上 野 敬 一 郎 ２０１３

バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー を 用 い た 地 域 植 物 資 源 の 育 種 学 的 活 用 に 関 す る 研 究

The Study of Biotechnological Application for Breeding using Local Plant Resources

上 野 敬 一 郎

２０１３

目 次

緒 論 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 1 第 1 章 地 域 植 物 資 源 の 探 索 と 活 用 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 6

－ 鹿 児 島 県 下 で 発 見 さ れ た ヒ ガ ン バ ナ 属 新 種 の 成 立 解 明 を 例 と し て － 第 2 章 種 苗 増 殖 に お け る 組 織 培 養 法 の 改 良 と バ イ テ ク 育 種 へ の 応 用 26 第 1 節 多 糖 類 産 生 土 壌 細 菌 に よ る オ レ ガ ノ 組 織 培 養 に お け る

水 浸 状 化 制 御 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・27 第 2 節 再 接 種 不 要 の 細 菌 に よ る 水 浸 状 化 制 御 法 の 検 証 ・ ・ ・36 第 3 節 ラ ズ ベ リ ー の 組 織 培 養 に お け る 種 苗 増 殖 へ の 水 浸 状 化 制 御 法

の 応 用 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・42 第 4 節 シ ャ ク ナ ゲ の 遺 伝 子 組 み 換 え 技 術 の 開 発 ・ ・ ・ ・ ・ ・47 第 3 章 突 然 変 異 育 種 を 用 い た 地 域 特 産 作 物 の 品 種 育 成 へ の 応 用

－ 輪 ギ ク を 例 と し て － ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・72 第 1 節 組 織 培 養 を 用 い た キ ク の 変 異 誘 発 と 個 体 選 抜 技 術 の 確 立 ・74 第 2 節 無 側 枝 性 お よ び 低 温 開 花 性 等 有 用 変 異 選 抜 技 術 の 開 発 ・ ・86 第 3 節 イ オ ン ビ ー ム 再 照 射 に よ る 再 改 良 技 術 の 確 立 ・ ・ ・ ・ ・ ・95 第 4 章 育 成 し た 新 品 種 の 全 国 展 開 と 将 来 展 望

－ 鹿 児 島 県 育 成 品 種 ， 秋 輪 ギ ク ‘ 新 神 ’ を 例 と し て － ・ ・ 134 第 1 節 鹿 児 島 県 に お け る 花 き 品 種 育 成 と 栽 培 普 及 ・ ・ ・ ・ ・ 135 第 2 節 品 種 の 保 護 対 策 と 管 理 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 137 第 3 節 種 苗 供 給 シ ス テ ム の 構 築 と 全 国 展 開 に 向 け た 方 策 ・ ・ 139 総 合 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 146 摘 要 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 157

Summar y ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 160

引 用 文 献 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 164 謝 辞 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 177 学 会 誌 公 表 論 文 リ ス ト ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 178

- 1 - 緒 論

地 域 植 物 資 源 の 活 用

我 が 国 は ， 北 海 道 か ら 小 笠 原 諸 島 も し く は 琉 球 列 島 に 至 る 亜 寒 帯 か ら 亜 熱 帯 の 気 候 の も と で 多 く の 遺 伝 資 源 が あ り ， 地 域 生 物 資 源 活 用 大 事 典 (藤 巻, 1 9 9 8 ) で は ， 地 域 の 活 性 化 に 役 だ つ 希 少 ， 未 利 用 ， 新 資 源 ， 地 方 品 種 を 含 め ， 植 物 資 源 2 5 3 種 が 掲 載 さ れ て い る ． こ れ ら の 中 に は 食 用 作 物 は も と よ り ， 染 料 や 繊 維 原 料 作 物 ， 薬 用 植 物 ， 観 賞 用 植 物 お よ び 森 林 資 源 が 含 ま れ ， 地 域 植 物 資 源 が 衣 食 住 に つ な が り 日 本 の 文 化 に 結 び つ く も の で あ る こ と が 示 さ れ て い る ． 一 方 ， 国 際 的 に は 生 物 多 様 性 を 守 り ， 遺 伝 資 源 を 持 続 的 に 利 用 し て い く た め の 枠 組 み と し て ，「 生 物 の 多 様 性 に 関 す る 条 約 （ C o n v e n t i o n o n B i o l o g i c a l D i v e r s i t y ; C B D : 1 9 9 3）」 が 発 行 さ れ ， 名 古 屋 市 で 開 催 さ れ た 同 条 約 の 締 約 国 が 集 ま る 生 物 多 様 性 条 約 第 1 0 回 締 約 国 会 議

（C o n f e r e n c e o f t h e P a r t i e s 1 0 ; C O P 1 0 : 2 0 1 0） は 記 憶 に 新 し い ． こ の 中 で ，1 ) 遺 伝 資 源 の 採 取・利 用 と 利 益 配 分 （A B S：A c c e s s a n d B e n e f i t

S h a r i n g） に 関 す る 国 際 的 な 枠 組 み の 策 定 ，2 ) 生 物 多 様 性 が 失 わ れ

る 速 度 を 2 0 1 0 年 ま で に 減 少 さ せ る た め の 「2 0 1 0 年 目 標 」 の 検 証 と 新 た な「 ポ ス ト 2 0 1 0 年 目 標 」の 策 定 等 が 議 論 さ れ ，海 外 の 遺 伝 資 源 利 用 に つ い て は 厳 し く 規 制 や 規 定 さ れ る に 至 っ て い る ． こ れ ら の 情 勢 を 含 め ， 国 内 の 地 域 植 物 資 源 に つ い て は そ の 重 要 度 が さ ら に 高 ま っ て い る と 言 え よ う ．

地 域 植 物 資 源 と 園 芸 利 用 ～ 鹿 児 島 県 を 例 と し て ～

鹿 児 島 県 レ ッ ド デ ー タ ブ ッ ク （ 鹿 児 島 県, 2 0 0 3） に よ る と ， 鹿 児 島 県 は 九 州 の 南 端 に 位 置 し ， 火 山 や 島 嶼 を 含 み ， 県 域 が 東 西 約 2 7 0 k m 南 北 約 6 0 0 k m に 及 ぶ こ と か ら 様 々 な 生 物 資 源 の 宝 庫 と 言 わ れ て い る 。 県 下 に は 学 術 的 に も 価 値 が あ る 南 限 種 ， 北 限 種 お よ び 固 有 種 が 多 く み ら れ ， 植 物 約 3 , 1 0 0 種 を 含 め ， 多 種 多 様 な 野 生 動 植 物 が 生 息 ・ 生 育 す る こ と が 報 告 さ れ て い る ． こ れ ら の 中 に は ， オ リ エ ン タ

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ル リ リ ー の 代 表 品 種 で あ る ‘ カ サ ブ ラ ン カ ’ を 始 め ， ユ リ 類 園 芸 品 種 の 交 雑 親 と し て 用 い ら れ て き た テ ッ ポ ウ ユ リ や タ モ ト ユ リ ， ウ ケ ユ リ が 含 ま れ る ． ま た ， 街 路 樹 や 庭 園 花 木 と し て 広 く 利 用 さ れ て い る ク ル メ ツ ツ ジ は ， 江 戸 時 代 か ら 品 種 改 良 が 行 わ れ （ 赤 司 ，1 9 1 9），

そ の 源 流 は 霧 島 性 ツ ツ ジ 類 と さ れ る （ 倉 重 ・ 小 林 ，2 0 0 8）． さ ら に ， 鉢 花 や 庭 園 花 木 と し て 利 用 さ れ る 西 洋 シ ャ ク ナ ゲ の 中 で も 屋 久 島 交 配 品 種 と 言 わ れ る 品 種 群 の 交 雑 親 に は ， 矮 性 で 草 姿 に 優 れ る 屋 久 島 シ ャ ク ナ ゲ が 用 い ら れ て き た ． こ の よ う に ， 現 在 の 様 々 な 園 芸 品 種 の 交 雑 親 に 鹿 児 島 県 な ら び に 九 州 の 固 有 種 や 自 生 種 が 用 い ら れ て き た ．

一 方 ，2 0 11 年 現 在 ， 鹿 児 島 県 の 農 業 産 出 額 は 4 , 0 0 0 億 円 を 越 え 全 国 4 位 に 位 置 し （ 鹿 児 島 県 農 政 部, 2 0 1 2）， 南 の 食 糧 基 地 と し て 消 費 者 ニ ー ズ に 対 応 し た 「 か ご し ま ブ ラ ン ド 」 を は じ め ， 安 心 ・ 安 全 な 食 の 供 給 を 図 り ，「 食 と 農 の 先 進 県 」を 目 指 し て い る（ 鹿 児 島 県 農 政

部, 2 0 1 2）．ま た ，農 業 産 出 額 の 部 門 別 構 成 比 は ，畜 産 5 7 % , 耕 種 4 1 %

と な っ て お り ， 耕 種 部 門 に お い て サ ツ マ イ モ ， サ ト ウ キ ビ ， 茶 ， 露 地 野 菜 ， 花 き 類 等 の 畑 作 物 は ， 全 国 上 位 の 地 位 を 占 め て い る （ 鹿 児 島 県 農 政 部, 2 0 1 2）．こ れ ら 多 数 の 品 目 に 対 し て ，主 要 作 物 類 は 国（ 独 法 ） の 品 種 育 成 と 連 携 を 図 る 他 ， 水 稲 ， 花 き 類 ， 豆 類 等 の 野 菜 ， 果 樹 等 で は 交 雑 育 種 を 含 め た 品 種 改 良 を 進 め ， 主 要 作 物 の 系 統 選 抜 や 地 域 適 応 性 の 高 い 優 良 品 種 の 育 成 を 図 っ て い る ．

バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー の 活 用

こ の よ う な ， 多 品 目 を 対 象 と し た 育 種 試 験 に お い て バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー の 活 用 場 面 を 探 る た め ， 著 者 ら は 地 域 植 物 資 源 の 探 索 ， 種 苗 増 殖 の 効 率 化 ， お よ び 突 然 変 異 に よ る 特 性 改 良 等 を 検 討 し ， 実 用 品 種 を 育 成 す る こ と に よ り ，こ れ ら の 技 術 の 有 効 性 を 実 証 し た ．ま た ， 育 成 品 種 の 普 及 を 目 的 と し て ， 品 種 保 護 や 種 苗 供 給 体 制 に つ い て 検

