熊野灘海藻資源 による合成化合物不使用スキンケア製 品の研究開発 Re se a maa nddev e l o pme nto fskl ' nca r epr o duc t swl ' t AoutSynt het l ' cco mpou nds mman' nere s owc e sl

熊野灘海藻資源 による合成化合物不使用スキンケア製 品の研究開発

Re

s

e

a

mAa

ndDev

e

l

o

pme

nto

fSkl

'

nCa

r

e

p

r

o

duc

t

swl

'

t

AoutS

y

nt

het

l

'

cCo

mpou

nd

s

made

h

o

mMa

n'

n

e

Re

s

owc

e

sl

'

nKu

ma

n

O

-

nada

,Ce

nt

r

alo

f

J

a

pa

n

松浦信 男

1

)

2

)

,苔庵 泰志

3)

,榊宏 之 1

)

,河 田敏 勝 1

)

,落合穣 1

)

,

西村訓弘 1

)

,荒木利芳

4)

,

Y

asus

Al

'

Ko

ke

a

n

a

)

,

H

l

'

myu

kl

'

Sa

ka

k

l'1)

,

T

o

s

Al

'

kat

s

uKawd

a

l

)

,

No

buoMat

suu

r

Bl)L2)

y

ut

a

kaOc

Al

'

a

l'1),

Nwl

'

hl

'

m Nl

'

s

Al

'

mu

r

a

l),

T

o

s

Al

j

l

O

S

Al

'

Ar

a

k

l'4) 1)三重大学大学院医学系研究科生命 医科学専攻環境社会医学講座 トランスレーショナル 医科学 2)万協製薬株式会社 3)三重県工業研究所 医薬品･食 品研究課 4)三重大学大学院生物資源学研究科生物圏生命科学専攻水圏生物利用学研究室

1

)

2}anslatl'onalMedl'calScl'eDCe,Socl'alandEnvl'zTOnmentalMedl'cl'ne, GmdueteScAoolofMedl'cl'ne,Ml'etrnl'TleySl'ty

2)Bankyoj%azmaceutl'calao.,Ltd

3)Ml'ePTeEecturel'ndustTl'alReseazTChl'nstl'tute

4)Labwatwyfw theUtlllz'atl'onofAquatl'cBl'wesowces,DepartmeniofLl'feScience,

GrBdudteSchoolofBl'WesouzICeS,Ml'eUnl'veml'ty

はじめに 三重県尾鷲市は世界遺産 に認 定された熊野 古道 の入 り口であり､豊かな 自然 に恵まれ海 産 物をはじめとする多くの地域資源 を有している｡ さらに海洋深層水の取水が行われていて､それ らを関連付けた地域ブランドの開発や新産業創 出による地域経済の発展 に期待が高まっている｡ 特 に､海洋深層水を用いて実用化 されたハバノ リの陸上養殖は全国初である｡ さらに昨年度から三重県では､熊野灘 沿岸 に 生育する海藻であるヒロメを地元漁協などと協力 して養殖試験を開始しており､利用可能な大きさ に成長させ得ることを確認 している｡これら地域 資源 を有効利用した食 品などの開発 に取り組 む とともに､その成果 を本地域の特産物として広め ることで地域-の経済効果を期待している｡しか し､上述したような一般 的な食 品を目的とした生 産だけでは､コストや知名度などの問題から尾鷲 の地域資源 (深層水､ハバノリ､ヒロメ)を全 国的 に展 開し地域ブランドとして普及することは難 し い｡そこで､食 品素材より付加価噂を持つとされ る化粧 品素材-の利用を考えた｡一方 ､現在 の 化粧品の多くは合成高分子化合物を使用してお り､残留溶媒 のヒト-の影響 が懸念 される｡そこ で､海藻から得 られる高分子化合物を利用する ことによって､合成物を使用しないスキンケア製 品を生み出すことが求められている｡ そこで､食 品としてだけではなく､より付加価値 の高い化粧 品素材-の利用を考えた｡また､現 在の化粧品の多くは合成高分子化合物を使用し ているが､昨今 は粘性や保水性 に優れた海藻粘 質物などの天然素材 を使用したスキンケアに対 する要望が高まってきている｡ このような研究背景を持ち､三重県で万協製薬 株式会社が行なっている技術 と､三重大学及び 三重県工業研 究所 が研 究を進 めている本テー マについて共同で研究開発することにより､熊野 灘の海藻資源を有効活用した､合成化合物不使 用の天然素材スキンケア製 品の開発を目的とし て､次のような研究開発を実施した｡ 1)ハバノリの細胞壁分解酵素の開発 褐藻の細胞壁 はセル ロースと粘 質多糖である アルギン酸およびフコイダンで構成されている｡ 研究 成 果 報 告

