角膜上皮創傷治癒におけるフィブロネクチン受容体(インテグリン)の役割について
29
0
0
全文
(2) 博 士 学 位 論 文. 角 膜 上 皮 創 傷 治 癒 に お け る フ ィプ ロネ ク チ ン 受 容 体(イ. ン テ グ リ ン)の. 役 割 につ い て. 平 成3年12月. 近畿大学大学院. 医学研究科. 外科学 系専攻(指 導:大 鳥利 文 教授). 村. 上. 純. 子.
(3) 角膜 上皮 創 傷 治 癒 にお け る フ ィプ ロネ クチ ン 受 容 体(イ. ン テ グ リ ン)の. 役 割 につ い て. 近畿大学 医学部 眼科学教室 村. 上. (指導. Fibronectin. receptors. 純. 子. 大鳥利文. 教授). (integrin). in. wound. Murakami. of Ophthalmology School. (Director. epithelial. healing. Junko Department. corneal. Kinki. University. of Me dicine.. Otori). Toshifumi. = Prof.. Abstract. Fibronectin and migration. has been reported. of non - healing. cells have been suggested. cell surfaces.. To investigate. healing of the cornea,. chronological. were examined.. GRGDSP,. an amino acid sequence. on the epithelial migration, on the regulation immunofluorescence. corneal. epithelial. to possess. changes. The effects. receptors. of the cell-adhesion-. microscopy,. activity. the fibronectin. Corneal on their. during the wound of fibronectin. related. of the cell binding domain. receptors. applied. receptors. in the localization. and the effects of epidermal. of fibronectin. disorders.. fibronectin. the role of fibronectin. receptors. predominantly. role in the attachment. of the corneal epithelial cells and has been successfully. for the treatment epithelial. to play an essential. growth. peptide. of fibronectin, factor. were also studied.. receptors. in the basal cell layer and they were detected. (EGF) By. were observed to a lesser degree.
(4) in wing cell layer into the cornea, the migrating healed,. were. corneal. epithelial. epithelial These. and. fibronectin. and. and. accelerate. corneal. epithelial. migration. a very. attachment. by GRGDSP. expression. Key. Word. to the. These. findings. of fibronectin. fibronectin. epithel. cultured. cells.. EGF. matrix.. to the fibronectin strongly. receptors. which. receptor,. suggest in the. system leads. plays. to epithelial. fibronectin,. mum. —2—. stimulated. not. the the. epithelial. were. inhibited. both. epithelial. cells,. wound. to. increased. stimulates. wound. in the. only. EGF. a central. matrix.. stimulated. matrix. corneal. inhibited. is known. also. EGF-. that. of GRGDSP. receptors. EGF. but. of. fibronectin. stimulated. cornea. role. fibronectin-. to the. Thus. for successful. GRGDSP. of fibronectin. epithelial. fibronectin. receptor. of the cornea,. role. well with. matrix.. dynamic. studied.. wing. disappearance. the effects. cornea,. healing.. organ-. cell attachment. fibronectin-fibronectin migration. important. wound. on the. were. of had. in the. coordinated. healing,. cultured. and. the. cell attachment. of corneal. epithelial. of cells attached and. attachment. epithelial. and. important. clarify. wound. cell layers. extracellular. to be very. To further. and. strongly. cells. temporary. was made. When the cornea. The appearance. seem. on the organ-. suggest. migration. a. in all the. layer. epithelial. epithelial. migration. migration,. migration. healing.. during. migration. findings. number. formed. wound. on the epithelial. corneal. an incision. the defects.. in the basal cornea.. after. observed. to cover. which. receptors. the epithelial. in the. Shortly. were. apparently. receptors. receptors. fibronectin. receptors. as in the normal. of fibronectin. fibronectin. epithelium.. only observed. weakly. of fibronectin that. fibronectin epithelium. they. cell layer. of the corneal. role. and. in the. healing.. healing,. the. cornea,. that. epithelial. a.
(5) 緒. 言 角 膜 上 皮 の 創 傷 治 癩 過 程 に お い て,接. 着 性 蛋 白 質 で あ るfibronectinが. の 接 着 ・伸 展 を 促 進 し て 上 皮 の 再 被 覆 を 促 進 し1-3,創 な 役 割 を 演 じ て い る こ と が 報 告 さ れ て い る4-1死 細 胞 が 細 胞 外 基 質 のfibronectinを. 上皮. 傷 治 癒 を 促 進 す る重 要. 上 皮 欠 損 の再 被 覆 は角 膜 上 皮. 認 識 す る こ と に よ っ て 開 始 さ れ,細. 胞 の接. 着 ・伸 展 ・移 動 に よ る 修 復 へ と 向 か う 一 連 の 反 応 が 起 る と 考 え ら れ る.上 胞 は 細 胞 膜 上 のfibronectin受 る と 考 え ら れ る.し fibronectinと. 容 体 を 介 し て 細 胞 外 のfibronectinを. た が っ て,角. 認 識 して い. 膜 上 皮 の 創 傷 治 癒 を 考 え る 時,細. と も に 細 胞 側 のfibronectin受. 皮細. 胞外 の. 容 体 の 役 割 が 重 要 で あ る.. 成 長 因 子 の 一 つ で あ る 表 皮 成 長 因 子(epidermalgrowthfactor,EGF)も たfibronectinと. ま. 同様 に 従 来 の治 療 法 で は 難 治 性 で あ った遷 延 性 角 膜 上 皮 障 害. の 治 療 に 有 効 で あ る こ と が 報 告 さ れ て い る11。fibronectinとEGFは. 角膜 上皮. 細 胞 に 対 し て そ れ ぞ れ 異 な っ た 機 序 で 作 用 し て い る こ と が 知 ら れ て い る2'12. 最 近Nishidaら13は. 組 織 培 養 し た 角 膜 を 用 い てEGFに. 進 作 用 がfibronectinに 作 用 がfibronectinに. よ る角 膜 上 皮 の伸 展 促. 対 す る 抗 体 で 阻 害 さ れ る こ と を 報 告 し て お り,EGFの 依 存 す る 系 を 介 し て い る こ と を 示 唆 し た.. 本 研 究 で は 角 膜 上 皮 細 胞 の 創 傷 治 癒 の 過 程 に お け るfibronectin受 割 を 明 ら か に し,さ. ら にEGFの. 容 体 の役. 角 膜 上 皮 細 胞 に 対 す る 作 用 機 序 にfibronectin. 受 容 体 が 関 与 し て い る か ど う か を 知 る こ と を 目 的 と し て,ラ 創 傷 治 癒 過 程 に お け るfibronectinとfibronectin受 体 法 を 用 い て 経 時 的 に 検 討 し,ま. ッ ト角 膜 に お い て. 容 体 の局 在 の 変 化 を 蛍 光 抗. た組 織 培 養 した角 膜 片 お よ び細 胞 培 養 した角. 膜 上 皮 細 胞 を 用 い てEGFがfibronectin受. 容体 活 性 の発 現 を促 進 す るか ど うか. に つ い て 検 討 し た.. 方. 法. 1.材. 料 お よ び試 薬. ラ ッ ト(WistarKyoto系,雄 兎(雌. 性,2∼3kg)は. 性,9∼11週. 齢)は. 北 摂 産 業 よ り 購 入 し た.ペ. ウ ム 溶 液(50mg/ml)はAbbotLaboratories社. 日 本SLC社. 色 家. ン トバ ル ビ タ ー ル ナ ト リ よ り,TC-199培. 一3一. よ り,白. 養 液,0.25.