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討 し ， 許 諾 シ ス テ ム と 安 定 し た 種 苗 供 給 体 制 に よ り ， 全 国 で の 栽 培 を 実 現 し た ．

本 研 究 で は 鹿 児 島 県 の 多 様 な 地 域 植 物 資 源 の バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー に よ る 育 種 学 的 活 用 を 例 と し て ， 鹿 児 島 県 下 で 発 見 さ れ た ヒ ガ ン バ ナ 属 新 種 の 成 立 解 明 に よ る 地 域 植 物 資 源 の 探 索 と 活 用 ， 細 菌 の 共 生 関 係 を 利 用 し た 培 養 植 物 の 水 浸 状 化 抑 制 法 に よ る 組 織 培 養 法 の 改 良 と 分 子 育 種 へ の 応 用 ， お よ び イ オ ン ビ ー ム 照 射 に よ る 突 然 変 異 育 種 の 地 域 特 産 作 物 へ の 適 用 に つ い て 検 討 し た ． さ ら に ， こ の 手 法 で 育 成 し た キ ク 新 品 種 の 全 国 展 開 へ の 方 策 ， 問 題 点 ， お よ び そ の 将 来 性 に つ い て 行 政 的 観 点 か ら も 考 察 し た ．

第 1 章 で は ， ヒ ガ ン バ ナ 属 植 物 を 例 に ， 鹿 児 島 県 下 で 発 見 さ れ た ヒ ガ ン バ ナ 属 新 種 の 成 立 解 明 を 通 し て ， 地 域 植 物 資 源 の 探 索 と 活 用 に つ い て 検 討 し た ． ヒ ガ ン バ ナ 属 は 中 国 雲 南 省 を 起 源 中 心 地 と し ， 朝 鮮 半 島 を 経 由 し て 分 布 を 拡 大 し た 春 出 葉 型 と 台 湾 ・ 南 西 諸 島 を 経 由 し て 分 布 を 拡 大 し た 秋 出 葉 型 の 両 種 が あ る（ 栗 田, 1 9 9 8）. 鹿 児 島 県 下 に は そ の 両 種 が 自 生 す る こ と か ら ， ヒ ガ ン バ ナ 属 植 物 分 布 の 二 次 中 心 地 と 言 え る ． こ れ ら か ら 自 然 交 雑 に よ り 発 生 し た 新 種 の 起 源 を 解 析 し ， 花 粉 貯 蔵 や 胚 培 養 の 検 討 か ら 種 間 雑 種 育 成 に 向 け た 技 術 の 開 発 を 行 っ た ．

第 2 章 で は ， 非 病 原 性 の 多 糖 類 産 生 細 菌 に 着 目 し ， 植 物 と 細 菌 類 の 共 生 関 係 を 利 用 し た 組 織 培 養 中 に お け る 植 物 体 の 水 浸 状 化 抑 制 法 の 検 討 お よ び こ の 手 法 を 遺 伝 子 組 み 換 え 技 術 へ 応 用 し ， バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー に お け る 微 生 物 の 活 用 法 に つ い て 検 討 し た ． 特 に ， 組 織 培 養 を 利 用 し た 種 苗 生 産 や 供 給 の 際 ， 植 物 体 が 水 分 過 剰 で 水 浸 状 化 を 呈 し 順 化 効 率 が 低 下 す る ． こ の よ う な 問 題 に 対 し て ， 細 菌 接 種 法

（S h e t t y ら, 1 9 9 5） を 活 用 し ， そ の 効 果 が 認 め ら れ る 菌 株 に 加 え ，

同 様 の 効 果 を 示 す 菌 株 の 探 索 を 行 い ，水 浸 状 化 回 避 効 果 を 検 討 し た ．

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ま た ， 接 種 し た 菌 の 植 物 体 中 に お け る 定 着 性 や 宿 主 範 囲 の 拡 大 を 解 析 し ， 実 用 面 で の 活 用 の 可 能 性 を 論 じ た ．

ツ ツ ジ 属 に つ い て こ の 章 で は ， 屋 久 島 交 配 シ ャ ク ナ ゲ の 品 種 で あ る ‘ パ ー シ ー ワ イ ズ マ ン ’ を 用 い て 遺 伝 子 組 み 換 え 技 術 の 開 発 を 行 い ， 木 本 性 栄 養 繁 殖 作 物 の 品 種 改 良 手 法 と し て 技 術 の 確 立 を 検 討 し た ．

第 3 章 で は ， 近 年 従 来 の 放 射 線 よ り 高 エ ネ ル ギ ー を 局 所 的 に 付 与 し ， 広 い 変 異 ス ペ ク ト ル と 高 い 変 異 率 が 得 ら れ る イ オ ン ビ ー ム 照 射

（Ta n a k a ら, 2 0 1 0） に 着 目 し ， 輪 ギ ク を 例 に 栄 養 繁 殖 作 物 に お け る

イ オ ン ビ ー ム を 用 い た 突 然 変 異 育 種 法 （ 永 富 ，2 0 0 3） と ， 実 用 品 種 育 成 に 向 け た 技 術 開 発 に つ い て 検 討 し た ． 栄 養 繁 殖 作 物 に つ い て も 育 種 の 基 本 は 交 雑 に よ る が ， 特 に 高 次 倍 数 性 作 物 で あ る サ ツ マ イ モ や サ ト ウ キ ビ の 場 合 ， 品 種 育 成 場 所 で は 毎 年 数 千 ～ 数 万 個 体 の 交 雑 実 生 か ら ，長 期 間 に わ た る 選 抜・育 成 プ ロ グ ラ ム が 実 施 さ れ て い る ． こ の よ う な 栄 養 繁 殖 作 物 に つ い て ， 交 雑 を 必 要 と し な い 品 種 改 良 の 手 法 と し て ， 遺 伝 子 組 み 換 え の 他 ， 放 射 線 照 射 等 に よ る 突 然 変 異 育 種 が 挙 げ ら れ る ． こ れ ら は ， 基 本 的 な 品 種 特 性 を 維 持 し ， 新 た な 特 性 を 付 加 で き る 点 で 極 め て 有 用 な 手 法 で あ る ． し か し ， 実 用 レ ベ ル の 優 良 変 異 個 体 を 得 る た め に は ， 交 雑 育 種 と 同 程 度 の 個 体 数 か ら 選 抜・育 成 す る 効 率 の 良 い 培 養 系 と 選 抜 手 法 が 必 要 で あ る ．本 章 で は ， 第 2 章 で 開 発 し た 組 織 培 養 の 効 率 化 に 関 す る 知 見 を 基 礎 と し ， 第 1 章 の 細 胞 組 織 科 学 的 知 見 を 基 に ， 核 D N A 量 の 選 抜 へ の 利 用 を 図 る と と も に ， 有 効 な 選 抜 手 法 の 開 発 に よ り ， 輪 ギ ク 実 用 品 種 の 育 成 を 通 し て イ オ ン ビ ー ム 照 射 の 育 種 的 利 用 法 の 確 立 に つ い て 検 討 し た ． 第 4 章 で は ， 本 研 究 に よ り 育 成 し た 輪 ギ ク 新 品 種 の 普 及 ・ 展 開 を 図 る 上 で 育 成 者 権 の 保 護 と 種 苗 供 給 体 制 が 課 題 と な る ． そ こ で ， 品 種 識 別 D N A マ ー カ ー の 開 発 の 他 ， 本 県 育 成 品 種 の 許 諾 シ ス テ ム や 種 苗 供 給 体 制 を 検 討 し ，育 成 品 種 の 普 及 と 全 国 展 開 に つ い て 論 じ た ．

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ま た ， 突 然 変 異 や 遺 伝 子 組 み 換 え に よ る 品 種 育 成 は ， 基 本 的 に 従 属 品 種 と な る こ と か ら ， 育 成 者 権 を 保 持 し て い な い 品 種 に つ い て は 変 異 誘 発 の 対 象 と で き な い と い う 問 題 が あ る ． そ の よ う な 場 合 の 対 応 策 と し て 民 間 企 業 と の 連 携 ・ 共 同 に つ い て 検 討 し た ．

本 論 文 の 研 究 成 果 か ら 総 合 考 察 で は ， 地 域 植 物 資 源 の 探 索 と 活 用 の 成 功 事 例 と し て 鹿 児 島 県 種 子 島 特 産 の 「 安 納 い も 」 を 取 り 上 げ ， そ の 地 域 ブ ラ ン ド と し て の 発 展 過 程 を 論 じ た ． ま た ， 茎 頂 培 養 に お け る 内 生 菌 の 存 在 を 提 起 し ， 第 2 章 の 細 菌 と の 共 生 関 係 に よ る 培 養 効 率 向 上 の 他 ， エ ン ド フ ァ イ ト 様 の 機 能 性 付 加 に つ い て 論 じ た ． さ ら に ， イ オ ン ビ ー ム 照 射 に よ る キ ク の 品 種 育 成 を 通 し て ， イ オ ン ビ ー ム に よ る 突 然 変 異 育 種 と 今 後 の 展 開 に つ い て 論 じ た ．

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第 １ 章 地 域 植 物 資 源 の 探 索 と 活 用

－ 鹿 児 島 県 下 で 発 見 さ れ た ヒ ガ ン バ ナ 属 新 種 の 成 立 解 明 を 例 と し て ー

地 域 植 物 資 源 に は 植 物 本 来 の 分 布 拡 大 に よ り ， 日 本 国 内 に 自 生 し て い る も の の 他 ， 人 の 手 に よ り も た ら さ れ ， 定 着 し 在 来 種 と し て 存 在 す る も の も 数 多 く 含 ま れ て い る ． 古 く は 稲 作 の 伝 搬 を は じ め ， 茶 や 椿 も 薬 用 お よ び 工 芸 作 物 と し て も た ら さ れ ， 日 本 に 定 着 し た 作 物 で あ る ． 甘 藷 は 江 戸 時 代 に 琉 球 王 朝 か ら 寄 贈 さ れ ， 種 子 島 で 栽 培 に 成 功 し 日 本 全 国 に 広 が り ， 多 く の 飢 饉 を 救 っ て き た 歴 史 が あ る （ か ご し ま さ つ ま い も 小 辞 典, 2 0 0 5） ． ま た ， 全 国 各 地 の 畦 畔 や 墓 地 に 分 布 す る ヒ ガ ン バ ナ は ， 食 用 ， 薬 用 と し て 渡 来 し ， 救 荒 作 物 と し て 広 が っ た （ 松 江, 1 9 9 4） と さ れ て い る ． 本 論 で は ， 地 域 植 物 資 源 の 中 か ら ヒ ガ ン バ ナ を 例 に そ の 探 索 と 活 用 に つ い て 論 じ た ．