また､褐 藻の粘 質多糖 は食 品､医薬 品､化粧 品 などに広 く利用されている｡本研 究ではこれら粘 質 多糖 を素材 としたスキンケア製 品の開発 を 目 的として､三重 県の特産 品であるハバノリとヒロメ からこれら粘質多糖を効率よく抽 出するための方 法を検討 した｡ 図

1.

アルギン酸リアーゼによるアルギン酸分解 海洋細菌 vl'b

n'

os

p.AL-

4

2

9

株 と Vl'b

n'

os

p.

MA-1

3

8

株のゲノム

DNA

からそれぞれアルギナ ーゼ(aJgA)遺伝子とセルラーゼ(ceMB)遺伝子を クローニングした｡alg:A 遺伝子 は

1

0

2

6b

p

の塩 基からなり､

3

41

残基 のアミノ酸をコードし､推 定 分子量 は

3

7

,

4

3

0

Da

､推定等電点は

4.

7

3

であっ た｡ceJgBは

3

5

7

残 基 のアミノ酸 をコー ドす る

1

0

7

4

b

p

からなり､その推定分子量は

4

0

,

9

3

2

Da

で､ 糖質分解酵素(GH)ファミリー8 に属していた｡両 酵素遺伝子をpETシステムで発現させ､酵素学 的性質を調べた｡組換えアルギナーゼ(rAlgA)は 至適pHが

8.

0

で至適温度は35℃､アルギン酸 を脱離反応 によって分解 し､種 々のオリゴ糖を生 ずるリアーゼであることが判明した(図1参照)｡ 2)酵 素処理技術 を活用 したハバノリ･ヒロメの有 効成分の効率的な抽 出精製技術の開発 ヒロメ粉末からのアル ギン酸抽 出に関してはア ルカリ抽 出法が熱水抽 出法より収率が高く､また 粘性も高かった｡ ヒロメ粉末 はセルラーゼで前処 理することにより粘性 が増 大した｡ヒロメアルギン 酸 の濃度 と粘 度 の関係 を調 べた結果 ､クリーム 製造には約1%濃度が適 していることが判 明した｡ また､ヒロメからのフコイダンの抽 出ではセルラー ゼで前処理することにより､メタノールの使用量を 減少 させることができた｡ヒロメとハバノリからフコ イダンとアルギン酸の連続抽 出を試 みた結果 ､フ コイダンとアルギン酸抽 出には酵 素前処理が効 果があることが判 明した｡また､粗フコイダン抽 出 物 のアルギナーゼ処理 は､フコイダンの精製 に 効果があった(図2,3参照)｡ 一主 題 率 率 鵬 ｡ 虫 ｡( ) 芸 や 蓋 一 望 fJ 墓 q V M M o･4 附 巾 ≠ ◆ ▲ ぎ兎短 図

2.

アルギン酸リアーゼ反応後の活性比較 rAlg:粗フコイダン抽出液にrAlg430F･全長を作用さ せた区､

C:

rAlg430F･全長の代わりに蒸留水を作用さ せた区 6 ド E ,○I,,ヽ ､ヽx/へヽ､ HF2 F 6 図

3.