(6) %trypsin溶. 液 お よ び0.02%EDTA溶. 液 は 阪 大 微 生 物 病 研 究 会,fetalcalf. serum(FCS)はFlowLaboratories社. よ り 購 入. し た.ヒ. ト表 皮 成 長 因 子. (humanrecombinantepidermalgrowthfactor,EGF)は. ア ー ス ケ. 会 社,ヒ. り 供 与 さ れ た.ウ. ト 血 清fibronectinはNewYorkBloodCenterよ. ギ 抗 ヒ トfibronectin受 社,ヤ. 容 体(α,β1integrin)抗. ギ 抗 ヒ トfibronectin抗. isothiocyanate(FITC)標 ヤ ギIgG血. 体,ウ. サ ギ 正 常 血 清,ヤ. 識 ヤ ギ 抗 ウ サ ギIgG抗. ギ 正 常 血 清,Fluorescein. 体 お よ びFITC標. 識 ウ サ ギ 抗 サ ギ 抗. 体 お よ び ウ サ ギ 抗 ウ シIV型collagen抗. ブ ミ ン(BSA,fraction-V)お. 体 はAdvance社,牛. よ び 蛍 光 分 析 用 グ リ セ リ ン は ナ カ ラ イ テ ク ス 社,. Arg℃ly-Glu-Ser-Pro(GRGESP)は. 岩 城 硝 子 お よ び 宝 酒 造 株 式 会 社,. 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社,96穴. を500倍. に,ヤ. 培 養 プ レ ー ト はCostar社. ト,ラ. に,ウ. ギ,モ. れ ぞ れ1%のBSAを. 600倍. サ ギ 抗. ヒ トfibronectin受. よ り購 入. 体(モ. 容 体 抗 体(ラ. し た.. ル モ ッ ト,ラ 添 加. に,ま. サ ギ,ラ. 体(ヒ. シ,ブ. ッ ト,マ. ウ ス,ウ. 識 抗 ウ サ ギIgG抗. 600倍. に 希 釈 し て 用 い た.. ニ に 交 差 性)を600倍. に 希 釈. 体 あ る い はFITC標. 体 に,そ. し て 用 い た.二 識 抗 ヤ ギlgG抗. ウ サ ギ 血 清 を. 次 抗 体 と し て, 体. を そ れ ぞ れ. 容 体,fibronectinお. 局 在 の 経 時 的 変 化 の 観 察. ラ ッ ト を ペ ン トバ ル ビ タ ー ル ナ 麻 酔 し,サ. ル モ ッ. 用 い て 希 釈. 照 と し て 正 常. 光 抗 体 法 に よ る ラ ッ ト 角 膜 切 開 創 のfibronectin受 よ びlamininの. タ,モ. し た 燐 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水(BSA-PBS)を. た は 正 常 ヤ ギ 血 清 を600倍. FITC標. ト,ウ. ッ トに 交. た は ウ サ ギ 抗 ウ シIV型collagen抗. ッ ト 角 膜 組 織 の 蛍 光 抗 体 染 色 に 用 い た.対 に,ま. ッ ト に 交 差 性). ル モ ッ ト,ウ. サ ギ 抗 マ ウ スlaminin抗. ッ ト に 交 差 性)を2,000倍. ト,ヤ. し,ラ. ,ウ. ギ 抗 ヒ トfibronectin抗. 差 性)を600倍. 3.蛍. はMiles社,crystalvioletは. 体. 一 次 抗 体 と して. (ヒ. よ びGly-. 合 同 酒 精 株 式 会 社,0.C.T.compound⑭. 2.抗. マ ウ ス. 血 清 ア ル. 合 成 細 胞 接 着 ペ プ チ ドGly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro(GRGDSP)お. Dispaseは. サ. 体 はTeliosPharmaceuticals. 清 はCappelProducts,OrganonTeknika社,ウ. laminin抗. ミカ ル 株 式. ト リ ウ ム 溶 液(30mg/kg)の. フ ァ イ ヤ ナ イ フ(KatenaProducts社)を 一4一. 腹 腔 内 注 射 で. 用 い て 右 眼 角 膜 中 央 に 深.
(7) さ200μm,長. さ4mmの. 角 膜 実 質 に 達 す る 非 穿 孔 性 の 線 状 の 切 開 を 加 え た.. 経 時 的 に ラ ッ ト を 麻 酔 死 さ せ,す. み や か に 眼 球 を 摘 出 し,0.C.Tcompound⑭. 中 に 包 埋 し 液 体 窒 素 中 で 凍 結 し,Microtomecryostat(Miles社 厚 さ4μmの. 凍 結 切 片 を 作 成 し た.切. 非 特 異 的 吸 着 を 防 止 し た.希 応 さ せ た. ,PBSで. 片 をBSA-PBSと1時. 温 で1時. 釈 し た 二 次 抗 体 を 切 片 に 添 加 し,室. 充 分 に 洗 浄 し た 後,PBSで50%に. リ セ リ ン で 封 入 し,落. 用 いて. 間室 温 で 反 応 さ せ. 釈 し た 一 次 抗 体 を 切 片 に 添 加 し,室. 洗 浄 し た 後,希. 時 間 反 応 さ せ た.PBSで. 製)を. 間反 温 で1. 希 釈 した 無 蛍 光 グ. 射 式 蛍 光 顕 微 鏡(BH-2,0LYMPUS社. 製)で. 観 察 し,. 写 真 を 撮 影 し た. 4.培. 養 家 兎 角 膜 片 を用 い た角 膜 上皮 伸 長 の計 測. 家 兎 角 膜 片 の 培 養 お よ び 上 皮 伸 長 の 測 定 は 既 報1'2に. 基 づ い て 行 な っ た.白. 色 家 兎 を ペ ン トバ ル ビ タ ー ル ナ ト リ ウ ム 溶 液 の 静 脈 注 射 に て 麻 酔 死 さ せ,速 か に 眼 球 を 摘 出 し た.PBSで. 眼 球 を 洗 浄 後,強. で カ ミ ソ リ 刃 に て2×4mmの い はfibronectin,ま. 角 膜 片 を 摘 出 し た.顕. 全 層 角 膜 片 を1眼. よ り6片. 養 液 中 で 一 定 時 間 培 養 し た.培. ル コー 一ル(酢. タ ノ ー ル95)で8時. 酸5:100%エ. ル で 脱 水 し,パ hematoxylin-eosin染. 色 を 行 っ た 後,光. を 用 い て 写 真 撮 影 を 行 な い,実. る. る い はGRGESP 養 終 了 後,酢. 間 固 定 し た.角. ラ フ ィ ン に 包 埋 し た 後,4μmの. 微鏡 下. 細 切 し,EGFあ. た 各 種 濃 度 の 合 成 ペ プ チ ドGRGDSPあ. を 添 上 し た 無 血 清TC-199培. や. 酸 ア. 膜 片 を エ タ ノ ー一. 薄 切 切 片 を 作 成 し た.. 学 顕 微 鏡(BH-2,0LYMPUS社. 製). 質 切 断 面 を 伸 長 した 上 皮 細 胞 層 の 長 さ を 計 測 し. た.デ. ー タ は 平 均 ± 標 準 誤 差 μm(n=6)で. 5.家. 兎 角膜 上 皮 細 胞 の 培 養. 表 し た.. 家 兎 を ペ ン トバ ル ビ タ ー ル ナ ト リ ウ ム 溶 液 の 静 脈 注 射 に て 麻 酔 死 さ せ,速 か に 両 眼 球 を 摘 出 し た.滅. 菌 し たPBSで. や. 眼 球 を 洗 浄 し た 後 角 膜 を 摘 出 し た.. ピ ン セ ッ トを 用 い て 角 膜 内 皮 細 胞 と と も に デ ス メ 膜 を 機 械 的 に 剥 離 除 去 し,残 た 角 膜 を0.2%dispase溶. 液 に 浸 し,37℃. で45分. 間 反 応 さ せ た.反. 応終了後 ス. パ ー テ ル を 用 い て 上 皮 細 胞 層 を 剥 離 し,0.125%trypsin-0.01%EDTA混 と と も に10分 間)に. 間 反 応 さ せ 単 離 細 胞 と し た.上. よ り 洗 浄 し,15%のFCSを. 含 むTC-199培 _K_. っ. 皮 細 胞 を 遠 心(1,000rpm,10分 養 液 中 で,5%CO,,37℃,. 合 液.
