博 士 （ 薬 学 ） 土 谷 博 之
学 位 論 文 題 名
遺伝子修復効率の上昇を目的とした新規DNA 断片の開発 学位論文内容の要旨
遺 伝子疾 患の原 因とな る変興 型塩基 配列を、直接正常型の塩基vie9uへと変換する逍伝子修 復 法は、 疾患の 「完全治癒」が期待できる珂！i!的な逍伝子治療のーつである。迎伝子修復法 の ー つ で あるSlllcilトFragment Homologous Rel）lacemeiit (SFHR)法 では、 正常型 塩基 配列を持つ二本qriaPCRIlji片（400‑800 bp）を熟変性後、変興迎伝予を持つ翁lI胞へ導入する こ とによ って、 いくっ かの疾 患逍伝 子を正常 型へと 逍伝子 修復することがこれまで示されて き た 。 し かし な が ら その修 復効率 は1％前 後と非 常に低 く、ま た塩基 配列に 誤りの 多いPCR 断 片によ る新た な変興 の導入 といっ た危険性もあり、この方法を臨床的にJ羽いるにはさらな る改良が必要である。そこで本和『究では、修復効率の上昇及び安全性の向上を｜ヨ的として、
DNAlyf片 の 改良 を 行 い 、臨 床 的 に 用い る こ と が可 能 な 新 しい 避 伝 子 修復 法の開 発を試 み た。
本 研 究 で は コ ドン34（TCA: Ser） に終Jヒ変 興 （TGA: opal） を 導 入し た 変 異 型Ilyg‑
EGFP逍伝 予 を 標 的と し て 、 正常 型 のTCAへと 変 換す る逍伝 子修復 を行った 。この 遮伝子 修 復 に 用 い るDNA断 片 と して 、606塩 基対 の 二 本t:l'tPCR断 片（l'PCR)及 び二本 鍛制限IVi片
（fRes） に 加Iえ 、606塩 基 の セ ン ス 及 び ア ン チ セ ン ス 配 列 を 持 つ ー 本 鍔lDNA断 片 (I'S ense、fAnliS)を一 本鎖環 状ファー ジミド より調 製した 。rRcsは火 腸繭内 におい て複 製 された プラス ミドより訓製されており、従来のPCR断片であるl'）CRに対し、10｜i倍、正離 な 塩基配 列を有 してい るもの と考え られる。ファージもまた大腸薗内の複製系を利門jしてい る ため、IIsenseや1．AntiSの塩基 配列に おいても、爪esと同様、非常に高い正碓性を有して い るもの と考え られる 。この ことは 、SF川ミ 法の臨 床応用ヘ 向けた安全性の確立のために、
非常に重要なことであるといえる。
こ れまで の二本 鎖PCR断片 を用い たSFHR法において、網1｜胞I勺への導入面前に行う二本鎖 DNA断 片 の 熱変 性 が 、 高い 修 復 効 率を 得 る た めに 必要で あるこ とが示 されて きた。 このこ と は 、 熱 変性 に よ っ てでき た一本 鎖DNA幽i片がSFHR法 におい て重要 である ことを 示唆して い る 。 し かし な が ら 数百 塩 基 対 の二 本 鎖DNAを効 率よく 完全に 一本鎖 にする ことは 非常に 困 難であ り、そ こで相キ11j鎖を含まない完全な一本鎖DNA断片である、rsense又はI．AntiSを J羽 い る こ と に よ っ て 、 修 復 効 率 の 向 上 が 期 待 で き る の で は な い か と 考 え た 。 こ れら4種 類のDNA断片を用いて遺伝子修復を行った結果、rSenscはfrヽes及び11）Clミに対 し 、 そ れ ぞれ6倍 及 び12倍 高 い 遺 伝予 修 復 効 率を 示した 。この ときfAntiSは、同 じ一本鎖 DNAで あ り なが ら 、rSenseの1／9の値 し か 示 さず 、標的 遺伝子 の転写 反応が 影響し ている ではないかと考えられた。しかしながらその後の検討によって、この配列選択性に！1伝写反応 は関与していないことをIリヨらかとした。また興味深いことに、I．ResはlIPCRに対し、2倍の有 意 な修復 効率の 上昇を 示した 。この 現象には 爪esに 含まれる 大腸薗特異的な塩基修Amが関与 し て い る こと が 示 唆 され、 この効 果がrSenseに対し ても影 響を及 ばしてい ること を明ら か とした。
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さ ら な る 検 討 の 結 果 、 こ のfSenseを 用 い た 過 伝 予 修 復 に は 、DN AIlli片 の 鎖 長に 最 適 値 が 存 在する こと、 相栩1鎖との分子Ii‖高次榊造、及び一本鎖DNAIiTf片の分子｜・´、］高次桝造が捫J制 的 に 作J羽 す る こ と 、 そ の 逍 伝 子 修 復 メ カ ニ ズ ム に 、DNAIUi片 が 櫟 的 プ ラ ス ミ ド へ と イ ン テ グ レ ー ト す る 、 相 同 組 換 え と 思 わ れ る 反 応 がI3U与し て い る こ と、 逍 伝 子 修 復の タ イ ム コ ース は36時 J瑚 で す で に 最 大 値 と な り 飽 和 し て い る こ と 、 な ど が 明 ら か と な っ た 。 最 後 に 、 こ れ ら の 結果 を 基 にrSenseに改 良 を カllえ 、 さ ら な る遺 伝 子 修 彳 夐効 率 の 上 昇 に つ い て検討 を行っ た。
