、 土 壌 だ け で は な く 植 物 の 葉 面 に お い て も病 原 菌 に 対 し て拮 抗 性 を 示 す こ とか ら、 マ ン ゴ ー 炭 疽 病 に有 効 で あ る こ と も 示 さ れ て い る4)。弱 毒 性 ま た は 非 病 原 性F醐 α磁 〃}

sp.の 接 種 は 、 サ ツマ イ モ や他 の 植 物 に お い て植 物 病 害 を 抑 制 す る こ とが 知 られ 、 商 品 名 マ ル カ ラ イ トと して 利 用 さ れ て い る5)。本 研 究 で は、 植 物 生 長 促 進 微 生 物 の抗 菌 性 物 質 の 生 産 が 明 らか と な っ た が 、 弱 毒 性F粥 α磁mspの 接 種 に よ っ て シ ン ビ ジ ウ ム の黄 斑 病 が 抑 制 さ れ る メ カ ニ ズ ム は、 弱 毒 性 翫sα 吻 潮spの 感 染 に よ る植 物 体 中 の サ リ チ ル

酸 生 合 成 が 関 与 した全 身 抵 抗 性(SAR)誘 導 で あ る と報 告 さ れ て い る6)。

こ の 様 な 背 景 か ら、 今 回 試 作 し た コ ン ポ ス トに よ る土 壌 病 害 の 抑 制 な らび に植 物 生 長 促 進 効 果 が 期 待 で き る。 ま た 、 同様 な 資 材 を 原 料 とす る 場 合 も 同 様 な 微 生 物 群 の 存 在 が 予 想 さ れ る こ とか ら、

広 範 囲 な コ ン ポ ス ト資 材 で 同様 な 効 果 が 期 待 で き る も の と考 え られ た 。 同 時 に 、 植 物 生 長 促 進 ・土 壌 病 害 抑 制 作 用 を 示 す コ ン ポ ス ト資 材 は、 有 用 微 生 物 の 探 索 源 と し て も 利 用 で き る こ とが 示 唆 され た 。

引用文献

1)森 本 正 則,松 本 朋 子,駒 井 功 一 郎:汚 泥 コ ン ポ ス トの 植 物 生 長 促 進 活 性 に 関 わ る微 生 物 と、

そ れ らの 代 謝 産 物,近 畿 大 学 資 源 再 生 研 究 所 報 告,2,49‑55(2004)

2)Tatum,J.H.,Baker,R.A.:Naphtho‑

quinonesproducedbyFμ8αr̀πm80Zα ὴ

isolatedfromcitrus.Phytochemistry.22,543

‑547(1983)

一67

3) Ahmed, N. E., Sugimoto, Y., Babiker, A.

G. T., Mohamed, 0. E., Ma, Y., Inanaga,

S., Nakajima, H.: Effects of Fusarium

solani isolates and metabolites on Striga germination. Weed Sci. 49, 354-358 (2001)

4)澤 砥 哲 也,諸 見 里 善 一:Pε π凝Z伽m属 菌 に よ る マ ン ゴ ー 炭 疽 病 の 生 物 防 除,植 物 防 疫,58 (11),499‑502(2004)

5)小 田 正 文:新 微 生 物 殺 菌 剤:非 病 原 性 フ ザ リ ウ ム ・オ キ シ ス ポ ラ ム 菌 剤 の 使 い 方,植 物 防 疫57(3),119‑122(2003)

6)市 川 和 規:弱 病 原 性 フ ザ リ ウ ム 菌 を 用 い た シ ン ビ ジ ウ ム 黄 斑 病 の 生 物 防 除,植 物 防 疫,58 (11),503‑507(2004)