(8) 湿 度100%の 6.培. 条 件 下 で 培 養 し た.. 養 用 プ レー トの コ ー テ ィ ン グ. ー 定 濃 度 の ヒ ト血 清fibronectinのPBS溶 wellに50μ1滴 PBSで. 下 し,室. 洗 浄 し た 後,80℃. 下 し,室. 温 で1時. 温 で1時. 液 を96穴. 培 養 用 プ レ ー トの 各. で3分. 間 反 応 さ せ 表 面 を コ ー ト し た.プ 間 熱 処 理 し たBSA-PBSを. レ ー トを. 各wellに100μ1滴. 間 反 応 さ せ 非 特 異 的 接 着 を 防 止 し た.そ. の 後PBSで. 洗浄 し. た. 7.細. 胞接着能 の測定. 細 胞 接 着 能 の 測 定 は 既 報14に 基 づ い て 行 な っ た.上 %の. フ ィ プ ロ ネ ク チ ン を 除 去 し たFCSを. 種 濃 度 のEGFを. 含 むTC-199培. 添 加 し た 培 養 液 に 交 換 し,24時. を 除 去 し た 後,細. 胞 を 剥 離 し た.無. ペ プ チ ドGRGDSPあ. で 培 養 し た 後,10%ホ. crystalvioletを. 含 む95%エ. し た 後 乾 燥 し た.倒. 養 液 ま た は各 種濃 度 の 合 成. 調 製 し た.上. 皮細 胞浮 遊液 を コーテ ィ ン. つ 播 種 し た.プ. ル マ リ ン で 一 晩 固 定 し,流 タ ノ ー ル 溶 液 で20分. レ ー トを 一 定 時 間. 水 中 で 洗 浄 し,1%の. 間 染 色 し た.再. 立 型 位 相 差 顕 微 鏡(TMS,Nikon社. た 細 胞 数 を 計 測 し た.デ. 浄 し てEGF. 含 む 無 血 清培 養 液 を用 い て角 膜 上 皮 単. グ 済 の 培 養 用 プ レ ー トの 各we11に100μ1ず 37℃. 目 に1. 養 液 あ るい は さ らに 各. 間 培 養 し た.洗. 血 清TC-199培. る い はGRGESPを. 細 胞 の 浮 遊 液(1.0×104個/ml)を. 皮 細 胞 の 培 養4日. ー タ は 平 均 ± 標 準 誤 差,接. 製)で. び流 水 で洗 浄 観 察 し,接. 着 し. 着 細 胞 数/well(n=4). で 表 し た. 8.統. 計. 統 計 学 的 解 析 に はStudentt-testを. 結. 用 い た.. 果. 1.ラ. ッ ト角 膜 創 傷 治 癒 過 程 に お け るfibronectin受 1amininの. よび. 局 在 の経 時 的変 化. ラ ッ ト角 膜 は5∼6層. の 非 角 化 重 層 上 皮 か ら 成 る 角 膜 上 皮,主. ゲ ン 線 維 と 実 質 細 胞 か ら 成 る 角 膜 実 質,内 び1層. 容 体,fibronectinお. コ ラー. 皮 細 胞 の基 底 膜 で あ るデ ス メ膜 お よ. の 内 皮 細 胞 か ら な る 角 膜 内 皮 で 構 成 さ れ て い る(Fig.1-A)角 一6一. に1型. 膜 に非.
(9) 穿 孔 性 切 開 を 加 え る と 切 開 創 はV字. 型 に 開 き,12時. 上 皮 細 胞 が 伸 展 し(Fig.1-E),24時 plaqueを. 6層. 間 後 に は 欠 損 部 を 充 填 しepithelial. 形 成 し た(Fig.1-1).そ. epithelialplaqueは. 間後 に は実 質 の 切 断 面 を. の 後1週. 間 後 に は 実 質 の 再 生 が 起 り,. 菲 薄 化 し た(Fig.1-M).1ヵ. 月 後 に は 正 常 に 近 い5∼. の 平 坦 な 上 皮 構 造 に 回 復 し た(Fig.1-Q).. 正 常 お よ び 創 傷 治 癒 の そ れ ぞ れ の 時 期 に お け る 角 膜 のfibronectin受 対 す る 特 異 蛍 光 を 観 察 す る と,正 fibronectin受. 常 角 膜 上 皮 で は基 底 細 胞 の 細 胞 膜 に 強 く. 容 体 に 特 異 的 な 蛍 光 が 観 察 さ れ,基. 底 細 胞 の 直 上 の1∼2層. 細 胞 に も 弱 い 特 異 蛍 光 が 観 察 さ れ た(Fig.1-B).角 と,12時. 間 後 に はepithelialplaqueを 1-J).そ. 皮 が 実 質 欠 損 部 を 充 填 す る24時. 容 体 に 対 す る 特 異 蛍 光 は 徐 々 に 消 槌 し,1週. 間. 容 体 に 対 す る特 異 蛍 光 は 正 常 と 同 様 に 上 皮 基 底 細 胞 層 に. 強 く 認 め ら れ る よ う に な り(Fig.1-N),1ヵ い5∼6層. 容. 形 成 し た 細 胞 の 全 て に 最 も 強 く認 め ら れ た(Fig.. の 後fibronectin受. 後 に はfibronectin受. の. 膜 実 質 に 切 開 を加 え る. 間 後 に は 創 部 周 辺 に 伸 展 し て き た 上 皮 細 胞 の 全 層 にfibronectin受. 体 に 対 す る 蛍 光 が 観 察 さ れ(Fig.1-F),上. B)と. 容体 に. に 回 復 す る とfibronectin受. 同 様 に 基 底 細 胞 に 強 く,そ. た(F噛1-R).一. 月 後,上. 皮 の構 造 が 正 常 に 近. 容 体 に 対 す る 特 異 蛍 光 も正 常(Fig.1-. の 直 上 の 細 胞 に わ ず か に認 め られ る よ う にな っ. 方,fibronectinに. 対 す る 特 異 蛍 光 は 角 膜 実 質 の 最 表 層,. デ ス メ 膜 お よ び 実 質 層 間 の 実 質 細 胞 に 観 察 さ れ た(Fig.1-C).fibronectin に 対 す る 特 異 蛍 光 は 切 開 後3時. 間 目 に は 実 質 切 断 面 に 観 察 さ れ,そ. の後 持続 的. に 実 質 断 面 に 認 め ら れ た が 治 癒 の 進 行 と と も に 徐 々 に 消 槌 し た(Fig.1-G, K,OandS).角. 膜 に お け るIV型collagenに. 対 す る 特 異 蛍 光 は 同 じ局 在 を 示 し た.し よ びTに. はlamininに. 真 は 省 略 し た.正. 対 す る 特 異 蛍 光 お よ び1amininに た が っ てFigure1-D,H,L,Pお. 対 す る 蛍 光 顕 微 鏡 写 真 を 示 し,IV型collagenに. 常 の 角 膜 で はIV型collagenあ. る い は1amininに. 光 は 上 皮 下 の 基 底 膜 部 分 と デ ス メ 膜 に 観 察 さ れ た(Fig.1-D).切 る とIV型collagenや1amininに. 対す る写 対 す る特 異 蛍 開 が加 わ. 対 す る特 異 蛍 光 は 創 周 囲 の 上 皮 下 に は 正 常 の 場. 合 と 同 様 に 線 状 に 認 め ら れ る が,基. 底 膜 が 断 裂 し て い る 実 質 の 切 断 面 に は,上. 皮 が 再 被 覆 す る ま で 全 く観 察 さ れ な か っ た(Fig.1-HandL).上 一7一. 皮再生 お.