L y c o r i s属 植 物 は ，中 国 か ら 日 本 に か け て 1 5種 ほ ど 分 布 し て お り ，

我 が 国 に は 5 種 が 自 生 も し く は 半 自 生 し て い る （F i g . 1 - 1 - 1 A - E） ． な か で も 鹿 児 島 県 下 に は 豊 富 な 自 生 が 見 ら れ ， い わ ば L y c o r i s 属 植 物 の 二 次 中 心 地 と い っ て も 過 言 で は な い ． そ の 当 地 に お い て ， 新 し い 系 統 と 思 わ れ る 2 種 類 の L y c o r i s が 見 出 さ れ た ．

こ れ ら は ， 故 大 野 一 矢 氏 （ 鹿 児 島 県 根 占 町 ） が 県 内 の L y c o r i s 属 を 収 集 し た 際 に 選 抜 し ， 数 年 前 か ら L . t r a u b i i T r a u b . （ シ ョ ウ キ ズ イ セ ン ） の 選 抜 種 と し て ‘ オ オ ス ミ ’ と ‘ ベ ニ サ ツ マ ’ と い う 品 種 名 で 市 販 さ れ る に 至 っ て い る ． 花 色 は 前 者 が 樺 色 で 後 者 が 朱 紅 色 で あ り 花 色 以 外 の 形 態 的 な 差 異 は ほ と ん ど 見 ら れ な い( F i g . 1 - 1 - 1 F , G )． 著 者 ら は 県 内 を く ま な く 調 査 し た 結 果 ， こ れ ら が 薩 摩 半 島 南 端 の 鹿 児 島 県 山 川 町 を 中 心 と し た 地 域 に 限 定 し て 自 生 し て い る こ と を つ き と め ， さ ら に そ の 形 態 ， 花 色 素 ， 花 粉 稔 性 お よ び 核 型 分 析 な ど の 調 査 に よ り ，両 者 が 同 一 起 源 の 雑 種 ，つ ま り L . s a n g u i n e a M a x i m . （ キ

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ツ ネ ノ カ ミ ソ リ ） と L . t r a u b i i の 交 雑 に よ る も の で あ る と 推 定 し た

（ 野 添 ら ，1 9 7 8 ; 上 野 ら ，1 9 8 3） ．

本 実 験 で は ， こ れ ら の 成 立 を 実 証 す る た め ，L . s a n g u i n e a と L .

t r a u b i i の 人 為 的 な 交 雑 を 行 い ， 両 親 種 と こ の 2 系 統 の L y c o r i s， な

ら び に 得 ら れ た 交 雑 実 生 に つ い て 形 態 学 的 ， 細 胞 学 的 な 観 察 か ら 比 較 検 討 を 行 っ た ． ま た ，L . s a n g u i n e a と L . t r a u b i i の 自 然 交 雑 の 可 能 性 を 探 る た め ， 両 種 の 分 布 な ら び に 開 花 期 に つ い て の 調 査 も あ わ せ て 行 っ た ．

な お ，本 報 で は 新 し い 系 統 の L y c o r i s を 以 下 L . s p .と 示 す こ と と し ， 花 色 が 樺 色( s t r a w c o l o r e d )の 方 を L . s p . A， 朱 紅 色( v e r m i l i o n )の 方 を L . s p . B と 示 す こ と と す る( F i g . 1 - 1 - 1 F , G )． ま た ， 稲 荷 山( 1 9 5 3 )は シ ョ ウ キ ズ イ セ ン を L . a u r e a H e r b .と 表 記 し て い る が ，日 本 産 と 中 国 産 の 黄 色 ヒ ガ ン バ ナ を 別 種 と し た H a y w a r d ( 1 9 5 7 )の 分 類 に 従 っ て ， シ ョ ウ キ ズ イ セ ン の 学 名 は ，L . t r a u b i i の 学 名 を 採 用 し た ．

材 料 お よ び 方 法 １ 交 雑 実 験

L y c o r i s t r a u b i i に は 染 色 体 数 2n= 1 2 , 1 3 お よ び 1 4 の 3 種 類 が 知 ら れ て い る が （B o s e , 1 9 5 8 ; B o s e･F l o r y , 1 9 6 3 ; 稲 荷 山, 1 9 5 3） ， 鹿 児 島 県 下 の も の は ほ と ん ど が 2n= 1 3 型 で あ り ，よ く 結 実 す る ．ま た ，2n= 1 2 お よ び 2n= 1 4 型 の 配 偶 子 が い ず れ も 1 種 類 の 核 型 ， す な わ ち 前 者 が 5 V + 1 R 型 ， 後 者 が 4 V + 3 R 型 の 配 偶 子 を 生 じ る （ 稲 荷 山, 1 9 5 3 ; 竹 村,

1 9 6 2）と さ れ て い る ．こ の 例 に 準 じ る と 2n= 1 3 型 は 5 V 型 と 4 V 型 の

配 偶 子 を あ わ せ も つ と 考 え ら れ ， 後 代 に 2 種 類 の 核 型 を 期 待 し う る こ と か ら ， 交 雑 親 と し て は 2n= 1 3 型 の L . t r a u b i i を 用 い た ．

ま た ，L . s a n g u i n e a は 7 月 中 旬 ～8 月 上 旬 に 開 花 し ，L . t r a u b i i は 9 月 中 旬 ～ 下 旬 に 開 花 す る た め ， 開 花 期 に 2 か 月 近 い 差 が あ る ． そ こ

で ，L . s a n g u i n e a を 花 粉 親 と す る 場 合 は ， 開 花 期 に 花 粉 を 採 集 し ，

デ シ ケ ー タ ー （ シ リ カ ゲ ル 入 り ） 中 で 室 温 乾 燥 後 ，- 2 0℃ の 低 温 条 件

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下 で 貯 蔵 し た も の を 交 雑 に 供 し た ． こ れ に 対 し て ，L . t r a u b i i を 花 粉 親 と し て 用 い る 場 合 は ， 秋 咲 き 性 の L . s a n g u i n e a が 新 し く 見 つ か っ た の で こ れ を 母 本 と し た ． こ れ ら 秋 咲 き 性 の L . s a n g u i n e a は ，1 9 8 1 年 以 降 著 者 ら の 調 査 で 九 州 中 部 か ら 南 部 に か け て 分 布 す る こ と が 明 ら か に な っ た も の で ， 特 に 鹿 児 島 県 産 の も の は L . t r a u b i i と 開 花 期 が 完 全 に 一 致 す る た め ， 新 鮮 な 花 粉 に よ る 交 雑 が 可 能 で あ っ た ． な お ， 花 粉 の 低 温 貯 蔵 の 影 響 を 確 認 す る た め ， 交 雑 す る 前 に 予 め 新 鮮 お よ び 貯 蔵 花 粉 の 発 芽 率 を 次 の 方 法 に よ り 調 査 し た ． す な わ ち ホ ー ル グ ラ ス に 発 芽 培 地 （ グ ル コ ー ス 1 0 % , 寒 天 1 %） を と り ， 蒸 留 水 を 1 滴 滴 下 し た 上 に 花 粉 を ま き ， 保 湿 し た 状 態 で 2 0℃ ，2 4 時 間 培 養 し て 花 粉 管 の 伸 長 し た 花 粉 粒 を 計 測 し た ．

交 雑 は 露 地 育 成 植 物 を 母 本 と し ， 開 花 直 後 の 開 葯 前 に 除 雄 し ， 受 粉 後 に 袋 が け を 行 っ た ．受 粉 1～1 . 5 か 月 後 ，種 皮 が 黒 色 を 呈 し た 完 熟 し た 時 点 で 採 種 し た ．

２ 核 型 分 析

体 細 胞 染 色 体 の 観 察 は ， 根 端 を 前 処 理 と し て 0 . 0 5 %コ ル ヒ チ ン 溶 液 に 6 時 間 侵 漬 し ，固 定 せ ず に 1 N - H C l で 6 0℃ ，6 0 秒 間 解 離 し た 後 ， 酢 酸 オ ル セ イ ン に よ る 押 し つ ぶ し 法（ 田 中 ・ 浜, 1 9 6 1）に よ り 行 い ， 竹 村 （1 9 6 1） の 報 告 に 従 っ て 核 型 分 析 を 行 っ た ．

結 果 お よ び 考 察

１ 両 親 種 と L. s p . の 核 型

L y c o r i s s a n g u i n e a は 2 2 本 の 棒 形 染 色 体 ( r o d - s h a p e d c h r o m o s o m e） を 持 ち ，2n= 1 3 型 の L . t r a u b i i は 9 本 の V 型 染 色 体( m e t a c e n t r i c c h r o m o s o m e ) と 4 本 の 棒 状 染 色 体 を も つ て お り （F i g . 1 - 1 - 2 A , B , T a b l e 1 - 1 - 1），こ れ は 稲 荷 山 ( 1 9 5 3 )，B o s e ( 1 9 5 8 )，お よ び B o s e･F l o r y

( 1 9 6 3 )の 報 告 と 同 様 で あ っ た ． 他 方 ，L . s p . の 染 色 体 数 は ， 樺 色 の

L . s p . A が 2n= 1 7， 朱 紅 色 の L . s p . B が 2n= 1 8 で ， 前 者 の 核 型 は 5 本

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の V 型 染 色 体 を も つ 5 V + 1 2 R 型 ， ま た ， 後 者 の そ れ は 4 本 の V 型 染 色 体 を も つ 4 V + 1 4 R 型 で あ っ た （F i g . 1 - 1 - 2 C , D , T a b l e 1 - 1 - 1） ． 周 知 の よ う に ，L y c o r i s 属 植 物 の う ち 雑 種 起 源 に よ り 成 立 し た 種 と し て は ，L . a l b i f l o r a K o i d z . が あ る ． こ の 種 の 核 型 は 5 V + 1 2 R 型 で あ る こ と か ら ，2 2 R 型 の L . r a d i a t a H e r b . v e r . p u m i l a H o r t .と 1 0 V + 2 R 型

