基礎から分かる UPLC 分離の基礎から最新情報まで日本ウォーターズ株式会社 JASIS 2014 新技術説明会 9 月 4 日 ( 木 ) 15:30 16: Nihon Waters K.K. 1 アジェンダイントロダクション UPLC 分離を実現するテクノロジー更なるカラム

(1)

基礎から分かるUPLC

〜分離の基礎から最新情報まで

日本ウォーターズ株式会社

JASIS 2014 新技術説明会

9月4日（木） 15:30〜16:20

アジェンダ



イントロダクション



UPLC分離を実現するテクノロジー

更

カ

効率向上向



更なるカラム効率向上に向けて



UPLC10周年

(2)

UPLC

UPLCテクノロジー

テクノロジーとは？

とは？

分離・スピード

分離・スピード :

: 必要性に応じたフレキシビリティ

必要性に応じたフレキシビリティ

0.08 270 2.1 x 50 mm, 1.7 µm Rs (2,3)= 4.58 8X Speed 3 6X Sensitivity

UPLC

0.08 at 270 2.1 x 30 mm, 1.7 µm Rs (2,3)= 2.90

UPLC

13X Speed 4 6X Sensitivity

Ultra Speed

Speed with Resolution

0.08 Abso rb an ce at 2 7 0 n m 2.1 x 150 mm, 5.0 µm Rs (2,3)= 4.57 HPLC Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 Abso rb an ce at nm 3.6X Sensitivity Same Resolution Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 Abso rb an ce a nm 4.6X Sensitivity 0.6X Resolution 0 08 0 08

_UPLC

_{2 1} ₁₅₀ _{1 7}

Resolution with Speed

Ultra Resolution

UPLC

4X Speed 1.8X Sensitivity 1.3X Resolution Minutes 0.00 2.00 4.00 6.00 0.08 A b so rb anc e at 270 nm 2.1 x 150 mm, 1.7 µm Rs (2,3)= 7.42

UPLC

2.7X Speed 1.2X Sensitivity 1.6X Resolution

UPLC

UPLC分離のための重要なポイント

分離のための重要なポイント

Ultra Performance LCは

バンド拡散

の理論に基づくテクノロジー

(3)

どこでバンドの拡散が起こるか？

バンド拡散:

1) インジェクターからカラム手前まで

(“サンプルバンド”)

2) カラムに入りカラム出口まで

(“化合物のバンド”)

3) カラム出口から検出器まで

カラム外

カラム内

セル内

バンド拡散：

バンド拡散：α

α



カラム由来拡散： σ

col2

σ

2 tot

=

σcol

2 +

σinj

2 +

σtube

2 +

σfittings

2 +

σdet

2

col

–

充塡剤粒⼦径と粒度分布

–

充塡⽅法、充塡ベッド密度

–

カラム容量

–

カラム壁面構造

–

エンドフィッテイングとディストリビューターデザイン



カラム外拡散

–

インジェクションボリュームとインジェクターデザイン

–

チューブ(i.d. x L)

–

コネクター

–

検出器セル

(4)

バンド拡散のピーク形状への影響

狭いバンド

狭いピーク向上した感度向上した分離能

UPLC

Technology

HPLC

向上した分離能

Technology

バンド拡散を最⼩限に抑えるためには適切に

設計されたカラムと装置の両方が必要

緑色の化合物分⼦の集団は⼤きく異なる時間で検出器セルに到達する

アジェンダ



イントロダクション



UPLC分離を実現するテクノロジー

UPLC分離を実現するカラムテクノロジ

–

UPLC分離を実現するカラムテクノロジー

–

システムデザインの分離への影響



更なるカラム効率向上に向けて



UPLC10周年

(5)

van

van Deemter

Deemter

_の法則

粒⼦径を⼩さくすると

何故⾼いカラム効率が得られるのでしょうか？

クロマトグラフィー原理

物質移動

物質移動 /

/ 拡散

拡散

移動相

A

ポーラス

パティクル

分析対象分子

B

パーティクル

C

(6)