(10) Fig.. 1. Immunofluorescent fibronectin. staining. and laminin. of fibronectin. during. the process. corneal. wound healing. Normal. cornea. (I-L), corneal. 1 weeks (M-P) and 1 month incision were shown.. (A-D). —8—. receptors,. and 12 hours. of rat. (E-H), 24 hours (Q-T). after.
(11) Phase contrast localization. micrographs. of fibronectin. R), fibronectin. (A, E, I, and Q), and receptors. (B, F, J, N and. (C, G, K, 0 and S) and laminin. H, L, P and T) were shown. Bar shows 100 g m.. (D,.
(12) Incubation Fig.. 2. Effect. of the incubation. migration. Period period. on the organ-cultured. Corneal. blocks were cultured. culture. medium in the absence. the presence of 10 ng/ml Each value was expressed. (hours) on epithelial cornea. in a serum free TC-199 (open. circles). or in. of EGF (solid circles). an mean ± SEM (n = 6 )..
(13) よ び 実 質 再 生 の ほ ぼ 完 了 し た1週 1amininに. 間 後 に 上 皮 下 に 線 状 にIV型collagenお. 対 す る 特 異 蛍 光 が 観 察 さ れ(Fig.1-P),1ヵ. よ び. 月 後 に は 強 く線 状. に 上 皮 下 に 認 め ら れ る よ う に な っ た(Fig.1-T).一. 次 抗 体 の 代 わ り に対 照. と し て ウ サ ギ 正 常 血 清 ま た は ヤ ギ 正 常 血 清 を 用 い る と,い. ず れ の時 点 の組 織 に. お い て も 非 特 異 蛍 光 は 認 め ら れ な か っ た. 2.角. 膜 組 織 培 養 に お け る角 膜 上 皮 の 伸 長. 家 兎 角 膜 片 を 培 養 す る と 培 養 開 始12時 認 め ら れ な い が,そ. の 後24時. 例 し て 伸 長 し,24時. 間 後 に は 約500μmに. 濃 度 で 添 加 す る と,対. 間 にか け角 膜 上 皮 は実 質 の 断 面 を培 養 時 間 に 比 ま で 伸 長 し た.EGFを10ng/mlの. 照 と し て 培 養 液 の み で 培 養 し た 場 合 と 同 様 に12時. で は ほ と ん ど 伸 長 し な い が,そ お よ び24時. 間 ま で は ほ とん ど 角 膜 上 皮 の伸 長 が. の 後24時. 間 に か け 伸 長 が 促 進 さ れ,18時. 間 ま 間 目. 間 目 で は 対 照 に 比 し 有 意 に 上 皮 の 伸 長 が 促 進 さ れ て い た(p<. 0.001)(Fig.2). こ れ ら の 角 膜 上 皮 の 伸 長 にfibronectin受 検 討 す る た め にfibronectinの 合 成 ペ プ チ ドGRGDSPを. 容 体 が 関 与 して い る の か ど う か を. 細 胞 接 着 部 位 の ア ミ ノ 酸 配 列 で あ るRGDを. 加 え て24時. 間 培 養 す る と,Table1に. 示 す よ う に,. 角 膜 上 皮 の 伸 長 は 培 養 液 の み で 培 養 し た 対 照 に 比 し て 有 意 に 抑 制 さ れ た.構 が 類 似 し て い る 合 成 ペ プ チ ドGRGESPを 影 響 を 受 け な か っ た.培 す る と,上. 添 加 して 培 養. 間 後 に は 対 照 に 比 し て 有 意 に 増 加 し た が,さ 加 え る とfibronectinを. 度 ま で 有 意 に 抑 制 さ れ た.対. 照 と し てGRGESPを. 増 加 し,1.Ong/m1以. 添 加 し て 培 養 す る と,上. 添 加 し て も,fibronectinの. 皮 の 伸 長 はEGFの. に. 濃 度 に依 存 し て. 上 の 濃 度 で 対 照 に 比 べ 有 意 に 増 加 し た(Table2).EGF. に よ っ て 増 加 し た 上 皮 伸 長 に 対 す るGRGDSPの を 添 加 し て 培 養 し た 場 合,EGFの で 培 養 し た 群 と 同 程 度 ま で,有 GRGESPを. らに. 加 え な か った 場 合 と ほ ぼ 同 程. み を 添 加 し て 培 養 し た 場 合 の 上 皮 伸 長 と 比 べ 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た.次 培 養 液 中 にEGFを. 造. 膜 上 皮 の伸 長 は全 く. 養 液 中 に100μg/mlのfibronectinを. 皮 の 伸 長 は24時. 合 成 ペ プ チ ドGRGDSPを. 添 加 す る と,角. 含 む. 添 加 し て もEGFに. 効 果 を 検 討 す る と,GRGDSP. 存 在 下 で 培 養 し た 群 に お い て も培 養 液 の み 意 に 上 皮 の 伸 長 が 阻 害 さ れ た.し. か しな が ら. よ っ て 増 加 し た 角 膜 上 皮 の 伸 長 に は 全 く影 響 を 一11一.
(14) Table. Effects of GRGDSP and GRGESP. 1. (FN)-stimulated cultured cornea. epithelial. migration. Epithelial. Addition. 486. ±. GRGDSP. (1. mg/ml). 304. ±. GRGESP. (1. mg/ml). 492. ±. All. values. *. TC. 199. 1fp<0 .001: in. TC. FN. 199. alone •. without. 7.0* 12.1. different. any. (100. pg/ml). 627. 19. 2*. 330. 26. 7if. 630. 15. 5. those. over. cultured. additives. 11.d.... significantly with. 15.1. (pm). ± SEM (n=6).. mean. significantly. p<0.001: in. represent. on the organ-. migration. none. None. on fibronectin. •. aitierent. fibronectin. — 12 —. __. ov. se. cultured.
(15) Table. 2. Effect. cultured Concentration EGF. of EGF. on epithelial. values. *. of. Epithelial. (111n). 0. 722.5. *. 0.1. 765.4. ± 30.4. 1.0. 959.6. ± 46.2*. 1081.7. in. TC. represent. 199. alone. mean. as. organ-. migration. (ng/ml). control. ±. 30.9. 20.6*. ± SEM (n=6). different. significantly. p<0.001:. on the. cornea. 10.0. All. migration. over. those. cultured.
(16) Table. 3. Effects. of. stimulated cultured. GRGDSP. and. GRGESP. epithelial. migration. on. on. EGF -. the. organ. -. cornea Epithelial. Addition. migration. EGF. none. None. (pm). (10. 503. +. 14.5. 726. ±. 14.7* 8.31. GRGDSP. (1. mg/ml). 258. +. 13.6*. 254. ±. GRGESP. (1. mg/ml). 505. +. 11.8. 719. ±. All. values. *. 001:. p<0. in 1p<0 in. TC. 199. .001: TC. 199. represent. alone. without. significantly with. EGF. 19.2. ± SEM (n=6).. mean. significantly. ng/ml). different any. over. those. cultured. over. those. cultured. additives. different.
(17) =Z. 1.: 4:r) Al..,^. U). -di ....... •LI U 7; ...., -% .• ...-... CO ,-... Tj. CO 1' 4.) Ii..1 0 1... a). E. Incubation Fig.. 3. Period. (minutes). Effect of the incubation period on corneal epithelial cell attachment Number of cells attached to both the fibronectin matrix (10 Ltg/m1) (open circles) and the noncoated plastic plate (solid circles) was counted after 45 minutes of incubation. Each value was expressed as mean ± SEM (n= 4 )..