フコイダン粗抽 出液 にアルギン酸リアーゼ を作用させた時のTLC G:グルコース水溶液(0.1%)､F:フコース水溶液 (0.3%)､E:emzyme､

C:

control(無処理)､R:アルギ ン酸リアーゼ処理､HF2:二回目抽出液をアルギン酸リ アーゼ処理したもの

3)ハバ ノリとヒロメを対象 とした高粘 性 物 質抽 出 法 の検討 (a)海 藻エキス成分の分子量分布 の把握 尾鷲市産ヒロメ(平成 20年 5月産天然 ､養殖 ､ 平成20年4月産養殖)および尾鷲市産ハバノリ (平成20年4月､7月産養殖)を研 究試料 とし､ アル ギン酸 ナ トリウムを主な 目的成 分 として､粘 性 物質を抽 出した｡抽 出法は､一般 的なアルカリ 抽 出法 の抽 出温度や ､抽 出後 のアル ギン酸ナト リウムの回収法 を変 更す ることにより､最適 な抽 出条件 を検討 した (図4参照)｡ 抽 出したアルギ ン酸 ナトリウムの推 定分子量 は､サイズ排 除クロ マトグラフィー

(

S

EC:

S

i

z

eEx

c

l

u

s

i

o

n

)

により分析 し た｡抽 出物 の精製 の判断は､FT-IR分析 により､ 抽 出前後 の共雑物 の吸収スペクトル の減少 で判 断した｡ 睦準革?:I_gIj 発_や3嵩t₁紬_L独ng_文事切._pmJ､

｣

冴

玉

F

.

造

､

角

,

-

}

既

充

,

,

古

棚

顔

T

で

ご

凄

ろ

淀

〉

･

,

l

P

､

i

項

i

､

'態'it巨%7i

ニ

l･

.

,

ケ

C

S

3

=

J

1

-

%

速

払

さ

!

7､

三

患

､

一

役

:

､

料

三

宅vy･付き

'

i

I

'

S

I

A

/

.

相

.

嶋

-1

ノ

r

s

ミ

H

t

,

ゝ

2

領

一く穴､‡･' -･嶋

.

-

文

芸

写

し

,

i

e

i

,場 数 miiEji

i

i

L

T.it-:二蔽こ ′浄写'_l泰郎･'JQム助辞韓

綿

.

'

;

董鼓漣環だY凝

終

全多額乾患粉末5各 ｢議壷蕪表還蒜｢

〕

董海退ヲ托 ､

ふ

7

1｢ -i=｣三軍′ p.･芳tbL:";dl 主点3t2_ー.苛め斧琵 ず .妙 で将 361線 ■一一7買気ここ .Lsi･_･穏巧 一 喝 一番 ミ'-好 一Y急 S･ 喜連鎚側 線笹 ‡ i 三 亘 eJ'JRA野整'こきも令硝 趣諦弼 ぴ.1円HL:;bLu汀L

室

温

,

.

一塊ーt,CJt激IPJ5廼 2%.∼-a.CO:.58触 L.馴℃､ユお {'-■三タノ ル隷旭t'-iⅥ滋-:ど ,53･m朝 11ZSui.1uL､室温､1古縛T乱 詠 む曾赴17､030噂,2C血書ほ軒 三%iTta=CU王､〕L､皇還パ鳴間 違か片轟け,800又9.20Frm エバポしタ で触 ､ 一 斗3℃(SL一一10かTL) ■一一･･魚雷席に対して畢斬 演舞蓋乾濃･粉 砕 アルギン巷ホa 全 多額からのアルギン聾3-トリウムの細 注 アル･ギン整j-hJjウムの頼長 <:之) 図

4.

アルギン酸ナトリウムを主な 目的成分とする 粘性物質の抽 出法 抽 出法 に関しては､室温で18時間アルカリ抽 出 後 に､減圧 濃縮することで､効率 的 にしかも分子 量の大きなアルギン酸ナトリウムを抽 出できること が明らかとなった (改 良法)｡このときのアル ギン 酸 ナ トリウムの推 定分子 量 は､養 殖 ハバ ノリ､養 殖ヒロメ､天然ヒロメでそれぞれ約159､81-101､ 92-149kDaとなった｡さらに抽 出温度 を80℃ に することで､抽 出時間が 2時間に短縮できること も明らかとなった｡ (b)海藻エキスの物性評価 抽 出したアルギン酸 ナトリウムの粘 度 特性 ､乳 化 特性 ､保水性および超音波処理 による物性 変 化を明らかにした｡ 抽 出検討 の結果得 られたアルギン酸ナトリウム の粘度 は､養殖ハバノリ､養 殖 ヒロメ､天然 ヒロメ (スペクトル は図

