博 士 （ 農 学 ） Khin Thidar
学 位論 文題 名
Studies on genetic recombination ● ●
1nWldehybridiZationofriCe
（イネ の遠 縁交 雑における遺伝的組換えに関する研究）
学位論文内容の要旨
作物の育種倣、遺伝的組換えを促進し多数の組換え個体の中から目的に合った遺伝 子組み合わせをもつ個体を選抜することである。したがって、選抜技術が育種の中核 となってきたが、遺伝的組換えは交配相手とは無関係に無作為に起こることを前提と してきた。ところが、この前提となる組換え頻度の遺伝制御については詳細な比較解 析がなされていないのが現状であった。最近、分子マーカーを利用して野生種から有 用遺伝子を利用しようとする試みが活発に行われているが、交雑相手によって組換え 頻度が大きく変動する可能性が示唆されている。本研究はイネの遠縁交雑における組 換え頻度を比較するために、類縁程度の異なる系統間雑種を作成し、第6染色体上に 座上する遺伝子の連鎖関係を調査するとともに、wx座については座内とその周辺領域 の 組 換 え 頻度 を調 査し た。 得ら れた 結果 を要 約する と、 次の ごと くで ある 。 1）遺伝的組換えの生物学的意義は、進化的にみると、集団内に大きな変異を保有し、
かつ環境の変化に応じて新しい遺伝子組み合わせをもつ個体の出現を可能にすること であることが多くの研究から推察される。また、染色体のセン卜ロメア周辺やへテロ クロマチン領域では組換えが抑制されることが知られているが、類縁程度の異なる雑 種において組換え頻度がどのように変化するかについては良く判っていない。分子マ ーカーの利用によって、雑種後代の組み換え頻度を詳細に比較することが可能となっ ているが、有用遺伝子を交雑によって利用しようとする育種法では遺伝的組換え頻度 変化の有無が育種の正否に重要であるにも拘わらず、殆ど研究がなされていないこと から本実験が計画された。
2）栽培イネの日印交雑から第6染色体の分子マーカー地図を作成した。T65wx（日本 型）とIR36（インド型）のF2165個体について、コーネル大学・農水省イネゲノム研 究チーム・北大農学部植物育種学研究室で作成された分子マーカーを用いて制限酵素 断片長多型(RFI．P）分析を行い連鎖関係を調査した。異なる研究室の分子マーカーの 統合地図により、従来報告された第6染色体上の種々の量的形質の分離情報を今後統 一的に解釈できると考えられる。T65wxXIR36 Fiは雑種不稔を示し、この現象には 雌配偶子を退化させる雑種不稔遺伝子が第6染包体のC遺伝子（アントシアニン着色 遺伝子）近傍に存在することが報告されている。調査した分子マーカーは両親型とへ テロ型が全てメンデル遺伝から期待される分離様式を示し、雌配偶子を退化させる雑 種不稔遺伝子の存在をしめす結果は得られなかった。トウモロコシのアントシアニン 着包遺伝子C1のイネホモログOs C1を作成した地図上にマップした結果、その座上位 置からOs C1がC遺伝子の候補遺伝子であると推定された。
3） T65wxXIR36 Fiに雌配偶子を退化させる雑種不稔遺伝子が存在する場合、Fiに
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T65wxの 花粉 で 戻 し交 雑 す ると 雑 種 不稔 遺 伝 子近 傍のマー カーに は著しい 分離の歪 み が 出 るこ と が 期待 され る。Fi個 体には高 度の不 稔現象が 認められ たが、 戻し交雑 によ っ て も分 離 の 歪み は検 出され なかった 。この結 果は、 雌配偶子 を退化 させる雑 種不稔 遺 伝 子の 存 在 を否 定 し た。T65wxとIR36聞 の雑 種不稔 現象を三 島と札 幌で比較 調査し た と こ ろ 、 雌 雄 両 器 官 と も 札 幌 で 高 い 不 稔 を 示し た 。T65wxXIR36F2世 代で は 雌 雄 両 配 偶子 で の 組換 え頻 度が調 査される が、戻し 交雑で は単性配 偶子で の組換え 頻度が 調 査 でき る 。 両者 の連 鎖地図 の比較か ら、一部 の領域 で連鎖強 度に違 いのある ことが 推察された。