(18) 与 え な か っ た(Table3). 3.角. 膜 上 皮 細 胞 の接 着 能. 家 兎 角 膜 上 皮 細 胞 の 単 細 胞 浮 遊 液 を 無 処 理 の 培 養 用 プ ラ ス チ ッ ク プ レ ー トと 10μg/mlのfibronectinで と,接. コー トした 培 養 用 プ レー トに播 種 して 反 応 させ る. 着 し た 細 胞 数 は 反 応 時 間 に 応 じ て 増 加 し ほ ぼ45分. で 平 衡 状 態 に 達 し た.. 無 処 理 の プ レ ー トに 接 着 し た 細 胞 数 に 比 べ,fibronectinで. コ ー トし た 培 養 用. プ レ ー ト に 接 着 し た 細 胞 数 は,播 (Fig.3).ま 45分. 種 後15分. 以 降 有 意 に 多 か っ た(p〈0.001). た コ ー ト に 用 い たfibronectinの. 間 反 応 さ せ た 場 合,接. 10μg/ml以. 濃 度 に よ る 影 響 を 検 討 す る と,. 着 す る 細 胞 数 はfibronectinの. 上 の 濃 度 で 平 衡 状 態 に 達 し た(Table4).fibronectinmatrixに. 対 す る 角 膜 上 皮 細 胞 の 接 着 能 に 対 し て,EGFが る た め に,培 24時. 濃 度 に応 じて 増 加 し. 養 液 にEGF(10mg/m1)を. 間 培 養 し た 上,無. 影 響 を 与 え るか ど うか 検 討 す 添 加 して 角 膜 上 皮 細 胞 を あ ら か じ め. 血 清 培 養 液 を 用 い て 単 細 胞 浮 遊 液 を 調 製 し,fibronectin. を コ ー ト し た 培 養 用 プ レ ー トへ 播 種 し て 接 着 細 胞 数 を 測 定 し た.fibronectin matrixに. 接 着 し た 上 皮 細 胞 の 数 は,播. 種 前 に 上 皮 細 胞 の 培 養 に 用 い たEGFの. 濃 度 に 依 存 し て 増 加 し た.1.Ong/m1あ. る い は10ng/mlのEGFと. か じ め 培 養 し た 上 皮 細 胞 は,TC-199培 fibronectinmatrixへ. 養 液 の みで培 養 した 細 胞 に 比 べ 有 意 に. の 接 着 細 胞 数 が 増 加 し て い た(Table5).角. のfibronectinmatrixへ. の 接 着 能 に 対 す るGRGDSPの. 細 胞 浮 遊 液 中 にGRGDSPを. た が,0.003mg/ml以. EGFと. 濃 度 が0.01mg/ml以. ら に,播. 様 にGRGDSPの. 種 前 に10ng/. 影 響 を 検 討 した と. 下 で はfibronectinmatrixへ. の接 着 細. 添 加 し な か っ た 場 合 の 接 着 細 胞 数 と 有 意 差 を 認 あ ず,. 反 応 さ せ な か っ た 対 照 と 比 べ て 約40%増. GRGDSPが0。03mg/ml以. 濃 度 に依 存 して 接 着 細 胞. ま で 低 下 し た.さ. と も に 細 胞 を 培 養 し た 上,同. 胞 数 は,GRGDSPを. 加 え な か っ た場 合 と 同 程 度 で あ っ. は無 処 理 の プ ラ ス チ ッ ク プ レ ー トに 対 す る 非 特 異 的. 接 着 数 と 同 じ 程 度 の 約50個/wellに. こ ろ,GRGDSPの. 影 響 を 検 討 す る た め に,. 上 の 濃 度 に な る とGRGDSPの. 数 は 減 少 し1.Omg/mlで. 膜 上 皮細胞. 添 加 し た 上 播 種 す る と,GRGDSPが0.01mg/m1. 以 下 の 濃 度 で は 接 着 し た 細 胞 数 はGRGDSPを. mlのEGFと. と もにあ ら. 上 の 場 合,接 一16一. 加 し て い た(p〈0.001).. 着 細 胞 数 はGRGDSPの. 濃度 に依存 し.
(19) Table. 4. Effect of concentration. of fibronectin. on corneal. epithelial cell attachment. Concentration FN. of. Number. (pg/ml). the. cell. (cells/well). 42.0. ±. 3.1. 0. 01. 48.8. ±. 2.4. 0. 1. 71.5. ±. 1.8*. 1. 0. 103.5. ±. 8.3**. 0. 145.0. ±. 3.1*. 147.0. ± 15.0*. 100. of. attached. 0. 10.. Number. of. cells. fibronectin. attached matrix. to was. various. concentrations. counted. after. 45. minutes. of of. incubation. All *. values. p<0.001 those. represent and. incubated. mean. **p<0.005: on. ± SEM. (n=4).. significantly. non-coated. plastic. —17—. different plate. over.
(20) Table. 5. Effect of prior incubation. with EGF on corneal. epithelial cell attachment Concentration EGF. Number. of. to the fibronectin. Number. of. attached. cell. (ng/ml). (cells/well). 0. 153.5. ±. 4.2. 0 .1. 160.3. ±. 4.3. 1 .0. 204.8. ±. 6.5*. 10 .0. 215.3. ±. 13.0**. of. fibronectin. cells. attached. matrix. was. to counted. 10. matrix. pg/ml. after. 45. of minutes. the of. incubation. * p<0.001 those. and incubated. **p<0.02: in. TC. significantly 199. medium. — 18 —. different as. control. over.
(21) 250 cn. 71; 200. VU. C) 0:1 4=1. e4;t tir 0. E. 150. 100. 50. 0. z. Concentration Fig.. 4. of. GRGDSP. or. GRGESP. (mg/m1). Effects of GRGDSP or GRGESP on corneal epithelial cell attachment. to the fibronectin. Corneal epithelial. matrix. cells were cultured. in the absence. (open) or in the presence (solid) of EGF ml) for 24 hours before dissemination.. (10 ng/. Number. matrix. of cells attached. (10 1ug/ml). to the fibronectin. in the presence. (circles) or GRGESP (squares) 45 minutes of incubation. Each value was expressed. of either. GRGDSP. was counted. after. as mean ± SEM (n = 4 )..
(22) て 減 少 し た.さ はEGFと. ら にGRGDSPの. 濃 度 が0.1mg/ml以. 上 に な る と,接. と も に 培 養 し な か っ た 対 照 群 と 同 程 度 に ま で 減 少 し た.さ. g/mlで. は 非 特 異 的 接 着 と 同 程 度 に ま で 低 下 し た.一. GRGESPを. 方,対. 細 胞 浮 遊 液 に 添 加 し て も,fibronectinmatrixに. 着細胞 数 ら に1.Om. 照 ペ プ チ ドで あ る 接 着 す る細 胞 数 へ. の 影 響 は 認 め ら れ な か っ た(Fig.4).. 考. 察 fibronectinは. 血 漿 や 多 く の 組 織 に 分 布 し て い る 分 子 量 約220kDaの. 蛋 白 質 で あ る.fibronectinは じ る の み な ら ず,発. 接着性 糖. 生,組. 正 常 組 織 の 構 造 の 維 持 に 重 要 な生 理 的役 割 を 演 織 形 成,器. 官 形 成,創. 傷 治 癒,癌. 細 胞 の 転 移 ・浸 潤. な ど の よ う な 細 胞 の 接 着 や 伸 展 ・移 動 が 問 題 と な る 多 く の 生 物 現 象 に お い て 重 要 な 役 割 を 演 じ て い る15.細. 胞 表 面 に あ るfibronectinに. fibronectinのcel1-bindingdomainの (RGD)を. ア ミ ノ 酸 配 列 で あ るArg-Gly-Asp. 認 識 す る と さ れ て い る1賦fibronectin受. と 呼 ば れ る 受 容 体 群 の 一 つ で あ る1&19.integrin受 の α,お. よ び95-130kDaの. 対 す る受 容 体 は. β の2群. 容 体 はintegrinsuperfamily 容 体 は 分 子 量130-210kDa. の サ ブ ユ ニ ッ トか ら 成 り,α. お よ び βサ. ブ ユ ニ ッ トの 組 合 せ に よ り そ れ ぞ れ 異 な っ た細 胞 外 基 質 に対 応 す る こ と が 皮 膚 のkeratinocyteやfibroblast,さ い る.今. 回 用 い た 抗fibronectin受. fibronectinの. ら に リ ンパ 球 な ど の 研 究 か ら 明 ら か に な っ て 容 体 抗 体 の 抗 原 で あ る α 、β1integrinは. み を 認 識 す る 受 容 体 で あ り,さ. 受 容 体 で あ る α。β3integrinもfibronectinを. ら に α3β1integrinやvitronectin 認 識 す る2°-2乳. 角 膜 に 創 傷 が 加 わ る と 直 後 よ り 上 皮 が 欠 損 し た 実 質 の 部 分 にfibronectinが 出 現 し,一. 時 的 な 細 胞 外 基 質 を 提 供 し て 上 皮 細 胞 の 細 胞 外 環 境 を 整 え る23皿25と. と も に,上. 皮 細 胞 の 接 着 や 伸 展 ・移 動 を 促 進 す る1-3・12こ と が 報 告 さ れ て き た.. Figure1に. 示 す よ う に 今 回 の ラ ッ ト角 膜 に お け る 蛍 光 抗 体 法 に よ るfibronectin. の 局 在 の 変 化 の 結 果 は 従 来 の 家 兎 角 膜 に お け る 結 果 と 一 致 し て い た2璃.一 fibronectin受 て お り,主. 方. 容 体 は ラ ッ トの 正 常 角 膜 で は 上 皮 の 基 底 側 の 細 胞 に 強 く 局 在 し に 上 皮 細 胞 と 角 膜 実 質 と の 接 着 に 関 し て い る と 考 え ら れ た.こ. 果 は 最 近 報 告 さ れ た ヒ ト角 膜 や 家 鶏 お よ び 家 兎 角 膜 で のintegrin受 一20一. の結. 容 体 の局 在.