6

を参照)で､それぞれ約

7

4-

82､ 50､130-180mPa･S(1%W/v)となった｡スキンケ ア製 品 に天然ヒロメ由来 アル ギン酸 ナ トリウムを 1%(W/v)添 加 す る と ､試 作 品 の 粘 度 は 77,300mPa･Sとなった｡同様 に養殖ハバノリ(スペ クトル は図7を参照)より抽 出したアルギン酸ナトリ ウム1%(W/v)添加では 80,100mPa･Sとなり､いず れ も 万 協 製 薬 で の 社 内 基 準 (50,0 00-200,000mPa･S)を満たす値 であった｡これらのこと から､実際にアルギン酸ナトリウムのみの水溶液 では粘度 が一般 的にスキンケア製 品に用 いられ ている合成増粘剤 の粘度 (カルボキシビニルポリ マー､粘度 :1%水溶液で 12,000-155,000mPa･ S)より低くても､十分 に製 品に利用 可能であり､ス キンケア製 品に適 したアル ギン酸ナトリウムの分 子量は､約 150万 Da程度であると判 断した｡

乾燥粉末

1叩 き 5OnlFvIH:SOL10L､至芸､1醜 聞､ 遠心分熊1TTOOOxg,20nlin::2匡い

Eiii

iii

iii

Z

! ー =-_iA-芸諾 -:7,詰三…‥i.･=rJi=:j=≡≡ エバポレ′一 幸 ー で 濃 藷 L 図

5.

アルギン酸ナトリウムの抽 出 乳化性 は､改 良法 (図5を参 照)で抽 出した養 殖 ハバ ノリ､養 殖 ヒロメ､天然 ヒロメでは､それぞれ 研 究 成 果 報 告

約 94､88､88%となり､他の方法で抽 出したアルギ ン酸ナトリウムより優れていた｡乳化安定性 は､原 料 の種類や抽 出法 による変化 は示さなかったが､ 100%もしくはそれ に準ずる値 を示し､乳化安 定 剤 として良好な結果となった｡ アル ギン酸ナトリウム溶液(1%W/v)の超音波処 理では､天然ヒロメ由来アルギン酸ナトリウムの粘 度 は容 易 に減 少 したのに対 し､養殖ハバ ノリ由 来アルギン酸ナトリウムでは粘度低下に対して抵 抗性 を示 した｡また,天然 ヒロメ由来アルギン酸 ナ トリウムは､粘度 が低 くても保 水性 が保持 され ることが明らかとなった｡

.

-.

.

ヒElJ昔 菜`淵 . …,.,什 ヒロ月艶美-i-a ) ■++ ｡ー ■ 天鼓tEナトリウム'メア血ギン鮭 ‥ .養 建 ヒロメアナナリウ船恥 畿 . ..…._._(_ く.,.｡M ….■.●〟.誓!.了.'軒 ;!?..,.: '''`やか蛾 だも.-メ,...,,き,I.L Gゲルロン酸 M:マンヌロン鮭 12nn 9nft 波長【m rり 図

6.

アルギン酸ナトリウムの

F

T-

I

R

スペクトル (ヒロメ) 12･08 105-ll 邦 8 波長(rmll) 図

7.

アルギン酸ナトリウムの

F

T-

I

R

スペクトル (ハバノリ) 4)合成 高分子化合物を使用しないスキンケア製 品の開発

(

a

)

抽 出高分子 (海藻エキス)の粘度特性 および 乳化能の確認 ヒロメ及 びハバノリ抽 出液 について､製 品イヒを 行 なう上で､最適 な粘度及 び配合 量を確認 した｡ 表1に示すように､アルギン酸ナトリウム(市販 品)

1%

配合 品したものでは､合成 高分子 (カルボマ ー)0.2%に近い粘度を有したため､海藻抽 出液 も配合 量

1%

前後が最適ラインだと考えられた｡ 展延性 は合成高分子との間に差 はなく､pHも弱 酸性であり､pH調製をする必要はなかった｡ 表 1:検討クリーム剤 の粘度 ､pH､安定性 1 .3.生き. リ十王 首占度かf7托 ..=.:.it<覇i盟…鵡 窒画 賛を 竺 力戦帯で一子窮iT';'芦､瞬 !:,q'-7デTS;.I エーホ 巧｡ 書 :F.,:i ア舟Tl}酢 巨ijリ:A:,和声鮎 左;=う-3.i 言亡を.了申ご {'2'.呑 3弓, 舟'1 忘滋子不琵琶晶 ･三塁,gDD こ粥;ft 了三 重 ､,, ≠二秒LT経由栽蒋享繁藩 -L整-ラ W■,:}BCTi i:7.8… 36.