の ，L . t r a u b i i 間 の 種 間 交 雑 に よ り 発 生 し た も の と 推 定 さ れ（ 稲 荷 山,

1 9 3 1 , 1 9 3 2 , 1 9 5 3） ， 実 際 に 両 種 を 交 雑 す る こ と に よ っ て ， そ の 発 生

起 源 が 実 証 さ れ た （ 竹 村, 1 9 6 2） ． す な わ ち ， 減 数 分 裂 の 際 ，2 2 R 型 の L . r a d i a t a v e r . p u m i l a は 1 1 R 型 の ，1 0 V + 2 R 型 の L . t r a u b i i は

5 V + 1 R 型 の 配 偶 子 を そ れ ぞ れ も つ こ と か ら （ 稲 荷 山, 1 9 5 3） ， 両 種

の 交 雑 種 は 両 者 の 配 偶 子 の 和 ，つ ま り ，L . a l b i f l o r a と 同 様 の 5 V + 1 2 R 型 の 核 型 を も つ こ と に な る ． こ の 例 に 準 じ て 考 え る と ，9 V + 4 R 型 の

L . t r a u b i i か ら は 減 数 分 裂 に よ り 5 V + 1 R と 4 V + 3 R が 1 : 1 の 割 合 で で

き る ． こ れ が L . s a n g u i n e a か ら の 配 偶 子 1 1 R と 受 精 に あ ず か る と ， 雑 種 は 5 V + 1 2 R 型 と 4 V + 1 4 R 型 の 核 型 を も つ こ と に な る ． 著 者 ら が 観 察 し た L . s p .の 2 種 類 の 核 型 は ， こ の 考 え の 正 当 性 を 示 唆 し て い る ．

２ 交 雑 実 験

L y c o r i s t r a u b i i を 母 本 と し L . s a n g u i n e a を 花 粉 親 と し た 交 雑 は 1 9 8 1 年 9 月 に ， ま た L . s a n g u i n e a を 母 本 と し L . t r a u b i i を 花 粉 親 と し た 交 雑 は 1 9 8 3 年 9 月 に 行 い ，両 交 雑 で 雑 種 種 子 を 得 る こ と が で き た( T a b l e 1 - 1 - 2 )． な お ， 両 交 雑 に お け る 結 実 率 は ，L . s a n g u i n e a を 母 本 と し た 場 合 の 3 0 . 1 %に 比 べ て ，L . t r a u b i i を 母 本 と し た 場 合 は 7 . 3 % と 極 端 に 低 か っ た ． こ の 違 い は ， 母 本 と し た L . s a n g u i n e a の 結 実 性

が L . t r a u b i i の そ れ よ り 高 い こ と に 起 因 す る と も 考 え ら れ る が ， 花

粉 の 新 鮮 さ の 違 い ， す な わ ち L . t r a u b i i×L . s a n g u i n e a の 場 合 は 発 芽 率 6 0 %程 度 の 貯 蔵 花 粉 を ， ま た ，L . s a n g u i n e a ×L . t r a u b i i の 場 合 は 発 芽 率 9 6 . 5 %の 新 鮮 花 粉 を 用 い た こ と も 関 与 し て い た と 考 え ら れ る ．

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い ず れ に し て も ， 正 逆 交 雑 で 種 子 が 得 ら れ ， 未 発 芽 の 種 子 を 含 む も の の 雑 種 個 体 が 得 ら れ た こ と( T a b l e 1 - 1 - 2 )は ， 両 種 は 交 雑 す る 機 会 さ え あ れ ば た や す く 交 雑 し ， 雑 種 が 生 じ る こ と を 示 唆 し て い る ． ３ 交 雑 実 生 の 外 部 形 態

L y c o r i s t r a u b i i の 実 生 苗 は 葉 先 が と が り ， 葉 幅 が 中 央 で 広 く ， 広

線 形 の 葉 を し て お り ，L . s a n g u i n e a の 実 生 苗 は 葉 先 が 丸 く ， 葉 幅 は 一 定 で 帯 状 の 葉 を し て い る( F i g . 1 - 1 - 3 )． こ の よ う な 両 種 の 特 徴 は ， 開 花 株 の 葉 に も 同 様 に 認 め ら れ る( F i g . 1 - 1 - 4 )． こ の ほ か ， 出 葉 期 ， 葉 の 光 沢 お よ び 葉 長 ／ 葉 幅 比 な ど 他 の 諸 形 質 に お い て も ， 実 生 苗 と 開 花 株 の 特 徴 は 同 じ で あ っ た( T a b l e 1 - 1 - 3 )． こ れ ら の こ と は L y c o r i s 属 植 物 の 場 合 ， 葉 に 関 す る 諸 形 質 が 植 物 の 齢 に よ っ て 変 わ ら な い こ と を 意 味 す る ．

つ ぎ に ， 正 逆 双 方 の 交 雑 に お い て 得 ら れ た 交 雑 実 生 は ， 生 育 の 極 端 に 劣 る 個 体 を 除 く と 形 態 的 な 個 体 間 差 は ほ と ん ど 認 め ら れ な か っ た ． ま た こ れ ら の 葉 は ， 先 端 の 形 と 葉 幅 が 両 親 種 L . s a n g u i n e a と L . t r a u b i i の 中 間 的 形 質 を 示 し て い た( F i g . 1 - 1 - 3 )． こ れ は F i g . 1 - 1 - 4 に 示 し た L . s p . の 場 合 と 同 様 で あ る ． さ ら に ， 実 生 の 出 葉 期 ， 葉 の 光 沢 ， 葉 先 の 形 お よ び 葉 長 ／ 葉 幅 比 な ど の 形 態 的 特 徴 は ，L . s p . の そ れ と ほ ぼ 同 じ で あ っ た( T a b l e 1 - 1 - 3 )． こ れ ら の こ と は ，L . s p . A お よ

び B が L . s a n g u i n e a と L . t r a u b i i の 交 雑 に よ っ て 生 じ た と す る 著 者

ら の 推 測 を 裏 付 け る も の で あ る ． ４ 交 雑 実 生 の 核 型

L y c o r i s t r a u b i i×L . s a n g u i n e a の 組 合 せ か ら 得 ら れ た 実 生 の 内 訳 は ，

5 V + 1 2 R 型 5 個 体 ，4 V + 1 4 R 型 3 個 体 ，5 V + 1 3 R 型 の 異 数 体 1 個 体 ，

お よ び 4 V + 1 3 R + 1 r 型 で 1 本 の 棒 状 染 色 体 に 欠 失 を 生 じ た も の 2 個 体 で あ っ た( F i g . 1 - 1 - 5 , F i g . 1 - 1 - 6 , T a b l e 1 - 1 - 1 )． こ れ に 対 し て ，L . s a n g u i n e a ×L . t r a u b i i の 組 合 せ か ら は ，2 1 個 体 の 実 生 が 得 ら れ た が ， そ の う ち 染 色 体 を 観 察 し た の は 1 4 個 体 で あ っ た ．こ れ ら の 核 型 と 個

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体 数 は ，5 V + 1 2 R 型 1 1 個 体 ，4 V + 1 4 R 型 1 個 体 ， お よ び 4 V + 1 v + 1 2 R 型 で 1本 の V型 染 色 体 に 欠 失 を 生 じ た も の 2個 体 で あ っ た( F i g . 1 - 1 - 6 , T a b l e 1 - 1 - 1 )．

こ れ ら の こ と か ら ， 得 ら れ た 交 雑 実 生 の 中 に は ， 異 数 体 や 一 部 の 染 色 体 が 欠 失 し て 染 色 体 異 常 を き た し た 個 体 が ，調 査 し た 2 5 個 体 中

5 個 体( 2 0 % )と か な り 高 い 頻 度 で み ら れ る も の の ，こ れ ら は 生 育 が 著

し く 劣 っ て い る こ と か ら 自 然 界 で は 消 滅 し た と 考 え ら れ る ．そ し て ， こ れ ら の 交 雑 か ら 基 本 的 に は L . s p . A お よ び B と 同 様 の 2 種 類 の 核

型( 5 V + 1 2 R 型 お よ び 4 V + 1 4 R 型)が 生 じ る こ と が 実 証 さ れ た ．

５ 両 親 種 の 分 布 と 開 花 期

以 上 述 べ た よ う に ，L . s p . A お よ び B は L . t r a u b i i と L . s a n g u i n e a の 交 雑 後 代 実 生 と 出 葉 期 ， 外 部 形 態 お よ び 核 型 が 一 致 し ， 両 種 の 自 然 交 雑 に よ っ て 成 立 し た と す る 著 者 ら の 仮 説 が 支 持 さ れ た こ と に な る が ， 問 題 は 両 種 の 自 然 開 花 期 が 大 幅 に 異 な る 点 で ， 両 種 の 開 花 期 が い つ ， ど こ で 一 致 し ， ど の よ う な 形 で 自 然 交 雑 が 行 わ れ た の か ， 説 明 が 困 難 で あ る ． そ こ で ， 上 述 し た 実 験 と 併 行 し 九 州 に お け る L .

t r a u b i i と L . s a n g u i n e a の 分 布 ， な ら び に 開 花 期 に つ い て の 調 査 を 進

め た ． そ の 結 果 ， 前 者 は 一 般 に 知 ら れ る よ う に ， 主 に 九 州 の 南 西 海 岸 沿 い ， 特 に 鹿 児 島 県 下 に 多 数 分 布 し ， 開 花 期 は 9 月 中 旬 ～ 下 旬 の 秋 咲 き で あ っ た( F i g . 1 - 1 - 7 )． そ れ に 対 し ， 後 者 は 九 州 の 北 ～ 中 部 の 山 間 部 に は 多 い も の の ， 鹿 児 島 県 下 で は 一 般 に 霧 島 か ら 高 隈 山 系 に 自 生 し ， そ の 開 花 期 は 7 月 中 旬 ～8 月 上 旬 の 夏 咲 き で あ っ た ． し か し な が ら ，F i g . 1 - 1 - 7 に 示 し た よ う に 1 9 8 2 年 に 至 っ て 著 者 ら は 熊 本 県 球 磨 郡 相 良 村( a )お よ び 宮 崎 県 西 臼 杵 郡 高 千 穂 町( b )で ，形 態 的 に は 夏 咲 き の L . s a n g u i n e a と ほ と ん ど 変 わ ら な い ， 秋 咲 性 （9 月 上 旬 ～ 中 旬 咲 き ）L . s a n g u i n e a の 存 在 を 確 認 し た ． さ ら に 調 査 を 進 め る こ と に よ り ， 個 体 数 は 圧 倒 的 に 少 な い も の の ， そ れ は 鹿 児 島 県 下 に も 及 ん で い る こ と が 判 明 し た ． 具 体 的 に は ，1 9 8 3 年 に 鹿 児 島 市