拡散についての理解

拡散についての理解::

van

van Deemter

Deemterプロット

プロット

HETP(H) = A + B / u + C u

=a・

d

_p

+B/u+c・

d

_p2

_・u

C Term

(Mass Transfer)

B Term

A Term

(Eddy Diffusion)

カラムに生じるBand Spreading を予測する最終的なvan Deemter Curveを得るための３つの項目

van

van Deemter

Deemterプロット

プロット

–

カラム効率（理論段数:N）

o

理論段⾼(HETP)〜１理論段あたりのカラム⻑

o

カラム効率（N） ∝ カラム⻑ (L)/粒子径 (dp)

o

カラム効率（N） ∝ カラム⻑ (L)/粒子径 (dp)

(7)

粒⼦径が⼩さいだけで

⾼いカラム効率が得られるのでしょうか？

UPLC

UPLCパーティクル開発および製造の課題

パーティクル開発および製造の課題



UPLCパーティクル開発のための要求事項:

–

sub-2 µm 充塡剤のプロトタイプを合成、分級、評価できるケミスト

–

市販できる量のバルク充塡剤を確実に再現性よく製造できる最新の合成設備



UPLC パーティクルの要求事項:

–

耐圧

–

適切な形状

–

⾼いカラム効率/物質移動

–

⾼度なボンディングおよびエンドキャッピングプロセス

HPLCカラムへの

要求事項に、さらに

追加される要求事項

(8)

UPLC

UPLCパーティクル開発および製造の課題

パーティクル開発および製造の課題

UPLC カラムの開発には:

カラム製造技術と併せて

固定相合成の革新が不可⽋

Primary

Manufacturer

Bonder

Column

Packers

Distributors

どのようなパーティクルを使用して

どのようにコントロールしているかが

パーティクルからの

パーティクルからのLC

LCカラム製造業者

カラム製造業者

（

（Primary Manufacturer

Primary Manufacturer）であることの利点

）であることの利点

ウォーターズ

**販売* & 流通**

カラム充塡

ボンディング

シリカ合成

(ハイブリッド)

販売 & 流通

カラム充塡

ボンディング

販売 & 流通

カラム充塡

販売& 流通

どのようにコントロルしているかが

クロマトグラフィーに大きく影響する

**販売* & 流通**

販売 & 流通

販売& 流通

* ウォーターズ: ワールドワイドでの販売＆流通

• Class I & II 医療機器製造cGMP施設として認定

• ISO 9001:2008

(9)

エチレン架橋型ハイブリッド

[BEH]

パーティクル

U.S. Patent No. 6,686,035 B2

シリカマトリックス中の架橋エタン

UPLC

UPLC パーテイクルテクノロジー

パーテイクルテクノロジー

60 μm ヒト毛髪

(非常にきれいな毛髪)

5 μm

分析カラム用パーテ

イ

クル

(毛髪の1/12)

1.7 μm

ACQUITY UPLC パーテイクル

(10)

実現するための専門技術

UPLC

UPLCカラムを差別化する革新

カラムを差別化する革新

バルク合成

堅牢な粒⼦径2μm以下のパーティクル

μ

最も⾼いカラム効率

エンジニアリング

UPLC カラムハードウェア

超低バンド拡散

カラム充塡

非常に安定なカラム充塡ベッド

独自の充塡プロセス

ソフトウェア

eCordテクノロジーにより

カラム履歴を電⼦的に管理

パーティクルテクノロジープラットホーム

BEH パーティクル Ethylene-Bridged Hybrid 125Å, 130Å, 200Å,300Å,450Å 1.7 µm for UPLC 2.5, 3.5, 5 and 10 µm for HPLC HSSパーティクル