4） W593Aは〇，sativaの野生祖先種〇．rufipogon (W593)から第6染信体を戻し交雑によ っ てT65wxに 導 入 し た 準 同 質 遺 伝 子 系 統 で あ る 。T65wxXW593AFzの99個 体 を 翻 査 し て 、 第6染 色 体 短 腕 領 域 の 連 鎖 地 図 を 作 成し た 。W593の第6染 色体 上 に は 、雌 雄 両 配偶 子 を 退化 させ る雑種 不稔遺伝 子（配偶 子キラ ー遺伝子 ）が存 在するこ とが報 告 さ れて い る 。配 偶 子 キラ ー 近 傍で はT65wx由来 のマーカ ーは後 代に伝達 しないこ と が 期 待 さ れ 、 実 際 にRlllなどT65wx由 来の マ ー カー の 頻 度は 極 度 に低 か っ た 。こ の こ と から 、 配 偶子 キ ラ ーS6は 第6染 色 体セ ン ト ロメア近 傍に位置 するこ とが明か とな っ た 。T65wxxW593AF2の 連 鎖 地 図 は 、T65wxXIR36 F2の も の と 比 較 し て 一 部 に 違 い は ある も の の概 ね一 致した 連鎖関係 が認めら れた。 このこと は、栽 培および 野生イ ネ 系 統で は 遺 伝的 組換 え頻度 に差はな いものと 考えら れた。さ らに、 この実験 結果は 雑 種 不 稔 遺 伝 子 は 組 換 え 頻 度 の 推 定 に は 障 害 に な ら な い こ と を 示 唆 し て い る 。 のPS7は ア フリ カ の 栽培 種 〇 ．glaberrima (W025)か ら第6染色体 を戻し交 雑によ って T65wxに 導 入 し た 準 同 質 遺 伝 子 系 統 で あ る 。T65wxXPS7Fzの51個 体 を 駕 査 し て 、 第6染 色 体 短 腕 領 域 の 連 鎖 地 図 を 作 成 し た 。W025の第6染 色体 上 に も、 雌 雄 両 配偶 子 を 退化 さ せ る雑 種不 稔遺伝 子（配偶 子キラー 遺伝子 ）がwx座近 傍に存 在するこ とが 報 告 され て い る。 配 偶 子キ ラ 一 近傍 で はT65wx由 来のマー カーは 後代に伝 達しない こ と が 期 待 さ れ 、 実 際 にWxやR2516で はT65wx由 来 の マー カ ー の頻 度 は 極 度に 低 か っ た 。 こ の こ と か ら 、配 偶 子 キ ラーS1はR2516近 傍 に位 置 す るこ と が 明か と な っ た。
し か しな が ら 、.T65wx由 来の マ ー カー の 頻 度 はS6で観察 された 時より高 く、T65wx背 景 下 で は 花 粉 キ ラ ー に 近 い 発 現 を す る と 考 え られ た 。T65wxXPS7Fの 連 鎖 地図 は 、 T65wxXIR36F2の も の と 比 較 し て 異 な り 、 組 換 え が 著し く 抑 制さ れ て い た。 各 分 子 マ ー カー の 領 域で 組換 え頻度 の比較か ら、この 組換え 抑制は駆 とは独 立に起こ ること が 明 かと な っ た。 この ように 、異なる イネ栽培 種問で は遺伝的 組換え 頻度が著 しく異 なる場合があると考えられた。
6） Wx遺 伝子は 花粉で発 現し、そ の発現 を容易に ヨード反応によって観察できるので、
遺 伝 子座 内 の 組換 え頻 度を容 易に調査 すること ができ る。多数 の人為 誘発モチ 突然変 異 体 と自 然 モ チ突 然変 異体を 供試して 、座内の 変異部 位の遺伝 地図を 作成した 。座内 の 最 大組 換 え 卒は0.12 cMと 推 定 でき た 。 自 然モチ 突然変異 体でも 異なる領 域に変 異 部 位 が検 出 さ れ起 源の 異なる 系統が混 在してい た。人 為誘発モ チ突然 変異体に ついて は 、 塩基 配 列 の比 較か ら既に 変異部位 が明らか となっ ており、 その物 理的距離 との対 応か ら組換え は23．2kb′cMで起 こると 推定でき た。こ の頻度は イネゲ ノム全体の平均 より10倍以上高い頻度であった。