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皆 与 志 町( c )お よ び 川 辺 郡 知 覧 町( d )で ， 翌 1 9 8 4 年 に は 揖 宿 郡 山 川 町

( e )で さ ら に 遅 咲 き の 秋 咲 き 系 統 （9 月 中 旬 ～ 下 旬 咲 き ） が 自 生 も し

く は 民 家 の 庭 先 に 植 栽 さ れ て い る の を 見 出 し た ． 特 に L . s p . A お よ び B が 濃 密 に 分 布 す る 山 川 町 成 川 で 秋 咲 き の L . s a n g u i n e a が 見 出 さ れ ，し か も 成 川 の 近 隣 の 集 落 で は ま っ た く そ れ が 見 出 さ れ な か っ た ．

こ れ ら の こ と は ， 分 布 な ら び に 開 花 期 の い ず れ か ら み て も ， 鹿 児 島 県 の 自 然 条 件 下 で ， 特 に 薩 摩 半 島 最 南 端 の 山 川 町 成 川 一 帯 で 両 種 の 自 然 交 雑 が お こ り ， 新 し い 雑 種 の L y c o r i s が 発 生 し た こ と を 示 唆 す る も の で あ っ た ．

６ 種 の 分 類 に つ い て

小 松 崎( 1 9 6 1 )は L . t r a u b i i の 球 根 に 混 入 し て い た 朱 紅 色 の L y c o r i s を ア ケ ボ ノ シ ョ ウ キ ラ ン と い う 名 で 紹 介 し て い る ． こ の L y c o r i s に つ い て ， 竹 村 （ 私 信 ） は 花 色 ， 花 粉 稔 性 お よ び 核 型 か ら L . s a n g u i n e a と 8 V + 6 R 型 の L . t r a u b i i と の 交 雑 に よ り 生 じ た 雑 種 と 推 測 し ，“L . × r u b r o a u r a n t i a c a K o m a t s u z a k i ”の 学 名 で ， 小 松 崎 氏 と 共 に 新 種 の 発 表 を 行 う 予 定 で あ っ た ． と こ ろ が ， 小 松 崎 氏 の 死 去 に と も な い ， こ の

L y c o r i s は 正 式 に 種 と し て 発 表 さ れ な い ま ま 現 在 に 至 っ て い る ．

一 方 ， 米 国 で は 正 式 に 種 と し て 発 表 さ れ て い な い が ， L .

“c i n n a b a r i n a m” と い う L y c o r i s が 知 ら れ て い る ． こ れ は 前 述 の

L y c o r i s と 同 様 に ， 日 本 か ら 輸 入 し た L . t r a u b i i の 球 根 の 中 に 混 じ っ

て い た も の で ，W i l l i a m s ( 1 9 8 3 )は こ の L y c o r i s に つ い て ，花 色 が 朱 紅 色 で 核 型 が 4 V + 1 4 R 型 で あ り ， 花 粉 稔 性 が 低 い こ と か ら ， 竹 村 と 同 様 に L . s a n g u i n e a と 8 V + 6 R 型 の L . t r a u b i i と の 交 雑 に よ り 生 じ た 雑 種 と 推 測 し て い る が ， 開 花 期 な ど の 違 い か ら 人 為 的 な 交 雑 種 で あ ろ う と 報 告 し て い る ．

こ れ ら の こ と か ら ， ア ケ ボ ノ シ ョ ウ キ ラ ン と L .“c i n n a b a r i n a m” の 両 者 は 朱 紅 色 の 花 色 を も つ 4 V + 1 4 R 型 の L . s p . B と 同 一 と 考 え ら れ る ． ま た ， 前 述 の ‘ オ オ ス ミ ’ と ‘ ベ ニ サ ツ マ ’ は ， そ れ ぞ れ L .

- 13 -

s p . A と B で あ る が ， こ れ ら は L . t r a u b i i の 選 抜 種 と し て つ け ら れ た

品 種 名 で あ り ， こ れ ら に つ い て も 正 式 な 種 と し て の 発 表 は な さ れ て い な い ．

こ れ ら の L y c o r i s が い ず れ も 種 と し て 発 表 さ れ な か っ た 大 き な 理 由 の ひ と つ は ， 繰 り 返 し 述 べ た よ う に ，L . s a n g u i n e a と L . t r a u b i i の 開 花 期 が 大 幅 に 異 な り ， 自 然 交 雑 の 可 能 性 が 低 い と 考 え ら れ て い た こ と に 起 因 す る ． し か し な が ら ， 前 述 の よ う に 鹿 児 島 県 下 で 両 種 の 自 然 交 雑 の 可 能 性 が 極 め て 高 い こ と が 示 唆 さ れ ， し か も ， 両 種 の 人 為 的 な 交 雑 か ら 得 ら れ た 実 生 は ，L . s p . A お よ び B と 核 型 が 一 致 し ， 形 態 的 に も 類 似 す る も の で あ っ た ． 以 上 の 結 果 か ら 判 断 す る と ，L . s p . は 秋 咲 き の L . s a n g u i n e a と 9 V + 4 R 型 の L . t r a u b i i と の 自 然 交 雑 に よ り ， 鹿 児 島 県 下 で 誕 生 し た と 考 え る の が 最 も 妥 当 で あ ろ う ．

こ れ ら の 結 果 か ら ，現 在 こ の 新 し い 系 統 の L y c o r i s は L . s a n g u i n e a と L . t r a u b i i と の 自 然 交 雑 に よ る 雑 種 起 源 の 種 ，L . ×r u b r o a u r a n t i a c a と し て 栗 田 は 自 身 の ホ ー ム ペ ー ジ （ ヒ ガ ン バ ナ 属 の 分 類 ： h t t p : / / w w w 5 e . b i g l o b e . n e . j p / ~ l y c o r i s / t a x o n o m y - 3 . h t m l） で 整 理 し ， 秋 咲 き 性 の L . s a n g u i n e a に つ い て も 秋 咲 き 性 の 分 類 群( t a x o n )を 与 え ， 本 研 究 の 結 果 が 周 知 さ れ る に 至 っ て い る ．

本 章 で は ， 地 域 植 物 資 源 と し て ヒ ガ ン バ ナ 属 植 物 を 例 に 鹿 児 島 県 下 で 発 見 さ れ た L y c o r i s 属 新 種 の 成 立 解 明 を 中 心 に 論 じ た ． 一 般 に 知 ら れ て い る ヒ ガ ン バ ナ (L . r a d i a t a H e r b . ) は 3 倍 体 で ， ほ と ん ど 結 実 す る こ と な く 分 球 に よ り 旺 盛 に 増 殖 す る こ と か ら ， 中 国 大 陸 か ら 渡 来 し ， 救 荒 作 物 と し て 人 の 手 に よ り 分 布 を 拡 大 し た も の と 推 察 さ れ る ． そ れ に 対 し て 種 子 で も 繁 殖 す る L . s a n g u i n e a は 全 国 の 山 野 に ，L . t r a u b i i は 南 西 諸 島 か ら 九 州 の 沿 岸 部 に 日 本 の 固 有 種 と し て 分 布 し て お り ，L . s p . A お よ び B は 両 親 種 の 分 布 の 接 点 で 誕 生 し た ． 鹿 児 島 県 内 の こ れ ら ヒ ガ ン バ ナ 属 植 物 を 収 集 し た 故 大 野 一 矢 氏 の 意

- 14 -

志 を 継 ぎ ， 鹿 児 島 県 南 大 隅 町 根 占 の 南 大 隅 農 園 で は ， こ こ で 取 り 上 げ た 2 種 の ヒ ガ ン バ ナ を 含 め て ， ヒ ガ ン バ ナ 属 植 物 の 球 根 生 産 が 行 わ れ て い る ． ま た ， 同 農 園 で は 結 実 し た 種 子 か ら 実 生 を 育 成 し ， 得 ら れ た 個 体 を 選 抜 し て 新 た な 品 種 と し て 生 産 販 売 が 行 わ れ て お り ， 多 数 の 種 苗 会 社 の カ タ ロ グ に よ り 全 国 に 販 売 さ れ て い る ． こ の よ う に ヒ ガ ン バ ナ 属 植 物 は 地 域 植 物 資 源 と し て 活 用 さ れ ， 地 域 興 し の 素 材 と し て 利 用 さ れ る に 至 っ て い る ．

- 15 - 要 約

地 域 植 物 資 源 に は 植 物 本 来 の 分 布 拡 大 や ， 人 の 手 に よ り も た ら さ れ ， 在 来 種 と し て 定 着 し た も の な ど 数 多 く 含 ま れ て い る ． 全 国 各 地 の 畦 畔 や 墓 地 に 分 布 す る ヒ ガ ン バ ナ は ， 食 用 ， 薬 用 と し て 渡 来 し ， 救 荒 作 物 と し て 広 が っ た も の と さ れ て い る ． 本 論 で は ， 地 域 植 物 資 源 の 中 か ら ヒ ガ ン バ ナ を 例 に そ の 探 索 と 活 用 に つ い て 論 じ た ．

鹿 児 島 県 下 で 発 見 さ れ た 2 種 類 の ヒ ガ ン バ ナ 属 植 物 に つ い て ， 形 態 的 な 諸 特 性 や 染 色 体 の 核 型 分 析 か ら シ ョ ウ キ ズ イ セ ン (L y c o r i s t r a u b i i) と キ ツ ネ ノ カ ミ ソ リ (L . s a n g u i n e a) の 交 雑 種 と 推 定 し ， そ の 両 親 種 と 考 え ら れ る 2 種 の 種 間 交 雑 ， 雑 種 実 生 の 形 態 ， 染 色 体 分 析 ，両 親 種 の 分 布 お よ び 開 花 期 の 調 査 を 行 っ た ．そ の 結 果 ，L . t r a u b i i