(23) の 結 果 と よ く一 致 し て い る26-2乳 角 膜 に 切 開 を 加 え る とfibronectin受 皮 基 底 細 胞 の み な ら ず,障 1).角. 害 部 周 辺 の 全 て の 上 皮 細 胞 に 強 く 観 察 さ れ た(Fig.. 膜 上 皮 細 胞 に お け るfibronectin受. 障 害 後12時. 間 目 に は 観 察 さ れ た.そ. 容 体 の 発 現 は き わ め て す み や か で,. の 後,角. 膜 実 質 に 出 現 し たfibronectinの. 上 を 上 皮 細 胞 が 伸 展 ・移 動 し上 皮 の 修 復 が 進 行 し,約1週 と 同 様 の 多 層 の 上 皮 層 が 再 生 さ れ る とfibronectin受 そ の 直 上 の 細 胞 に 限 局 し た.こ. 間後 に正 常 角膜 上 皮. 容 体 の 局 在 は基 底 細 胞 と. の 結 果 は 最 近 報 告 さ れ た,家. 的 に 剥 離 し た 場 合 の β1integrinの. 兎 角 膜 上皮 を機 械. 局 在 の 成 績 と よ く 一 致 し て い る26.こ. う に 角 膜 実 質 の 細 胞 外fibronectinと 補 的 な 分 布 を 示 し,上. 容 体 は上. 角 膜 上 皮 細 胞 膜 のfibronectin受. の よ. 容体 は相. 皮 再 被 覆 過 程 に お い て よ く調 和 し た 相 互 関 係 を 保 ち な が. ら 創 傷 治 癒 に 積 極 的 に 関 与 し て い る と 考 え ら れ る. fibronectinは. 角 膜 組 織 培 養 を 用 い た 研 究 で 角 膜 上 皮 の 伸 長 を 促 進 し,こ. 作 用 は 抗fibronectin抗 今 回 報 告 し た よ う に,同. 体 の 添 加 で 抑 制 さ れ る こ と が 報 告 さ れ て い る1・2.一. 容 体 と 結 合 す る 合 成 ペ プ チ ドGRGDSP. を 添 加 す る と 上 皮 の 伸 び は 阻 害 さ れ た が,構. Nishidaら29は. 造 が 類 似 した 合 成 ペ プ チ ド. 対 照 と し て 添 加 し て も 影 響 は 認 め ら れ な か っ た(Table1). 培 養 し た 角 膜 上 皮 細 胞 のfibronectinに. プ チ ド で 阻 害 さ れ る こ と を 報 告 し て い る が,今 ベ ル で 確 認 し て い る .さ. ら に,fibronectinへ. に よ っ て 促 進 す る と と も に,こ. のEGFの. 製 し た 新 鮮 な 上 皮 細 胞 に はfibronectinに. の 角 膜 上 皮 細 胞 の 接 着 性 がEGF 促 進 作 用 も ま たRGDペ. 家 兎 角膜 か ら調. 対 す る接 着 性 が 出 現 す る こ と を 報. はinvivoで. 再 被 覆 し て き た 上 皮 細 胞 に はfibronectinに に し た.こ. プ チ ドで 抑. 対 す る 接 着 性 が 認 め ら れ な い が,上. 皮 細 胞 を 培 養 す る こ と に よ りfibronectinに たNishidaとNakagawa3°. 対 す る 接 着 性 がRGDペ. 回 の成 績 は この報 告 を組織 の レ. 制 さ れ る こ と が 明 ら か と な っ た(Fig.4).Nakagawaら'4は. 告 し た.ま. 方. 様 の 組 織 培 養 系 を 用 い て 角 膜 上 皮 の 伸 長 をfibronectin. を 添 加 し て 促 進 し た 時 に,fibronectin受. GRGESPを. の. 対 す る接 着 性 が あ る こ とを 明 らか. れ ら の 報 告 と 今 回 の 結 果 か ら,細. れ に 対 応 す る 上 皮 細 胞 上 のfibronectin受. 角 膜 上 皮 を 擦 過 除 去 し た 後,. 胞 外 基 質 で あ るfibronectinと. 容体 の 活性 が角膜 上皮 創傷治癒 にお. け る 一 組 の 重 要 な 制 御 因 子 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た. 一21一. そ.