High Strength Silica 100Å 1.8 µm for UPLC 2.5, 3.5 and 5 µm for HPLC

CSH パーティクル

Charged Surface Hybrid 130Å 1.7 µm for UPLC 2.5, 3.5 ,5 and 10 µm for HPLC 保持の向上および選択性のために デザイン •極性化合物の保持向上[HSS T3] HPLC 業界最⾼レベルの化学的耐久性 のためにデザイン •汎用カラムとして選択 選択性およびサンプルローディング 最大化のためにデザイン •塩基性化合物の卓越したピーク形状びデグパ ©2014 Nihon Waters K.K. 20 •卓越したピーク形状、耐久性および保持 [HSS C18] •良好なピーク形状を維持した異なる選択性 [HSS C18SB, HSS Cyano , HSS PFP] •XSelect HSS HPLC カラムとのシームレスな選択性 •比類ない範囲の移動相pH、温度、圧⼒で使用可能 •幅広いケミストリーラインアップ：低分⼦用6種、バイオ医薬品用8種 •XBridge HPLCカラムとシームレスな選択性およびローデイングキャパシティ •独自のカラム選択性と業界最⾼レベルの（バッチ間）再現性を同時に達成 •低/⾼pHにおける卓越した耐久性と速い平衡化 •XSelect CSH HPLCカラムとのシームレスな選択性

(11)

増え続けるカラムラインアップ：

増え続けるカラムラインアップ：UPLC

UPLCカラム

カラム

 7種類のパーティクル基材

– 125Å, 130Å, 200Å, 300Å, 450Å BEH[エチレン架橋型ハイブリッド], HSS[High Strength Silica], CSH[Charged Surface Hybrid]

– 全てHPLCおよびUPLC粒⼦径で販売（SEC用を除く）

 種類豊富でさらに増え続けるカラムケミストリー – 16 種の固定相

o BEH 130Å C18, C8, Shield RP18, Phenyl, HILIC, Amide o BEH 300Å C18and C4

o HSS C18, T3, C18SB, PFP, Cyano o CSH C18, Fluoro-Phenyl, Phenyl-Hexyl

 専用試験を⾏ったアプリケーションベースのソリューション

– SEC, AAA, OST, PST, PrST and Glycan

⇔

 HPLC⇔UPLC間での分析法移管性 – XBridge HPLC ⇔ACQUITY UPLC BEH カラム

– XSelect HSS HPLC ⇔ ACQUITY UPLC HSS カラム

– XSelect CSH HPLC ⇔ ACQUITY CSH カラム

 専用ガードカラム：VanGuard

 eCordテクノロジー

Launch

Date

全てシームレスに分析法移管が可能な

２種類の

２種類のLC

LCカラムプラットホーム

カラムプラットホーム

pH 耐久性のためにデザイン、 選択性のためにデザイン、 最適化されたカラムファミリー 市場で最もMS-適合性の高い HPLC カラム最適化されたカラムファミリー 多様なクロマトグラフィーの問題解決のための 複数のパーティクル基材 1.7 [UPLC], 2.5, 3.5, 5, 10 µm 1.8 [UPLC], 2.5, 3.5, 5 µm HSS 1.7 [UPLC], 2.5, 3.5, 5 µm CSH

(12)

バンド拡散、ピーク⾼さ、分離能

幅の狭いシャープなバンドを形成するLC システム（カラムと装置）により

幅が狭くシャープなピークが得られる

この結果として分離度ピク⾼さ感度が向上する

この結果として分離度、ピーク⾼さ、感度が向上する

バンド拡散の

より大きい LCシステム

より小さい LCシステム

バンド拡散の

この領域では両分析種（⻘と⾚）は分離していない

（一部共溶出している部分は“紫”のバンドで示される）

より良好な分離

より濃縮された“バンド”

より⾼い感度

粒子径の⼩さいカラムでは

バンド拡散がカラム効率に大きく影響

Effect of Particle Size and Band Spreading on Chromatographic Efficiency 16000 6000 8000 10000 12000 14000 E ffi ci en cy (N ) 1.7 µm: -22% 2.5 µm: -17% 1.7 µm, UPLC 1.7 µm, HPLC 2.5 µm, UPLC 2.5 µm, HPLC 5 UPLC ©2014 Nihon Waters K.K. 24 0 2000 4000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Retention Factor (k) E 5 µm: -9% 5 µm, UPLC 5 µm, HPLC 2.1 x 50 mm カラムバンド拡散は 5σ で測定

(13)