量

=(,,I,i 武男真山 .}短 甘=確 198 -はき-て .∋!.:i:gi3 /蒼.￠ 3こ 萱 -軸 て 解達郎ナ魂岩海ぴI>J鶴 し;3Ji =浦筑iぴ 班 .む ･jt 葦 =｡5 美感ヒ:Ti再u服毒…号,≡ー竜 A.{｣F≒ こ詔ノ了:)i> L!.tt3.5 37 妻 -く) 以上から､海藻抽 出液 は1%∼1.5%の範 囲で 配合を検討するのが妥 当だと考えられる｡次 に､ ヒロメ及 びハバノリ抽 出液 について､ヒト-の短期 保湿簡易評価試験を行った｡ 無 塗 布 10汀南 30汀壷 60rn:n 豊壌綾の鹿渡時間 図

8.

ヒロメ抽 出液

(

TU-

1

/

2

)

の保湿性簡易測定 測 定後 ､塗布部位 について経過観 察を行なっ た｡その結果､紅斑や腫れは認 められなかったこ とから皮膚-の安全性が簡易的に確認 された｡ また図8に示すように､ヒロメ抽 出物 には角質 水 分量 の低 下を抑制する効果 があると考 えられ

る｡しかしながら､無塗布 時より､角質水 分 量 が 減少 している｡このため､高精度の結果を得るに は､対象人数 を増やし､最適な測定環境 下での 保湿評価試験が必要であると考えられた｡ (b)配合製剤 の安定性 (安全性)確認 ヒロメ及 びハバノリ抽 出液 について､ラット-の 単回経 口投与毒性試験をおこない､各抽 出液 を 配合 したクリーム剤及びローション剤 については､ ウサギ-の連続皮膚刺激性試 験をおこない､そ の安全性 を確認した｡ ハバ ノリ抽 出物 1%溶液 では投与 回数 を重 ね るごとに皮 膚反応 がみられ はじめたことから､ハ バノリ抽 出物 1%溶液 は皮膚累積刺激性 を有す ると考えられる｡また､ハバノリ入 りクリームおよび ヒロメ入 りクリームでもともに投与 回数 を重 ねるご とに皮膚反応 の評 点が継続 および上昇している ことから､ハバノリ入 りクリームおよびヒロメ入 りクリ ームは､皮膚 累積刺激性を有すると考えられる｡ しかし､クリーム基剤 でも同程度の皮膚反応 を示 していることから､ハバノリ入 りクリームおよびヒロ メ入 りクリームでみられた皮膚反応 は､クリーム基 剤 が引き起こした皮膚反応 であると考 えられる｡ なお ､ハバ ノリ抽 出物 1%溶液 は皮膚 累積 刺激 性 を有 しているにもかかわらず ､ハバノリ抽 出物

1

%

含 有 ローションで刺激 がみられなかったが､ これ はローション基剤 により刺激性 が緩和された ことによると考えられる｡ (C)パッチテストによる試作品の評価 ローション剤及びクリーム剤 に関して健 常人40 名を対象 とした閉塞法皮膚貼付試験を行った｡ 各抽 出液 配合 品は､ベース基材 (抽 出物無配 合 品)との間に差 はなく､各ベース基材も精製水 との間に差 は認 められなかった｡このことから､ハ バノリあるい はヒロメ抽 出液 配合クリーム及 び配 合 ローションは市場での安全性 を十分 に有す る と考えられる｡ 今後 は､本処方 に万協製薬 においてすでに実 績 のある､防腐 設 計を導入することで､より安全 性 の高い製 品が供給できると考えられる｡ (d)ハバノリ抽 出物およびヒロメ抽 出物及 び配合 製剤 の短期保湿評価試験 ハバノリ抽 出物およびヒロメ抽 出物 の皮膚 に対 する物理 的な保湿効果及び､各抽 出液を配合 し たクリーム剤及びローション剤 (図9及 び図 10参 照)について､その保湿効果 の差を調 べるべく､ 健 常人 20名 を対象とした短期保湿評価試 験を 行ない､保湿性 の有無を確認 した｡ 各測定部位 ､測定時間毎に被験者 20人の平 均値 を算 出し､t- 0(塗布前)の値からの増加 率 を求 めた｡その結果 ､クリーム群