(24) EGFは. 分 子 量6.045kDaの. ポ リ ペ プ チ ドで 上 皮 や 様 々 な 細 胞 の 増 殖 な ら び に. 分 化 を 促 進 す る こ と が 知 ら れ て い る3133,EGFが. 角 膜 上 皮 の 伸 展 ・移 動 を 促 進. し角 膜 創 傷 治 癒 を 促 進 す る こ と はinviv♂-37やinvitro2に. お い て 報 告 さ れ,. 臨 床 応 用 に お い て も 重 症 角 膜 熱 傷 の 症 例 に 有 効 で あ っ た こ と が11報 告 さ れ て い る.今. 回 報 告 し た よ う に,EGFは. 組 織 培 養 の 角 膜 上 皮 の 伸 長 を 促 進 し た が,. 今 回 の 成 績 は こ れ ら の 報 告 と よ く一 致 し て い る.EGFは の 合 成 を 促 進 す る38と と も に,角 れ て お り,組. 膜 上 皮 細 胞 の 増 殖 を 促 進 す る2'39こ. 織 培 養 の 角 膜 を 用 い た 研 究 で もfibronectinは. て 核 酸 合 成 の 冗 進 を 伴 わ な い の に 対 し てEGFは 告 さ れ て い る2.一 chemotacticな. 方,EGFに. はfibronectinと. 皮 修 復 に 対 す るEGFの. 細 胞 増 殖 作 用 で あ る と 考 え ら れ て き た.し. 作 用 経 路 の 一 部 にfibronectinを. が 考 え ら れ る,今 用 は,fibronectin受. 回 報 告 し た よ う にEGFの. はGRGDsPに. 家兎 角 膜 上 皮 に対 す る伸 長 促 進 作. 容 体 と 結 合 す るGRGDSPに. よ り 抑 制 さ れ,対 た,EGFは. 対 す る 接 着 能 を 充 進 し た が(Table5),同. 角 膜上 皮細. 上 の 結 果 か ら,EGFが. 容 体 の活 性 の変 化 に作 用 す る こ と に よ っ て 角 膜 上 皮 細 胞 の 接 着. 家 兎 角 膜 上 皮 細 胞 のfibronectin受 現 在 入 手 可 能 な 抗fibronectin受 て い る た め で き な か っ た.し. し た.EGFと ま で に な く,今. 容 体 抗 体 が いず れ も家 兎 を 免 疫 して 作 成 さ れ か し 最 近Bellasら4°. 角 膜 上 皮 細 胞 のfibronectin受 後 検 討 す べ き 課 題 で あ る.し. よ っ てfibronectin受. 回 の研 究 に お い て. 容 体 そ の も の を 直 接 観 察 ・測 定 す う こ と は,. がSwiss3T3fibroblastを. 用 い て,β1integrinのgenetrascriptionがEGFに. fibronectin受. 照 と した. 様 に こ の接 着 能. な ら び に 伸 展 ・移 動 を 促 進 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る.今. EGFに. か しEGFが. 介 す る系 が 存 在 して い る こ と. よ っ て 阻 害 さ れ た(Fig.4).以. fibronectin受. 主 な作. 体 に よ っ て 阻 害 さ れ る13こ. は 何 の 影 響 も 受 け な か っ た(Table3).ま. 胞 のfibronectinに. 上 皮 の伸長 に際 し. は 異 な り角 膜 上 皮 細 胞 に 対 す る. 角 膜 上 皮 の 伸 長 を 促 進 す る 作 用 は 抗fibronectin抗 と か ら,EGFの. と が知 ら. 合 成 を 充 進 して い る こ とが報. 作 用 は 認 め ら れ な い1礼 現 在,上. 用 機 序 は こ れ らEGFの. GRGESPで. 角 膜 で のfibronectin. よ って 増 加 す る こ と を 報 告 容 体 との 関 連 に 関 す る報 告 は これ か し,角. 容 体 のgenetranscriptionが. 膜 上 皮 細 胞 に お いて も 促 進 さ れ,そ. 容 体 の 発 現 が 増 加 し て い る こ と が 推 測 さ れ る. 一22一. の結果.
(25) 今 回 の 研 究 に お い て は,抗 ト角 膜 を 用 い て 行 い,一. 体 の 交 差 反 応 性 の 点 か ら免 疫 組 織 学 的 研 究 を ラ ッ. 方 細 胞 生 物 学 的 研 究 は,実. 験 系 が一 定 以 上 の 角 膜 組 織. の 大 き さ を 必 要 と す る 点 か ら 家 兎 角 膜 を 用 い て 行 っ た.本 い て 行 わ れ る べ き で あ る が,今. 回 ラ ッ ト角 膜 で 観 察 さ れ た 結 果 は 他 種 の 角 膜 に. お い て も 同 様 の 結 果 が 報 告 さ れ て お り2a2引26-28,ま を 用 い た 実 験 系 で のfibronectinな く 一 致 し て い る 伺L34-3㌃. 来 は同 種 の 組 織 を用. ら び にEGFの. し た が っ て,本. た,組. 織 培 養 した 家 兎 角 膜. 作 用 は ヒ トで の 臨 床 結 果 と よ. 研 究 に 用 い た こ れ ら の 実 験 系 か ら得. ら れ た 結 果 は 動 物 種 に よ ら ず 角 膜 に お い て 共 通 な 現 象 で あ る と 考 え ら れ る. 以 上 よ り 今 回 の 研 究 か ら,組 fibronectinとfibronectin受. 織 学 的 に角 膜 上 皮 の 創 傷 治 癒 の過 程 に お いて. 容 体 が そ れ ぞ れ 細 胞 外 基 質 と上 皮 細 胞 に相 補 的 に. 出 現 す る こ と が 明 ら か と な っ た.ま 細 胞 を 用 い た 実 験 系 に よ り,機. た 組 織 培 養 した 角 膜 片 や 培 養 し た 角 膜 上 皮. 能 的 に も 角 膜 上 皮 の 接 着 ・伸 展 ・移 動 に 関 し て. fibronectin-fibronectin受. 容 体 系 が 中 心 的 な役 割 を演 じて い る こ とが 明 らか に. さ れ た.さ. よ る角膜 上 皮 修 復 の 促 進 作 用 は従 来 か ら報 告 され て. ら に,EGFに. い る 機 序(増. 殖,分. 化,細. 胞 外 基 質 の 合 成)に. 加 え て2・3亀39,fibronectin受. 容. 体 の 発 現 を 促 進 す る 機 序 が 関 与 し て い る こ と が 強 く 示 唆 さ れ た.. 謝. 辞 稿 を 終 わ る に あ た り 懇 切 な る御 指 導 と 御 校 閲 を 賜 っ た 恩 師 大 鳥 利 文 教 授 に 深. 甚 の 謝 意 を 表 し ま す.ま き ま し た 西 田 輝 夫 講 師,三 ま す.さ. た 本 研 究 を 遂 行 す る に あ た り,終 島 弘 講 師,な. 始 御 助 言,御. ら び に 中 村 雅 胤 氏 に 心 か ら感 謝 い た し. ら にhumanrecombinantepidermalgrowthfactorを. 御 提供下 さいま. し た ア ー ス ケ ミ カ ル 株 式 会 社 な ら び にhumanplasmafibronectinを さ い ま し たNewYorkBloodCenterのDr.B.Horowitzに 本 論 文 の 一 部 は 平 成3年5月,第95回 月,第23回. 指導頂. 御供 与下. 感 謝 い た し ま す. 日 本 眼 科 学 会 総 会 お よ び 平 成3年6. 結 合 組 織 学 会 に お い て 発 表 し た.. 一23一.
(26) 文 献. 1 ,. NishidaT,NakagawaS,AwataT,OhashiY,WatanabeK,ManabeR. Fibronectinpromotesepithelialmigrationofculturedrabbitcorneain situ。JCellBiol1983;97:1653-1657.. 2。. WatanabeK,NakagawaS,NishidaT.Stimulatoryeffectsoffibronectin andEGFonmigratiQnofcornealepithelialcells.InvestOphthalmolVis Sci1987;28:205-211、. 3.. NishidaT,NakagawaS,NishibayashiC,TanakaH,ManabeR. Fibronectinenhancementofcornealepithelialwoundhealingofrabbits invivo.ArchOphthalmo11984;1021455-456。. 4.. NishidaT,OhashiY,AwataT,ManabeR。Fibronectin:anewtherapyfor cornealtrophiculcer.ArchOphthalmo11983;101:1046-1048.. 5.. 千 原 悦. 夫,直. び 角 膜 潰 瘍. 6.. 井. 信 久,吉. 田 晴 子.Fibronectinに. の 治 療 成 績. 眼 紀1984;35:1846-1848.. よ. る 角 膜. 上. 皮. び. ら ん. お. よ. NishidaT,NakagawaS,ManabeR.Clinicalevaluationoffibronectin eyedropsonepithelialdisordersafterherpetickeratitis.Ophthalmology 1985;92:213-216.. 7,. PhanTM,FosterCS,BoruchoffSA,ZagachinLM,ColvinRB,Topical fibronectininthetreatmentofpersistentcornealepithelialdefectsand trophiculcers.AmJOphthalmol1987;104:494-501.. 8.. McCluskeyP,WakefielsD,YorkL.Topicalfibronectintherapyin. persistentcornealulceration.AustNZJOphthalmo11987;15:257-262.. 9.. 10.. 大 橋 秀 行,西 す. る フ ィ プ ロ ネ. 渡. 辺 幸 治,田. 果.眼. 11.. 田 輝 夫,大 ク チ. 辺 詔. 鳥 利 文.角. ン に よ. 子,村. る 点. 上 真 理. 膜 熱 傷. 眼 治 療.眼 子,平. ReimM,KehrerT,LundM.Clinicalapplicationofepidermalgrowth factorinpatientswithmostsevereeyeburns.Ophthalmologica1988;197:. 一24一. る 遷 延 性 角 膜 上 皮 欠 損. に 対. 紀1990;41:945-950.. 野 潤 三.フ. 紀1991;42:600-605.. 179-184.. に よ. ィ プ ロ ネ. ク チ. ン の 臨 床. 効.