ま ず こ の 逍 伝 子 修 復に 棚 同 組 換 えの 関 与 が 示 唆 され た こ と か ら、Pai'tial． Dul)lex（PD） DNA断片 を用い ること とした 。こ れまで の棚同xll． 換えのt圷 究にお いて 、‖｜1i乳動物荊I｜胞内で 1； 川 司 莉1換 え 反 応 の巾 心 的 役 割 を担 っ て い るR 1d51は、こ のPD．DNAl断片 を基質 とした とき 効 率 よ く む ｝ 、m´10相 同 組 換 え 反 応 を 行 う こ と が これ ま で ＊Ii告 さ れ て き た。 そ の 結 果 、PD． DNA断 片 を 用 い る こ と に よ っ てrscnseに 対 し 最 大2倍 ま で 修 復 効 率 が 上 昇 し 、Itsenscの3． 末 端 に 部 分 的 二 本 錐1を 持 つ3． ‐PD・DNA断 片 が 最 も 高 い修 復 効 率 を 示し た 。 さ ら にこ のPD． DNA断 片 に よ る 越 伝 子 修 復 効 率 の 上 昇 効 果 はDuplex部 分 の 鎖 長 （27塩 基 対 以 上 ） に 依 存 し た 。 ま たDLIplexを 形 成 す る た め の オ リ ゴDNAに 対 し 、DNAの み で は 効 采 が 観 察 で き な か っ た 短 い 釼l・ ・l長 （20塩 基 対 ）で あ っ て も 、 二本 鎖の安 定性 を向上 し、さ らにA型ら せん榊 造を取 り やすい ことで 知られ てい る2． ‐〇 ，4 ‐〇ELhylene‐bri（lge（lnLlclcicacid（ENA）を導入した 1｀arIial‐HeLer0‐DLll】1ex（PHD）DNA｜折 片をJ羽い ることによって、rsenseに刈．し2f尚以上、
修 復 効 率 を上 昇 さ せ る こと がj如 ら かと な っ た 。 また こ の と き 他 の核 駿 ア ナ ロ グ（2｜ ‐ 〇IMe‐ RNA、BNA）を 月］い たPHD．DNA断片 では効 爿ミは 御！察 されな かっ た。
次 に 逍 伝 子 修 復 の タイ ム コ ー ス から ｜Wら か とな っ た 結 果 よ り、361｜暑 問 ま で にrSenscの ほ と ん ど が 網1｜ 胞 内 に おい て 分 解 を 受け て い る ので はない かと 予想し た。そ こで荊lI胞内 のエキ ソ ヌ ク レ ア ー ゼ か らDNA断 片 の 末 端 を 保 護 す る こ と を 目 的 と し て 、 分 子 内 ル ー プ 榊 造 を 取 り I．Sesneの 末 端 に 相 莉n的 な 配 列 を 持 っ オ リ ゴDNAをrSenseに ア ニ ー リ ン グ し 、LooJJe（I‐ DLlplex（l丿l〕 ）DNA断 片を 調製し た。 この結 果、LI） ．DNA｜斫 片によ っても 修復効 率は 最大2倍 ま で 上 昇 し 、 ま た 興 ｜ 昧 深い こ と に 、PD．DNA断 片 と 同 様 、3． 末 端 側 に部 分 的 二 本 鎖を 持 つ こ と によっ て修復 効率は 最大 の値を 示すこ とが明 らかと なっ た。
本Wf究 で は 、 修 復 メ カ ニ ズ ム に 基 づ い たDNA断 片 の 改 変 と い う 、 よ り 高 い 修 復 効 率 を 持 つDNA断 片 の 開 発 方 法 を 提 案 し 、 従 来 法 と 比 較 し て10〜 20倍 ま で 修 復 効 率 を 改 善 さ せ た 点 に 意 義 が あ る と 考 え て い る 。 今 後 、 本Irof究 で 開 発 し たPD‑DNAIIJj片 、ENA導 入l）I‑ID‑DNA 断 片 、 そ し てIJD‑DNA断 片 を 組 み 合 わ せ 、 最 適 化 し て い き 、 最 も 高 い 修 復 効 率 を 有 す る DNAIlli片 を 開 発 し て い くこ と が 必 要 であ る 。 さ ら にj；Ij同 組換 え に 焦 点 を当 て た 研 究 を行 う こ とに よ っ て 、%ici胞内 のどの よう な分子 が関与 してい るかを ｜明 らかに してい くこと は、 プく変 重 要 な 意 義 を 伴 っ て い る 。 す な わ ち 、 そ こ でI明 らか に さ れ た 遺伝 予 修 復 に 関与 す る 分 子 に適 し た 基 質 と し て 、 新 た なDNAIlli片 の 検 討 を 行 っ て い く こ と に よ っ て 、 さ ら な る 修 復 効 率 の 向 上が 可 能 に な るも の と 考 え られ る 。
本 研 究 は 、DNAIljr片 の 改 変 に よりSFHR法に よ る 遺 伝 子修 復 法 を 改 善さ せ た 最 初 の孝lミ 告 で あ り 、 上 記 の よ う な 検 討 を 通 じ 、 逍 伝 子 修 復 法 を 臨床 的 に 応 用 して い く た め の有n〕 な 情 報を も たら す も の で ある 。
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