7） 職 遺 伝 子 近 傍 の300kbの 領 域 の 物 理 地 図 が 作 成さ れ て いる 。T65wxIR36F2546個 体を7つの 分子マ ーカーを 用いて、195kbの 領域で起 こる組換え頻度を調査した。領域に よって6．7kb′cMから冫689kb／cMと著しい差異のあることが判った。さらに組換え頻度の 変動 は、その 領域に 含まれる反復配列や転写領域と関連していなかった。195kbの領域に もこのような遺伝的組換え頻度の変化が存在することは、従来知られておらず異穫から有 用遺 伝 子 を導 入 する交 雑育種 にあたっ ても重 要な情報 を与える ものと 考えられ る。
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学位論文審査の要旨
学位論文題名
Studies on genetic recombination in wide hybridization of rice
（ イ ネ の 遠 縁 交 雑 に お け る 遺 伝 的 組 換 え に 関 する 研 究 ）
本 論文は、 図26、表18、104ベ ージか らなる英 文で、 別に5編の参考 論文が添えられ ている。
作物の育種は、遺伝的組換えを促進し多数の組換え個体の中から目的に合った遺伝子組 み合わせをもつ個体を選抜することである。したがって、選抜技術・選抜理論が育種の中 心課題とされてきたが、遺伝的組換えは交配相手とは無関係に無作為に起こることを前提 としてきた。最近、分子マーカーを利用して他の種から有用遺伝子を導入する試みが活発 に行われているが、交雑相手によって組換え頻度が大きく変動する可能性が示唆されてい る。本研究はイネの遠縁交雑における組換え頻度を比較するために、類縁程度の異なる系 統間で雑種集団を作成し、第6染色体上に座上する遺伝子の連鎖関係を調査するとともに、
遺伝子座内とその周辺領域の組換え頻度を比較調査した。得られた結果を要約すると、次 のごとくである。
1）栽培イネの目印交雑から第6染色体の分子マーカ一地図を作成した。T65wx（日本型）
とIR36（インド 型）のFzl65個体 にっい て、異なる研究グループで作成された分子マ一 力一を用いて制限酵素断片長多型（RFLP)分析を行い連鎖関係を調査した。T65wxx IR36 Fi は 雑種不稔 を示し、 この現象には雌配偶子を退化させる雑種不稔遺伝子が第6染色体のC 遺伝子（アントシアニン着色遺伝子）近傍に存在することが報告されている。調査した分 子マーカーは両親型とへテ口型が全てヌンデル遺伝から期待される分離様式を示し、雌配 偶子を退化させる雑種不稔遺伝子の存在をしめす結果は得られなかった。また、トウモ口 コシのアントシアニン着色遺伝子CIのイネホモログ〇sC1を作成レた地図上にマ・ンプした 結 果 、 そ の 座 上 位 置 か らOs C1がC遺 伝 子 の 候 補 遺 伝 子 で あ る と 推 定 し た 。 2）T65wxxIR36Fユに雌配偶子を退化させる雑種不稔遺伝子が存在する場合、F、にT65wx の花粉で戻し交雑すると雑種不稔遺伝子近傍のマ一力一には著しい分離の歪みが出ること が期待される。Fユ個体には高度の不稔現象が認められたが、戻し交雑によっても分離の歪 みは検出されなかった。この結果は、雌配偶子を退化させる雑種不稔遺伝子の存在を否定 した。T65wxxIR36 Fz世代では雌雄両配偶子での組換え頻度が調査されるが、戻し交雑で は単性配偶子での組換え頻度が調査できる。両者の連鎖地図の比較から、一部の領域で連 鎖強度に違いのあることが推察された。
雄
也 夫
芳
義 哲