HPLC

HPLCシステムでの

システムでの

van

van Deemter

Deemterプロット

プロット

HETP vs. u

(HPLC System)

60.0

ACQUITY UPLC BEH C

18

1.7 µm

20.0 30.0 40.0 50.0

HET

P

(µm)

Q

18

µ

2.5 µm HPLC Column

2種類のカラムの性能は変わらないように⾒える。

なにが起こっているのか？

0.0 10.0 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 u (mm/s)

UPLC System

UPLC Systemでの

での

van

van Deemter

Deemter プロットの測定

プロットの測定

HETP vs. u

(ACQUITY UPLC System)

18 0 20.0

ACQUITY UPLC BEH C

18

1.7 µm

6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0

HET

P

(µm)

Q

18

µ

2.5 µm HPLC Column

HPLC システムの分

析ではここまで

ACQUITY UPLCシステムでは1.7 µm と2.5 µm

の粒子径のカラムでははっきりと違いが⾒られる

0.0 2.0 4.0 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 u (mm/s)

(14)

⼩粒子径カラムへのシステム拡散の影響

HPLC

最適な線速度ではない

標準のUPLC

最適線速度

同じカラム AU0.08 0.10 0.12 0.14 0.16

ACQUITY UPLC BEH C18

2.1 x 50 mm, 1.7 µm HPLC System F = 0.3 mL/min PSIMAX= 4,200 T (4)= 1.63 N (4)= 5,400 Rs (2,3)= 0.97

ACQUITY UPLC BEH C18

2.1 x 50 mm, 1.7 µm ACQUITY UPLC F = 0.6 mL/min PSIMAX= 8,400 T (4)= 1.02 N (4)= 10,100 Rs (2,3)= 2.25 AU 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 1 2 3 4 0.16 0.16 ©2014 Nihon Waters K.K. 27 0.00 0.02 0.04 0.06 Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 0.00 0.02 0.04 0.06 Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 1 2 3 ₄ 2.00 1.00

アジェンダ



イントロダクション



UPLC分離を実現するテクノロジー

更

カ

効率向上向



更なるカラム効率向上に向けて

–

究極の理論段数を実現するカラムテクノロジー

–

カラム効率向上による実用上の利点

–

UPLC⇔HPLC分析法移管性



UPLC10周年

(15)

Efficiency vs. Backpressure Comparisons

400000 450000

カラム粒子径と背圧との関係

1.0 μm 150000 200000 250000 300000 350000

E

ff

ici

e

n

cy

(

N

/m

)

1.4 μm 1.7 μm 2.5 μm 1.8 μm

21% ⾼効率

79%

⾼背圧

70% ⾼効率

390%

⾼背圧

15% ⾼効率

40%

⾼背圧

Backpressure (psi)

3.5 μm 5.0 μm 10.0 μm Assume: 1) 100 mm length columns 2) Pmaxat uopt 3) ACN/H2O Gradient, 40oC

究極の理論段数の実現

CORTECS

CORTECS カラム

カラム



粒⼦径1.6 μmソリッドコアシリカパーティクルを採用したUPLCカラム



主な利点:

–

最もカラム効率の⾼いUPLCカラム(>35% vs 粒⼦径2-µm以下の全多孔性カラム)

–

同等の背圧で性能の向上

–

スループットの向上



3 Chemistries:

–

C

18

+

–

C

18

–

HILIC

(16)

2014 R&D100 Award

2014 R&D100 Award受賞

受賞

2013年に発表されたCORTECS 1.6μmカラムは、

米国の技術情報誌である「R&D Magazine」が主催

する2014 R&D 100 Awardを受賞しました。

R&D 100 Awardは、「R&D Magazine」社が過

去1年間に実用化された優秀な製品・技術を、分離

技術のみならず、広い分野から100点選出するもので

す。1963年から始まった歴史のある賞で、“Oscars

of Innovation（革新技術におけるオスカー）”と呼

of Innovation（革新技術におけるオスカー）と呼

ばれるほど世界的に権威のある賞の一つです。

2013

2013年

年5

5月までは

月までは…

…

2004年以降、全多孔性ACQUITY UPLC 1.7 µm BEH C

₁₈



最もカラム効率の⾼いパーティクルだった



粒⼦径2 μm以下のパーティクルおよびその効率を実現するのに必要なUPLCテクノロジーの

14,150

8 000 12,000 16,000

ates (4

sigma)