×L . s a n g u i n e a お よ び L . s a n g u i n e a ×L . t r a u b i i の 正 逆 双 方 の 交 雑 か ら 得 ら れ た 種 間 交 雑 実 生 の 形 態 は 両 親 種 の 中 間 型 を 示 し ，L . s p . A お よ び B と 一 致 し て い た ． ま た ， 交 雑 実 生 の 染 色 体 数 な ら び に 核 型 は ，L . s p . A お よ び B と そ れ ぞ れ 一 致 す る 5 V＋1 2 R 型 と 4 V＋1 4 R 型 で あ っ た ．さ ら に ，L . s a n g u i n e a お よ び L . t r a u b i i の 分 布 な ら び に 開 花 期 の 調 査 か ら ，秋 咲 き 性 の L . s a n g u i n e aの 存 在 を 確 認 し ，特 に L . s p . A お よ び B が 濃 密 に 分 布 す る 鹿 児 島 県 山 川 町 成 川 で ， 開 花 期 が 安 全 に 一 致 す る L . s a n g u i n e a と L . t r a u b i i が 同 所 的 に 分 布 す る こ と を 確 認 し た ． こ れ ら の 結 果 か ら ， 鹿 児 島 県 下 で 発 見 さ れ た 2 種 類 の ヒ ガ ン バ ナ 属 植 物 は ， シ ョ ウ キ ズ イ セ ン と 秋 咲 き キ ツ ネ ノ カ ミ ソ リ の 自 然 交 雑 に よ り 鹿 児 島 県 下 で 発 生 し た こ と を 証 明 し た ．

現 在 ， 以 上 の 結 果 を 基 に ， こ れ ら の ヒ ガ ン バ ナ 属 植 物 は 雑 種 起 源 の 種 と し て 分 類 さ れ ， 鹿 児 島 県 南 大 隅 町 で 球 根 生 産 が 行 わ れ て い る ． ま た ， 同 農 園 で 得 ら れ た 実 生 か ら 選 抜 し た 新 た な 品 種 も 含 め て ， 種 苗 会 社 の カ タ ロ グ に よ り 全 国 に 販 売 さ れ ， 地 域 植 物 資 源 が 地 域 興 し の 素 材 と し て 利 用 さ れ る に 至 っ て い る ．

- 16 -

A B C

D E

F G

F i g . 1 - 1 - 1 C h a r a c t e r i s t i c s o f L y c o r i s s p e c i e s i n K a g o s h i m a , J a p a n . A ; L . r a d i a t a ( 2n= 3 3 ) , B ; L . a l b i f l o r a ( 2n= 1 7 ) , C ; L . s q u a m i g e r a ( 2n= 2 7 ) , D ; L . t r a u b i i ( 2n= 1 3 ) , E ; L . s a n g u i n e a ( 2 n= 2 2 ) , F ; L. s p . A ( 2 n= 1 7 ) , G ; L. s p . B ( 2 n= 1 8 )

- 17 -

F i g . 1 - 1 - 2 S e r i a l a r r a n g e m e n t o f t h e s o m a t i c c h r o m o s o m e s a t m e t a p h a s e o f L y c o r i s s p e c i e s .

A; L . s a n g u i n e a ( a u t u m n f l o w e r i n g t y p e . 2n= 2 2 = 2 2 R ) . B ; L . t r a u b i i ( 2n= 1 3 = 9 V + 4 R ) , C ; L. s p . A ( 2n= 1 7 = 5 V + 1 2 R ) , D ; L. s p . B ( 2n= 1 8 = 4 V + 1 4 R )

- 18 -

F i g . 1 - 1 - 3 C o m p a r i s o n o f l e a f s h a p e s a m o n g s e e d l i n g s o f L . t r a u b i i , L . s a n g u i n e a a n d t h e i r i n t e r - s p e c i f i c h y b r i d s .

A ; L . t r a u b i i ( 2n= 1 3 ) , B ; L . s a n g u i n e a ( 2n= 2 2 ) , C ; L . t r a u b i i × L . s a n g u i n e a ( 2n= 1 7 ) , D ; L . t r a u b i i × L . s a n g u i n e a ( 2n= 1 8 ) , E ; L . s a n g u i n e a × L . t r a u b i i ( 2n= 1 7 ) , F ; L . s a n g u i n e a × L . t r a u b i i ( 2n= 1 8 ) .

- 19 -

F i g . 1 - 1 - 4 C o m p a r i s o n o f l e a f s h a p e s a m o n g t h e f l o w e r i n g - s i z e p l a n t s o f L . t r a u b i i , L . s a n g u i n e a a n d L. s p . A a n d B .

A ; L . t r a u b i i, B ; L . s a n g u i n e a , C ; L . s p . A , D ; L . s p . B .

- 20 -

F i g . 1 - 1 - 5 P h o t o m i c r o g r a p h o f t h e s o m a t i c c h r o m o s o m e s i n r o o t t i p c e l l o f i n t e r - s p e c i p f i c h y b r i d s (L . t r a u b i i× L . s a n g u i n e a ) .

A - 1 , 2 ; 2n= 1 8 = 4 V + 1 4 R , B - 1 , 2 ; 2n= 1 8 = 4 V + 1 3 R + 1 r . A r r o w i n d i c a t e s v e r y s m a l l r o d - s h a p e d c h r o m o s o m e .

- 21 -

F i g . 1 - 1 - 6 S e r i a l a r r a n g e m e n t o f t h e s o m a t i c c h r o m o s o m e s a t

m e t a p h a s e o f h y b r i d s b e t w e e n L . s a n g u i n e a a n d L . t r a u b i i .

A - D ; L . t r a u b i i× L . s a n g u i n e a , E - G ; L . s a n g u i n e a × L . t r a u b i i . A ; 2n= 1 7 = 5 V + 1 2 R , B ; 2n= 1 8 = 4 V + 1 4 R , C ; 2n= 1 8 = 5 V + 1 3 R , D ; 2n= 1 8 = 4 V + 1 3 R + 1 r , E ; 2n= 1 7 = 5 V + 1 2 R , F ; 2n= 1 8 = 4 V + 1 4 R , G ; 2n= 1 7 = 4 V + 1 v + 1 2 R .

- 22 -

F i g . 1 - 1 - 7 G e o g r a p h i c a l d i s t r i b u t i o n o f L . s a n g u i n e a a n d L . t r a u b i i o n t h e i s l a n d o f K y u s h u .

; L . s a n g u i n e a ( s u m m e r f l o w e r i n g t y p e ) , ; L . s a n g u i n e a ( a u t u m n f l o w e r i n g t y p e ) , ◎; L . t r a u b i i .

a ; S a g a r a v i l l a g e i n K u m a m o t o p r e f e c t u r e , b ; T a k a c h i h o t o w n i n M i y a z a k i p r e f e c t u r e , c ; K a g o s h i m a c i t y i n K a g o s h i m a p r e f e c t u r e , d ; C h i r a n t o w n i n K a g o s h i m a p r e f e c t u r e , e ; Y a m a g a w a t o w n i n K a g o s h i m a p r e f e c t u r e .

- 23 -

Species and hybrids 2n Karyotype

No. of seedlings examined

L. sanguinea 22 22R^z -

L. traubii 13 9V^y + 4R -

L. sp. A 17 5V + 12R -

L. sp. B 18 4V + 14R -

17 5V + 12R 5

18 4V + 14R 3

18 5V + 13R 1

18 4V + 13R + r^x 2

17 5V + 12R 11

18 4V + 14R 1

18 4V + v^w + 12R 2 L. traubii ×

　L. sanguinea

L. sanguinea×

z R = rod shaped (telocentric and acrocentric) chromosome,

y V = metacentric and submetacentric chromosome,

x r = very small rod-shaped chromosome,

z v = metacentric chromosome partially deleted.

Table 1-1-1. Chromosome number and karyotype of Lycoris.

- 24 -

Conbination No. of pollinated

flowers

No. of fructified flowers (%)

No. of seeds obtained

No. of hybrid seedlings germinated

L. traubiiself (2n=13) 16 12 (75.0) 78 -

L. sanguinea self (2n=22) 9 8 (88.9) 26 -

L. traubii × L. sanguinea 150 11 ( 7.3) 11 11

L. sanguinea × L. traubii 93 28 (30.1) 28 21

Table 1-1-2. Result obtained by intra- and inter-specific hybridization.

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A: (2n=17) B: (2n=18) Leaf:

Emergence early-mid. Oct. early-mid. Jan. mid. Oct. mid. Oct. mid. Oct. mid. Oct.

Texture of surface glossy glaucous glaucous glaucous glaucous glaucous

Shape of apex acute obtuse attenuate attenuate attenuate attenuate

Length/ width ratio:

seedlings^z 18.1±3.1 21.9 - - 28.1±1.4 30.8±2.7

flowering-size plant 18.6±2.1 21.4±3.5 31.1±1.8 28.4±1.7 - -

Flowers:

Colour of perianth saffron yellow vermilion straw-coloured vermilion - -

(R.H.S.C.C.)^y (21-C) (41-A) (14-C) (41-B) - -

z three-years old,

y The Royal Horticultural Society Color Chart.

Table 1-1-3. Comparison of the morphological characteristics among Lycoris species and their F₁ hybrids.

Characters L. traubii L. sanguinea (autumnal)

L. sp. L. traubii× L. sanguinea

L. sanguinea× L. traubii

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第 ２ 章 種 苗 増 殖 に お け る 組 織 培 養 法 の 改 良 と バ イ テ ク 育 種 へ の 応 用

栄 養 繁 殖 性 作 物 で は ウ イ ル ス フ リ ー 化 や 優 良 系 統 の 種 苗 供 給 を 目 的 と し て ， 茎 頂 培 養 に よ る 増 殖 が 行 わ れ て お り ， 組 織 培 養 関 連 産 業 に お い て 増 殖 の 効 率 や 安 定 化 は 種 苗 生 産 コ ス ト に 直 接 結 び つ く 重 要 な 課 題 で あ る （ 大 澤 , 1 9 9 4） ． ま た ， 遺 伝 子 組 み 換 え や 変 異 誘 発 等 バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー を 用 い た 研 究 開 発 や 品 種 育 成 に お い て も ， 組 織 培 養 の 効 率 化 や 安 定 化 は 成 功 に 導 く 重 要 な 課 題 と い え る ．と こ ろ が ， 組 織 培 養 に お い て 再 生 植 物 が 培 養 容 器 中 で 水 分 過 多 と な り 水 浸 状 化 を 呈 す る 場 合 が 数 多 く 認 め ら れ ， そ の 多 く は 正 常 な 生 育 を 示 さ ず 順 化 が 困 難 で ， 培 養 効 率 の 低 下 に つ な が っ て い る ． ま た ， 栄 養 系 の ク ロ ー ン 増 殖 を 行 う 上 で ， 変 異 や キ メ ラ の 発 生 は 生 産 す る 種 苗 の 品 質 に 関 わ る こ と か ら ，安 定 し た 培 養 系 の 作 出 が 必 要 で あ る ．本 章 で は ， 栄 養 繁 殖 作 物 を 対 象 と し て ， 非 病 原 性 の 細 菌 を 用 い た 水 浸 状 化 回 避 に よ る 組 織 培 養 法 の 改 善 と 育 種 へ の 応 用 ， な ら び に キ メ ラ 発 生 回 避 に つ い て 論 じ た ．