>

ローション 群 > エキス群 ､の順 にキャパシタンスの増加 率が高い結果 となった｡エキス群 ､ローション群 ､ クリーム群 ともに､ハバノリおよびヒロメ抽 出物 を 配合 した試験 品とコントロール として用いた試 験 品の間には差 は認 められなかった｡ 測定部位 が手首に近いほうがキャパシタンスの 値 が大きい傾 向がみられ､t-0の測定値 が増加 率 に及 ぼす影 響 が大きいと考 えられたため､同 様 にしてt-0の値からの増加 量を求めた｡その 結 果 ､増 加 率 と同じ傾 向がみ られ ､クリー ム群

>

ローション群

>

エキス群 ､の順 にキャパシ タンスの増加 量が高かった｡しかし､ハバノリ及 び ヒロメ抽 出物を配合した試験 品とコントロール とし て用いた試験 品に差は認 められなかった｡ 以上 のように本試 験 においては､剤 型 の違 い による保湿効果の違いは認められたものの､エキ ス(ハバノリおよびヒロメ抽 出物)を配合 した試 験 品とコントロール として用いた試験 品の保湿効果 に違 いはなかった｡今 回､用いた配合濃度 にお いては両エキスには短期 間での物理 的な保湿効 果 は認 められなかったものの､エキスの生物 学 的な作用 (例えば NMFや角層細胞 間脂質の増 加 ､バ リア機 能 の向上など)により､肌 状態 の改 善が期待 されるため､長期保湿試 験 において再 評価する必要がある｡ 4)製 品イメージと今後の課題及び展望 について 本研 究 により､前述のような研 究成果物 を得 る ことができた､今後の市場展 開を進 める足 がかり として､県 内の地域物産店や地域物産展示会な 研 究 成 果 報 告

どを利活用し､通常の化粧 品とは､異なる販売ル ートで情報を発信 しながら､新 しい販路を開拓し ていく予定である｡ 図

9.

海 藻抽 出物配合スキンケアクリーム 図10.海藻抽 出物配合スキンケアローション 参考文献

1) TakoM,KiyunaS,UechiS,and‖ongoF(2001) isolation and characterization ofAlginic acid 丘･om Commercially Cultured Nemacystus decipiens (Itomozuku), Biosci. Biotechnol.Biochem.,65, 654-657.

2) ShiromaR,UechiS,TairaT,IshiharaM,TawataS, andTakoM (2003)Isolationandcharacterizationof Fucoidan 丘･om Hizikia RlSifbrmis (Hiziki),∫.Appl. Glycosci.,50,36卜365.

3) ShiromaR,UechiS,TawataS,andTakoM (2007) IsolationandcharacterizationofAlginatefrom Hizikia f

usiformisandPreparationofitsOligosaccharides,J.

Appl.Glycosciリ54,84-90. 4)アルギン酸の化学構造､アルギン酸塩の性質 :大 野正夫編著､｢有用海藻誌｣､内田老鶴 圃､ pp444-445､2004 謝辞 本研究開発では､ヒロメ及びハバノリの養殖 に当たり 尾鷲市新産業創 造課奥村英二氏をはじめとする地元 漁 師並び に漁協 関係者から多大なる協力を受 けた｡ これ らの方 々に深 く感謝を申し上 げたい｡また､本研 究は､中部経済産業局からの委託事業として､同局か らの支援を受けて実施したものであり､この縁を頂けた 事 に深謝します｡ 最後 に､今 回の実験及 び論 文の作成 にあたり､多 大なご指導を賜 りました三重大学大学院生物 資源 学 研 究科生物 圏生命科学専攻水 圏生物利用学研究室､ 三重大学創 造 開発研 究センター ､三重県 工業研 究 所 医薬 品 ･食 品研 究課 の諸先生方 に厚 く御 礼 申し 上げます｡