開発への道を歩むこととなった

Pl

Flow Rate (mL/min)

ACQUITY UPLC 1.7 µm BEH C

₁₈

2.1 x 50 mm column. A standard ACQUITY UPLC I-Class using 70% Acetonitrile in H2O at 30 ℃ with 0.5 µL injections from a 1 µL FL injector

(17)

しかしながら、

しかしながら、2013

2013年

年6

6月以降は

月以降は…

…

19,700

20,000

39% ⾼いカラム効率

14,150

8 000 12,000 16,000

lates (4

sigma)

または3倍まで速い分析!

CORTECS UPLC 1.6 µm C

18

+

P

Flow Rate (mL/min)

µ

18

ACQUITY UPLC 1.7 µm BEH C

18

2.1 x 50 mm column. A standard ACQUITY UPLC I-Class using 70% Acetonitrile in H2O at 30 ℃

with 0.5 µL injections from a 1 µL FL injector

同様の背圧

12 000 14,000 CORTECS UPLC C₁₈+ 1.6 µm 4 000 6,000 8,000 10,000 12,000

Pressure (psi)

ACQUITY UPLC BEH C₁₈1.7 µm

0 2,000 4,000

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 Flow Rate (mL/min)

(18)

CORTECS

CORTECSカラムによる効率の向上

カラムによる効率の向上

カラム効率向上による実⽤上の利点



⾼効率分離の利点は:

–

ピーク形状および分離能の向上

–

⾼いサンプルスループット:

⾼いサンプルスルプット:

o

より速い流速で同等の分離

または

o

より短いカラムで同等の分離

(19)

⾼いカラム効率により得られるシャープなピーク、⾼い分離能

局所⿇酔薬の例

0.15 0.20 1 2 3 4 5

ACQUITY BEH HILIC

2.1 x 50mm 1.7 µm 1. Lidocaine 2. Butacaine 3. Tetracaine 4. Procaine 5 Procainamide AU 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20

CORTECS UPLC HILIC

2.1 x 50 mm 1.6 µm 1 2 3 4 5 5. Procainamide USP Resolution2,3: 1.2 ©2014 Nihon Waters K.K. 37 AU -0.05 0.00 0.05 0.10 Minutes 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 USP Resolution2,3: 2.2

⾼いスループット

⾼いスループット–

– サルファ剤

サルファ剤::

流速を

流速を2

2倍

倍

0.08 0.10 0.12 全多孔性カラムブランドB C18 at 0.5 mL/min 2.1 x 50 mm 1.8 µm Gradient time: 4.2 min

Runtime: 6 min 1 5 1. Sulfathiazole 2. Sulfamerazine 3. Sulfamethazine 4. Sulfamethoxypyridazine 5. Sulfachloropyridazine 6. Sulfamethoxazole 7. Sulfasoxazole Pc= 131 半分の時間で同等のピークキャパシティ（Pc） AU 0.00 0.02 0.04 0.06 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 1 2 34 6 7

CORTECS UPLC C18+ at 1.0 mL/min

2.1 x 50 mm 1.6 µm Gradient time: 2.1 min

R ti e 3 i

31 peaks per minute (gradient)

Runtime: 3 min

Pc= 136

(20)

⾼いスループット

⾼いスループット–

– サルファ剤

サルファ剤::

短いカラムを使⽤

2.1 x 100 mm 1.7 µm カラムブランドA ソリッドコア C18

Gradient time: 8.4 min

Runtime: 12 min 半分の時間で同等のピークキャパシティ（Pc） Runtime: 12 min 2.1 x 50 mm 1.6 µm CORTECS UPLC C18+