野 本
上
佐 島
三
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
3）W593Aは〇．sativaの野生祖先種〇，rufipogon (W593)から第6染色体を戻し交雑によっ てT65wxに 導 入し た 準 同質 遺 伝 子系 統 である。T65wxxW593AFzの99個体を 調査して 、 第6染 色体短腕 領域の 連鎖地図 を作成 した。W593の 第6染色体上 には、雌雄両配偶子を 退化させる雑種不稔遺伝子（配偶子キラ一遺伝子）が存在することが報告されている。配 偶子キラ 一近傍 ではT65wx由来の マーカー は後代に伝達しないことが期待され、実際に R111などT65wx由来のマーカーの頻度は極度に低かった：このことから、配偶子キラ一 S6 は第6染色体セ ント口 メア近傍 に位置 すること が明か となった 。T65wxxW593AF2の連鎖 地図は、T65wxxIR36 F2のものと比較して一部に違いはあるものの概ね一致した連鎖関係 が認められた。このことは、栽培および野生イネ系統では遺伝的組換え頻度に差はないも のと考えられた。
4）PS7はアフリカの栽培種〇．glaberrima (W025)から第6染色体を戻し交雑によってT65wx に導入し た準同 質遺伝子 系統であ る。T65wxxPS7F2の51個 体を調査 して、第6染色体短 腕領域の 連鎖地 図を作成 した。W025の第6染色体上にも、雌雄両配偶子を退化させる雑 種不稔遺 伝子（ 配偶子キラ一遺伝子）がwx座近傍に存在することが報告されている。配 偶子キラ一近傍ではT65wx由来のマ一力一は後代に伝達しないことが期待され、実際にWx やR2516で はT65wx由来のマ ーカー の頻度は 極度に 低かった 。このこ とから、配偶子キ ラ‑ S1はR2516近傍に 位置する ことが 明かとな った。 しかしな がら、T65wx由来のマ一 力一の頻度はS6で観察された時より高く、T65wx背景下では花粉キラーに近い発現をする と考えら れた。T65wxxPS7F2の連鎖地図は、T65wxxIR36 Fzのものと比較して異なり、組 換えが著しく抑制されていた。各分子マーカーの領域で組換え頻度の比較から、この組換 え抑制はS1とは独立に起こることが明かと顔った。
5）Wx遺 伝子は 花粉で発 現し、そ の発現 を容易にヨード反応によって観察できるので、
遺伝子座 内の組 換え頻度を容易に調査することができる。人為誘発モチ突然変異体10系 統を供試して、座内の変異部位の遺伝地図を作成した。座内の最大組換え率は0.12 cMと 推定でき た。供 試した10系統では、塩基配列の比較から既に変異部位が明らかとなって おり、その物理的距離との対応から組換えは23.2 kb/cMで起こると推定できた。この頻度 はイネゲノム全体の平均より10倍以上高い頻度であった。
6）Wx遺伝 子 近 傍の300 kbの領 域 の 物 理地 図 が 作成 さ れ てい る 。T65wxxIR36 F2546 個体を7つの分子マーカーを用いて、195 kbの領域で起こる組換え頻度を調査した。領域 によって6.7 kb/cMから>689 kb/cMと著しい差異のあることが判った。さらに組換え頻度 の変動は、その領域に含まれる反復配列や転写領域と関連していなかった。これらの結果 は、異種から有用遺伝子を導入する交雑育種にあたっても重要な情報を与えるものと考え られる。
以上のように、本研究は情報の少なかった遺伝的組換えが交雑相手や領域によって大き く変動することを明らかにし、異種から有用遺伝子を導入する交雑育種にあたって重要な 知見を与えている。この成果は，学術的・実用的に高く評価される。よって審査員一同は，
Khin Thidarが博 士（農 学）の学 位を受 けるのに 十分な 資格を有 するもの と認め た。
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