現 在 ， バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー は 遺 伝 子 ・ タ ン パ ク 質 ・ 酵 素 レ ベ ル へ と 深 化 ・ 融 合 し ， 医 学 ・ 薬 学 ・ 工 学 と い っ た 様 々 な 分 野 で 応 用 が 図 ら れ て い る ． 農 学 分 野 に お い て も 機 能 解 析 や 遺 伝 子 診 断 等 へ の 応 用 が 図 ら れ ， 環 境 や 育 種 部 門 で の 実 用 化 や 生 産 現 場 で の 活 用 が 行 わ れ て い る ． こ の よ う な 実 用 化 や 活 用 を 図 る 上 で ， 組 織 培 養 の 効 率 化 や 安 定 化 は そ の 基 盤 と な る ．

本 章 で は ， ま ず ， 多 糖 類 産 生 の 非 病 原 性 細 菌 を 利 用 し た 組 織 培 養 の 効 率 化 と 安 定 化 を 目 的 と し て ，A T C C（T h e A m e r i c a n Ty p e C u l t u r e

C o l l e c t i o n）か ら 複 数 の 菌 種 を 選 択 し ，水 浸 状 化 回 避 機 能 を 検 証 し た ．

次 に ， 接 種 し た 細 菌 の 植 物 体 内 に お け る 定 着 性 と 持 続 性 に つ い て ， 植 物 体 内 の 残 存 性 に よ る 確 認 と 水 浸 状 化 回 避 機 能 を 指 標 に 検 証 を 行 っ た ． さ ら に ， 宿 主 範 囲 の 汎 用 性 と し て ， 科 の 異 な る 植 物 種 を 用 い

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て そ の 機 能 を 検 証 し ， 植 物 組 織 培 養 産 業 で の 実 用 性 を 検 討 し た ． 一 方 ， 多 糖 類 産 生 の 非 病 原 性 細 菌 と い う 点 で 共 通 す る ，A g r o b a c t e r i u m を 用 い た 遺 伝 子 組 み 換 え の 栄 養 繁 殖 性 木 本 植 物 へ の 適 用 を 通 し て 育 種 場 面 で の 活 用 に つ い て 併 せ て 検 討 し た ．

第 １ 節 多 糖 類 産 生 土 壌 細 菌 に よ る オ レ ガ ノ 組 織 培 養 に お け る 水 浸 状 化 制 御 法

水 浸 状 化 （ ヴ ィ ト リ フ ィ ケ ー シ ョ ン ） は ， 組 織 培 養 に よ る 植 物 の ク ロ ー ン 増 殖 を 行 う 際 の 生 理 的 な 障 害 と な っ て い る ( D e b e r g h ら, 1 9 9 2 ; H a k k a r r t ･ Ve r s l u i j s 1 9 8 3 ; K e v e r s ら, 1 9 8 4 ) . 水 浸 状 化 し た 植 物 は ， 膨 張 し 肉 厚 と な り ， 半 透 明 で 脆 く な り や す い 特 徴 が あ る ．

K e v e r s ら ( 1 9 8 4 ) は ， こ の 生 理 的 な 異 常 が ， 植 物 体 内 の 水 分 過 剰 に

起 因 し ， 組 織 の 葉 緑 素 欠 乏 や 木 質 化 の 低 下 を 引 き 起 こ す と 報 告 し て い る ． こ の よ う に 組 織 培 養 中 の 水 浸 状 化 は , 培 養 植 物 の 順 化 や 生 育 の 障 害 と な る こ と か ら ， 再 生 効 率 低 下 の 原 因 と 言 わ れ る ( B o t t c h e r ら, 1 9 8 8 ; P h a n ･ L e To u z e , 1 9 8 3 ; S a t o ら, 1 9 9 3 ; S h e t t y ら, 1 9 9 5 ; Z i m m e r m a n ･ C o b b , 1 9 8 9 ) . 組 織 培 養 中 の 水 浸 状 化 を 回 避 し ，ク ロ ー ン 増 殖 に お け る 効 率 や 品 質 を 向 上 さ せ る 方 策 と し て ， 培 地 中 の 糖 質 濃 度 の 増 加 ( R u g i n i , 1 9 8 6 ; Z i m m e r m a n ･ C o b b , 1 9 8 9 )， 培 養 中 の 照 度 変 更 ( S u t t e r ･ L a n g h a n s , 1 9 7 9 )，ゲ ル 化 剤 濃 度 の 改 変 ( B o r n m a n ･ Vo g e l m a n n , 1 9 8 4 ; D e b e r g h ら, 1 9 8 1 ; Z i m m e r m a n ･ C o b b , 1 9 8 9 )， 培 養 湿 度 の 低 減 ( B o t t c h e r ら, 1 9 8 8 )， お よ び B a c t o P e p t o n e や そ の 分 子 量 別 の 添 加 ( S a t o ら, 1 9 9 3 )に よ り 改 善 が 検 討 さ れ た が , そ の 効 果 は 限 定 的 で 有 効 な 対 策 に は 至 ら な か っ た ．

S h e t t y ら ( 1 9 9 5 ; 1 9 9 6 a , b ) は ， オ レ ガ ノ(O r i g a n u m v u l g a r e)の 試 験 管 内 培 養 か ら 水 浸 状 化 を 回 避 す る 多 糖 類 産 生 の 特 異 的 な 細 菌 (P s e u d o m o n a s s p . ) を 単 離 し た ． こ の P s e u d o m o n a s s p . を 接 種 す る こ

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と に よ り ， 組 織 培 養 に よ り 栄 養 系 で 増 殖 し ， ク ロ ー ン 化 し た 複 数 系 統 の オ レ ガ ノ に 対 し て ，1 0～1 5 日 後 に は 水 浸 状 化 を 回 避 す る こ と が 可 能 で ， 接 種 後 の 植 物 体 は ， 水 浸 状 化 し た 植 物 体 と 比 較 し て ， 水 分 含 量 が 低 下 し ， 葉 緑 素 お よ び ポ リ フ ェ ノ ー ル 含 量 が 増 加 し て 正 常 な 生 育 を 示 し た ． そ し て ， こ の P s e u d o m o n a s s p . -接 種 法 に よ る 水 浸 状 化 の 回 避 率 は 9 0 %以 上 と な り ， オ レ ガ ノ の 複 数 系 統 で そ の 効 果 を 確 認 で き た ． こ の 手 法 を 用 い る こ と で ， 栄 養 繁 殖 作 物 の 優 良 系 統 を 効 率 よ く 大 量 に 増 殖 す る こ と が 可 能 と な り ， ク ロ ー ン 増 殖 植 物 の 順 化 効 率 や そ の 後 の 生 育 向 上 に 有 効 で あ る と 考 え ら れ た ．

こ の よ う に ， こ の P s e u d o m o n a s s p . と オ レ ガ ノ の 特 定 系 統 を 用 い て ， 植 物 と 根 圏 微 生 物 （ 細 菌 類 ） の 水 浸 状 回 避 効 果 が 検 証 さ れ た ( S h e t t y ら, 1 9 9 5 ; 1 9 9 6 a , b )． そ こ で ， 本 試 験 で は ， ア メ リ カ の ジ ー ン バ ン ク か ら 多 糖 類 産 生 の 非 病 原 細 菌 を 入 手 し ， こ れ ま で の 報 告 に 基 づ い て 水 浸 状 化 の 回 避 効 果 を 比 較 す る こ と に よ り ， 菌 種 の 選 定 と 水 浸 状 化 の 回 避 効 果 を 検 証 し た ．

材 料 お よ び 方 法 １ 供 試 し た 細 菌 系 統

本 試 験 で 供 試 す る た め ， 以 下 の 細 菌 系 統 を ア メ リ カ ジ ー ン バ ン ク

（AT C C : T h e A m e r i c a n Ty p e C u l t u r e C o l l e c t i o n , R o c k v i l l e , M d .） か ら 入 手 し た ． こ れ ら の 系 統 は い ず れ も 土 壌 か ら 単 離 さ れ た 菌 体 外 に 多 糖 類 を 産 生 す る 細 菌 類 で あ る ．

・P s e u d o m o n a s m u c i d o l e n s AT C C 4 6 8 5 ,

・P s e u d o m o n a s s p . s t r a i n AT C C 3 1 4 6 1 ,

・P s e u d o m o n a s s t u t z e r i AT C C 3 1 2 5 8 ,

・B e i j e r i n c k i a i n d i c a AT C C 2 1 4 2 3 .