Gradient time: 4.2min

Runtime: 6 min

Pc= 175

注：カラム⻑さ変更に従ってグラジエントも変更

Pc= 167

本比較試験結果は全てのアプリケーションを代表するものとは限りません



分析法移管

–

異なる粒⼦径間での正確な移管に向けた合成プロセス

グ

CORTECS 2.7 µm

CORTECS 2.7 µmカラム

カラム

o

Rho value が同じになるようにスケーリング

–

UPLC HPLC

o

シームレスな分析法移管

o

将来の保証

1.6 µm UPLC

_{2.7 µm HPLC/UHPLC}

(21)

CORTECS 2.7 µm

CORTECS 2.7 µm カラム

カラム



2.7 µmソリッドコアシリカパーティクルを採用したHPLCカラム



利点

HPLCに適した低カラム背圧⾼カラム効率

–

HPLCに適した低いカラム背圧で⾼いカラム効率

o

分離

o

スピード

–

CORTECS 1.6μmとの分析法移管性（UPLC⇔HPLC）



3種類のケミストリー:

–

C

18

+

–

C

18

–

HILIC

9月5日（⾦） JASIS2014 新技術説明会 10：30 – 10:55 A-5 「既存HPLCの分離・⽣産性を最⼤化したい⽅必⾒！最新2.7μmソリッドコアカラム」

シームレスな分析法移管

AU 0 00 0.40 0.80 1 2 3 4 4.6 x 150 mm HPLC 1.51 mL/min

HPLC、UPLC

どちらにも対応

CORTECS C

18

, 2.7 µm

AU 0.00 0.40 0.80 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 0.00 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 4.6 x 150 mm UPLC 1.51 mL/min AU 0.40 0.80 2.1 x 75 mm UPLC 0 31 mL/min

生産性を最大化

するためにUPLCに

移管可能

1. Epigallocatechin 2. Catechin 3. Epicatechin 4. Gallocatechin 0.00 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 0.31 mL/min AU 0.00 0.40 0.80 Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50

CORTECS UPLC 1.6 µm C

18 2.1 x 50 mm UPLC 0.53 mL/min

(22)

CORTECS C

₁₈

+

+ カラム

カラム



表面チャージテクノロジーを採用した差別化されたC

18

ケミストリー



他のソリッドコアパーティクルカラムに比べて⾼いローディングキャパシティ

プケ

最適



LC/MSアプリケーションに最適



低イオン強度ギ酸移動相を⽤いた塩基性化合物分析に最適

C

₁₈

+

不純物プロファイル

(23)

アジェンダ



イントロダクション



UPLC分離を実現するテクノロジー

更

カ

効率向上向



更なるカラム効率向上に向けて



UPLC10周年

UPLC10

UPLC10周年

周年

(24)

UPLC10

UPLC10周年

周年

コスト削減事例

UPLC 10

UPLC 10周年

周年

文献数の増加

2000

2004年から現在までのUPLC使用文献+書籍数

*Science Direct により” UPLC or ACQUITY”で検索

(25)

主な

主なACQUITY

ACQUITYファミリーラインアップ

ファミリーラインアップ

ACQUITY

ACQUITY ファミリー

ファミリー

 2004年最初の ACQUITY UPLC システム発売 – 超⾼耐圧のシステム、システムに対応した検出器群 – 粒⼦径1.7 µmのエチレン架橋型ハイブリッド[BEH] パーティクルのカラム  発売から10年を経て充実したラインアップ  発売から10年を経て充実したラインアップ

– ACQUITY UPLC H-Class (汎用、分析法開発)

– ACQUITY UPLC H-Class bio (⽣体⾼分⼦分析に適した流路)

– ACQUITY UPLC I-Class (究極の分離、超低拡散)

– ACQUITY UPC2_{（超⾼性能超臨界クロマトグラフィー)} – ACQUITY APC (超⾼速GPC)

基礎から分かる UPLC 分離の基礎から最新情報まで 日本ウォーターズ株式会社 JASIS 2014 新技術説明会 9 月 4 日 ( 木 ) 15:30 16: Nihon Waters K.K. 1 アジェンダ イントロダクション UPLC 分離を実現するテクノロジー 更なるカラム