(27) 12. Watanabe. K, Nakagawa. activities. S, Nishida. of fibronectin. Ophthalmol. for cultured. rabbit. Vis Sci 1988 ; 29 : 572. 13. Nishida T, Nakamura of fibronectin migration.. T. Chemotactic. M, Mishima. and epidermal. corneal. and haptotactic epithelial. cells. Invest. 577. H, Otori T. Differential. growth. factor. on rabbit. modes of action corneal. epithelial. J Cell Physiol 1990 ; 145: 549—554.. 14. Nakagawa. S, Nishida T, Kodama. epithelial. cells on fibronectin. 1990 ; 9 : 125. 17. Ruoslahti. corneal. matrices.. Cornea. extracellular. New York: Springer-Verlag,. KM. Fibronectin. Fibronectin:. and other. of cultured. 130.. 15. Hynes RO. Fibronectin. 16. Yamada. Y, Itoi M. Spreading. domains. San Diego: Academic E, Pierschbacher. and integrins.. and receptors.. 1990. In: Mosher. DF, ed.. Press, 1989 ; 47— 121.. MD. New perspectives. in cell adhesion:. RGD. Science 1987 ; 238 : 491 —497.. 18. Hynes RO. Integrins:. a family. of cell surface. receptors.. Cell 1987 ; 48 :. 549 —554. 19. Ruoslahti 20. Albelda. E. Integrins.. J Clin Invest 1991. SM, Buck CA. Integrins. 87 : 1 — 5 .. and other. cell adhesion. molecules.. FASEB J 1990 ; 4 : 2868—2880. 21. Hofer. U, Syfrig. characterization. J, Chiquet - Ehrismann of a dimeric. specific monoclonal. R. Identification. chicken fibronectin. antibodies. to the putative. and. receptor:. subunit-. chicken a 5. integrin.. J. Biol Chem 1990 ; 265 : 14561-14565. 22. Buck CA, Horwitz. AF. Cell surface. receptors. for extracellular. matrix. molecules. Ann Rev Cell Biol 1987 ; 3 : 179— 205. 23. Fujikawa. LS, Foster. CS, Harrist. TJ, Lanigan. in healing rabbit corneal wounds. 24. Suda T, Nishida appears. T, Ohashi. Lab Invest 1981 ; 45 : 120— 129.. Y, Nakagawa. at the site of corneal. JM, Colvin RB. Fibronectin. stromal — 25 —. S, Manabe. wound. R. Fibronectin. in rabbits.. Curr. Eye Res.
(28) 1981/ 1982 ; 1 : 553 —556. 25. Berman. M, Manseau. E, Law M, Aiken D. Ulceration. degradation. of fibrin. Ophthalmol. Vis Sci 1983 ; 24 : 1358— 1366.. 26. Grushkin-Lerner syndecan. and fibronectin. at the corneal. LS, Trinkaus-Randall. in vivo in a corneal. is correlated surface.. V. Localization. epithelial. abrasion. with. Invest. of integrin. and. and keratectomy.. Curr. Eye Res 1991 ; 10 : 75— 85. 27. Paallysaho cornea. T, Williams. DS. Epithelial. of actin, talin, integrin. cell- substrate. and fibronectin.. adhesion. in the. Exp Eye Res 1991 ; 52 :. 261 —267. 28. Lauweryns. B, van den Oord JJ,. Volpes R, Foets. Distribution. of very late activation. Ophthalmol. Vis Sci 1991 ; 32 : 2079— 2085.. 29. Nishida T, Nakagawa A peptide epithelial. S, Watanabe. from fibronectin. T, Nakagawa. cells. In: Beuerman. processes. in the cornea.. 135. (Advances. incisor eruption. KM, Otori T, Berman MB.. domain. inhibits. of fibronectin. RW, Crosson. Houston. attachment. receptors. CE, Kaufman. Gulf Publishing. in applied biotechnology. 31. Cohen S. Isolation. Invest. of. Vis Sci 1988 ; 29 : 1820—1825.. S. Expression. epithelial. L.. in the human cornea.. K, Yamada. cell - binding. cells. Invest Ophthalmol. 30. Nishida. integrins. B, Missotten. in corneal. HE, eds. Healing. Company,. 1989 ; 127 —. series; vol 1).. of a mouse submaxillary. gland. protein. and eyelid opening in the new- born animal.. accelerating J Biol Chem. 1962 ; 237 : 1555— 1562. 32. Carpenter. G. Epidermal. growth factor.. Ann Rev Biochem 1979 ; 48 : 193 —. 206. 33. Savage CR, Inagami growth. factor.. T, Cohen S. The primary. structure. J Biol Chem 1972 ; 247 : 7612—7621.. 34. Ho PC, Davis WH, Elliott JH, Cohen S. Kinetics regeneration. of epidermal. and epidermal. growth. factor.. — 26 —. Invest. of corneal Ophtalmol. epithelial 1974 ; 13 :.
(29) 804—809. 35. Schultz. GS, Davis JB, Eiferman. epithelium.. RA. Growth. and corneal. Cornea 1988 ; 7 : 96— 101.. 36. Brazzell RK, Stern ME, Aquavella recombinant. epidermal. growth. healing. Invest Ophthalmol 37. Tripathi. factors. factor. RW, Baird L. Human. in experimental. corneal. wound. Vis Sci 1991 .; 32 : 336— 340.. RC, Raja SC, Tripathi. in the management. JV, Beuerman. BJ. Prospects. of corneal disorders.. for epidermal. Sury Ophthalmol. growth. factor. 1990 ; 34 : 457-. 462. 38. Nishida T, Tanaka Fibronectin. H, Nakagawa. synthesis. growth factor. S, Sasabe. by the rabbit. cornea:. and cyclic AMP analogs.. T, Awata effects. T, Manabe. R.. of mouse epidermal. Jpn J Ophthalmol. 1984 ; 28 : 196—. 202. 39. Savage Jr. CR, Cohen S. Proliferation epidermal. growth. factor.. regulation. epithelium. induced. by. activation. of. Exp Eye Res 1973 ; 15 : 361 —366.. 40. Bellas RE, Bendori R, Farmer vinculin and j9 -integrin. of corneal. SR. Epidermal. gene transcription. growth. in quiescent. through a protein kinase C-independent. 1991 ; 266 : 12008— 12014.. — 27 —. factor. Swiss 3T3 cells:. pathway.. J Biol Chem.
(30)
図
関連したドキュメント
If condition (2) holds then no line intersects all the segments AB, BC, DE, EA (if such line exists then it also intersects the segment CD by condition (2) which is impossible due
The inclusion of the cell shedding mechanism leads to modification of the boundary conditions employed in the model of Ward and King (199910) and it will be
In Section 3, we study the determining number of trees, providing a linear time algorithm for computing minimum determining sets.. We also show that there exist trees for which
Many interesting graphs are obtained from combining pairs (or more) of graphs or operating on a single graph in some way. We now discuss a number of operations which are used
Keywords: continuous time random walk, Brownian motion, collision time, skew Young tableaux, tandem queue.. AMS 2000 Subject Classification: Primary:
Our method of proof can also be used to recover the rational homotopy of L K(2) S 0 as well as the chromatic splitting conjecture at primes p > 3 [16]; we only need to use the
Classical definitions of locally complete intersection (l.c.i.) homomor- phisms of commutative rings are limited to maps that are essentially of finite type, or flat.. The
Yin, “Global existence and blow-up phenomena for an integrable two-component Camassa-Holm shallow water system,” Journal of Differential Equations, vol.. Yin, “Global weak