上 記 4 系 統 に オ レ ガ ノ の 水 浸 状 化 回 避 能 力 を 示 す P s e u d o m o n a s s p . s t r a i n F ( S h e t t y ら, 1 9 9 5 ) を 対 照 と し て 加 え ， 実 験 に 供 し た ． ま た ，

B . i n d i c a は 複 合 多 糖 類 を 産 生 す る 植 物 共 生 性 の 土 壌 細 菌 で あ る ．

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こ れ ら P s e u d o m o n a s 属 菌 種 は ， 菌 体 の 消 失 を 避 け る た め ， N A ( n u t r i e n t a g a r ; S i g m a C h e m i c a l , S t . L o u i s , M o . ) 培 地 も し く は Y M A ( y e a s t e x t r a c t - m a n n i t o l a g a r ; G o l d s ら, 1 9 9 0 ) 培 地 で ， B . i n d i c a は

Y M A 培 地 で 2 5℃ ，4 8～6 0 時 間 培 養 後 ，5℃ で 冷 蔵 保 存 し た ．

２ オ レ ガ ノ の 組 織 培 養 と 菌 の 接 種

本 試 験 で は ， 以 前 の 試 験 ( S h e t t y ら, 1 9 9 5 ) か ら 得 ら れ た オ レ ガ ノ の 培 養 系 統 O - 1 を 用 い て ， 種 々 の 細 菌 類 の 効 果 を 比 較 し た ． 培 養 植 物 は ，1 m g･L^{- 1} B A P ( 6 - b e n z y l a m i n o p u r i n e )，3 % シ ョ 糖, 0 . 3 % ジ ェ ラ ン ガ ム ( S i g m a C h e m i c a l , S t . L o u i s , M o . ) を 含 む M S 培 地 ( M u r a s h i g e ･ S k o o g 1 9 6 2 ) で 継 代 培 養 を 行 っ た ． 培 地 は p H 5 . 8 に 調 整 後 ，1 2 1℃ ， 1 5 分 間 で 加 圧 滅 菌 し た ． 植 物 体 を 置 床 し た シ ャ ー レ は 2 0℃ 連 続 光 下 ( 4 0 µ m o l･m^{- 2}･s^{- 1}) で 培 養 し た ．

オ レ ガ ノ O - 1 系 統 は ，3 0 日 間 隔 で 分 枝 し た シ ュ ー ト を 切 り 分 け ， 継 代 培 養 す る こ と に よ り 増 殖 と 維 持 を 行 っ た ． 継 代 培 養 の 3 0 日 後 ， オ レ ガ ノ O - 1 系 統 の 分 枝 し た 茎 頂 部 を 含 む シ ュ ー ト を 切 り 取 り ， 前 述 の 5℃ で 保 存 し て い た 種 々 の バ ク テ リ ア の 菌 体 コ ロ ニ ー に 切 断 し た 基 部 を 接 触 さ せ ， 菌 の 接 種 を 行 っ た ． 接 種 し た シ ュ ー ト は ，1 . 5 % の シ ョ 糖 を 含 ん だ 1 / 2 濃 度 の M S 培 地 に 置 床 し た ． 各 処 理 は 1 シ ャ ー レ あ た り 7 つ の シ ュ ー ト を 置 床 し ，4 反 復 で 行 っ た ． そ し て ，3 0 日 間 培 養 後 に ， 水 浸 状 化 に 関 連 す る 生 理 的 な 要 素 と し て ， ポ リ フ ェ ノ ー ル ， 葉 緑 素 ， 水 分 の 含 量 お よ び 植 物 体 の 生 育 量 を 比 較 し た ． ３ 水 浸 状 化 関 連 の 生 理 的 指 標

水 浸 状 化 し た 培 養 植 物 体 お よ び 細 菌 接 種 法 に よ り 水 浸 状 化 を 回 避 し た 培 養 植 物 体 に つ い て ， ポ リ フ ェ ノ ー ル 含 量 ， 葉 緑 素 含 量 ， 水 分 含 量 お よ び 新 鮮 重 を 測 定 し た ．

a . ポ リ フ ェ ノ ー ル 含 量

ポ リ フ ェ ノ ー ル 含 量 は ，C h a n d l e r ･ D o d d s ( 1 9 8 3 ) の 方 法 に よ り 計 測 し た ．新 鮮 重 約 5 0 m g の 培 養 植 物 体 を 2 . 5 m l の 9 5 % エ タ ノ ー ル

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に 浸 漬 し ， - 2 0℃ で 4 8 時 間 保 存 後 ， 各 サ ン プ ル を T i s s u e Te a r o r ( B i o s p e c . P r o d u c t s , R a c i n e , Wi s . ) で 細 断 し ，1 3 , 0 0 0 g で 8 分 間 の 遠 心 分 離 を 行 っ た ．そ の 上 澄 み 1 m l を 試 験 管 ( 1 6 × 1 0 0 m m ) に と り ，

1 m l の 9 5 % エ タ ノ ー ル と 5 m l の 蒸 留 水 を 添 加 し て 攪 拌 し ，各 試 験

管 に 0 . 5 m l の 5 0 % フ ォ リ ン 試 薬 ( F o l i n - C i o c a l t e u r e a g e n t ) を 加 え 静 置 し た ．5 分 後 ，1 m l の 5 % N a₂C O₃ を 添 加 し ，十 分 に 攪 拌 し た 後 ， 6 0 分 間 静 置 し た ． そ の 混 合 液 を 9 5 % エ タ ノ ー ル を ブ ラ ン ク と し て 分 光 高 度 計 ( G e n e s y s s p e c t r o p h o t o m e t e r : S p e c t r o n i c , I n c . , R o c h e s t e r,

N . Y. ) を 用 い て ， 7 2 5 n m に お け る 吸 光 度 を 測 定 し た ． 検 量 線 は ，測

定 時 毎 に 9 5 % エ タ ノ ー ル に 溶 解 し た 様 々 な 濃 度 の g a l l i c a c i d の 吸 光 度 か ら 新 鮮 重 あ た り の ポ リ フ ェ ノ ー ル 含 量 ( m g / g f r e s h w e i g h t ) を 算 出 し ， 乾 物 あ た り の 含 量 に つ い て も あ わ せ て 算 出 し た ．

b . 葉 緑 素 含 量

総 葉 緑 素 含 量 は ，H i p k i n s ･ B a k e r ( 1 9 8 6 )に よ る 分 光 光 度 法 に よ り 測 定 し た ． 培 養 植 物 か ら 新 鮮 重 約 5 0 m g の 葉 切 片 を 5 - m l サ ン プ ル 管 に と り ， 3 m l の 1 0 0 % メ タ ノ ー ル を 加 え ， 蒸 散 を 防 止 す る た め ラ ッ プ で カ バ ー し て 室 温 暗 黒 下 で 2 時 間 抽 出 し た ． 各 サ ン プ ル は 攪 拌 後 ， メ タ ノ ー ル 抽 出 液 の 吸 光 度 ( 6 5 0 n m , 6 6 5 n m ) を 測 定 し た ． 総 葉 緑 素 量 は ， 以 下 の 式 で 示 す よ う に メ タ ノ ー ル 1 m l あ た り の 重 量 で 算 出 し た ．

総 葉 緑 素 ＝ 2 5 . 8 × A_{6 5 0} + 4 . 0 × A_{6 6 5} ( g ･ m l^{- 1})

さ ら に ， 葉 緑 素 含 量 は ， 以 下 の 式 で 示 す よ う に ， 各 外 植 片 の 新 鮮

重 1 g あ た り の 量 に 換 算 し た ．

葉 緑 素 含 量 ＝ [ ( 葉 緑 素 g ･ メ タ ノ ー ル m l^{- 1}) × メ タ ノ ー ル 3 m l ] ･ ( 生 重 g^{- 1}) . c . 水 分 含 量 と 植 物 体 の 生 育

水 分 含 量 は ， 重 量 測 定 済 み の 乾 燥 容 器 に ， 新 鮮 重 1 5 0 m g の 培 養 植 物 を と り ，1 0 5℃ で 2 時 間 乾 燥 後 ， デ シ ケ ー タ ー 中 で 3 0 分 間 冷 却 し ， 乾 物 重 を 測 定 し た ． さ ら に ，1 . 5 時 間 後 の 乾 燥 容 器 の 重 量 に 変

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化 の な い こ と を 確 認 し た ． そ し て ， 以 下 の 式 に よ り 新 鮮 重 1 0 0 m g あ た り の 水 分 量 と し て 算 出 し た ．

水 分 含 量 ＝ [ ( 生 重 － 乾 物 重 ) ・ ( 生 重 )^{- 1}] ) × 1 0 0 ( m g )

植 物 体 の 生 育 は ， 反 復 毎 に 総 生 体 重 を 個 体 数 で 割 り ，1 個 体 あ た り の 重 量 で 示 し た ．

d . 順 化 に と も な う 評 価

以 下 の 手 順 で 培 養 植 物 の 順 化 能 力 を 検 定 し た ．

細 菌 接 種 の 3 0 日 後 ，水 浸 状 化 し た も の お よ び 細 菌 接 種 法 に よ り 水 浸 状 化 を 回 避 し た シ ュ ー ト に つ い て ， ホ ル モ ン フ リ ー の 1 / 2 濃 度 の M S 培 地 に 移 植 し ， 発 根 さ せ た ．3 0 日 後 ， 発 根 し た 植 物 体 は バ ー ミ キ ュ ラ イ ト に 移 植 し ， 高 湿 度 ( 1 0 0 % ) 状 態 を 維 持 す る た め 透 明 プ ラ ス チ ッ ク で 覆 っ た ．5 日 後 ， 穴 の 開 い た プ ラ ス チ ッ ク ・ カ バ ー と 取 り 替 え ， さ ら に 2 日 間 被 覆 し た 後 ， カ バ ー を 完 全 に 取 り 除 い た ． そ の 後 ， 植 物 体 は 2 5℃ ， 湿 度 8 0 %で 1 6 時 間 日 長 下 の 温 室 に 類 似 し た 室 内 環 境 に 置 い た ．

順 化 は 各 処 理 ご と に 7～1 5 個 体 を 供 試 し ， 各 シ ュ ー ト の 水 浸 状 化 数 を 目 視 に よ り 確 認 す る と と も に ， 順 化 の 1 週 も し く は 3 週 間 後 ， 湿 度 環 境 の 変 化 に お い て 生 存 し て い る 個 体 数 を 計 測 し た ． 加 え て ， 各 植 物 体 の 生 育 量 を 5 段 階 (枯 死 ，停 滞 ，生 育 小 ，中 ，大 ：- , ± , + , + + ,

+ + + ) で 評 価 し た ．

結 果 お よ び 考 察

細 菌 接 種 法 に よ り 細 菌 を 接 種 後 の 植 物 体 の 状 態 は ， 葉 が 暗 緑 色 で 不 透 明 に な り ， 剛 性 が あ る の に 対 し て ， 無 処 理 区 で は ， 脆 く ， 徒 長 し ， ガ ラ ス 質 で 淡 緑 色 で あ り ， 無 処 理 区 の 葉 緑 素 含 量 は ， K e v e r s ら, ( 1 9 8 4 ) お よ び S h e t t y ら ( 1 9 9 5 )が 報 告 し た 6 0 0～7 0 0 g･g^{- 1} の 水 浸 状 化 を 示 す 低 葉 緑 素 レ ベ ル と 同 程 度 で あ っ た ( Ta b l e 2 - 1 - 1 )． ま た ， 全 て の 細 菌 接 種 処 理 区 で ， 植 物 組 織 中 の 水 分 含 量 は 無 処 理 区 よ り 低 下 し た ( Ta b l e 2 - 1 - 1 )．P. m u c i d o l e n s と P. s p . s t r a i n AT C C 3 1 4 6 1 接