Real-time RT-PCR 法によるアストロウイルス遺伝子の検出

Real-time RT-PCR 法によるアストロウイルス遺伝子の検出

千葉市環境保健研究所

横 井 一 北 橋 智 子

（平成 20 年 9 月 25 日受付）

（平成 21 年 1 月 7 日受理）

Key words : Human astrovirus, Real-time RT-PCR, TaqMan MGB probe

要 旨

アストロウイルス（Human astrovirus : HAstV）を検出するための Real-time reverse transcription- polymerase chain reaction（RT-PCR）法を開発した．

HAstV ゲノムの Open reading frame 2（ORF2）のうち，比較的保存性の高い 5ʼ末端領域を Real-time RT- PCR 法の標的配列として選択し，プライマーおよび TaqMan MGB プローブを新たに設計した．HAstV 1 型から 7 型の各血清型（コントロールプラスミド）ともに 30copies! tube から 3.0×10

copies! tube の範囲で 遺伝子の定量が可能であり，検出感度は各血清型ともに 30copies! tube であった．また，HAstV 陽性の臨 床検体から抽出した遺伝子についても検出が可能であった．

Real-time RT-PCR 法は Conventional RT-PCR 法に比べ，10 から 10

倍感度が高く，ノロウイルス，サポ ウイルス，A 群ロタウイルス，及びアデノウイルスとの交差反応は全く認められなかった．

以上の結果から，今回開発した Real-time RT-PCR 法は，従来の Conevntional RT-PCR 法と比較して，簡 便で迅速に HAstV1 型から 7 型までの各血清型の遺伝子を検出し，定量することが可能であると考えられ た．

〔感染症誌 83：120〜126，2009〕

序 文

アストロウイルス（Human astrovirus : HAstV）は，

小児の糞便から電子顕微鏡により発見された星状の表 面 構 造 を 持 つ 直 径 28〜30nm の 球 形 ウ イ ル ス で あ り

，ウイルス構造蛋白質の抗原性により，1 型から 8 型の血清型に分類されている．HAstV のゲノムは，

1 本鎖のプラス RNA であり，3 つの翻訳領域（Open reading frame : ORF）から構成され

，5ʼ側の非構造 蛋白質をコードする ORF1a と ORF1b，その下流に ウイルス構造蛋白質をコードする ORF2 が存在する．

HAstV の主な臨床症状は下痢および嘔吐であるが，

ノロウイルスに比べ一般的に胃腸炎症状が軽く，乳幼 児における散発的な発生が多い．日本における乳幼児 感染性胃腸炎患者からの HAstV の検出率は 3.2％ で あり，その血清型は 1 型が多いことが報告されている が

，その一方で軍隊における HAstV3 型の流行

や HAstV6 型による集団食中毒

も報告されている．

近年，Reverse transcription-polymerase chain reac-

tion（RT-PCR）法がウイルス遺伝子の検出法として 用いられるようになり，ウイルス量が少ない検体から 高 感 度 に HAstV を 検 出 す る こ と が 可 能 で あ る た め

，HAstV の流行状況調査や集団感染事例におけ るウイルス検出法として，必須の診断技術となってい る．しかしながら，RT-PCR 法による遺伝子検出は，

電気泳動による PCR 産物の確認，および得られた PCR 産物の確認検査（シークエンス解析やハイブリ ダイゼーション等）を必要とするため，迅速性に欠け る一面もある．

そこで，著者らは迅速性，高感度，および定量性を 併せ持った HAstV 遺伝子検出法の開発を目的とし て，各種ウイルス感染症領域でその有用性が確認され ている Real-time RT-PCR 法に着目し，HAstV 1 型か ら 8 型までの全血清型の検出が可能な遺伝子診断法の 構築について検討したので報告する．

材料および方法

1．ウイルス検体の前処理

HAstV RNA の調製には，愛媛県立衛生環境研究所 から分与された血清型 1，2，3，4，5，6，および 7

別刷請求先：（〒261―0001）千葉市美浜区幸町 1―3―9 千葉市環境保健研究所医科学課 横井 一

のウイルス株を使用した．これら 7 血清型の分与ウイ ルス株を CaCo-2 細胞により 2 回継代した後，培養上 清を回収し，RNA の抽出時まで−80℃ に保存した．

一方，臨床検体における本法の有用性と他の下痢症 ウイルスとの交差反応の有無を検討するために，千葉 市内医療機関で感染性胃腸炎と診断された患者から採 取された HAstV 陽性糞便 13 検体（1 型：10 検体，3 型：1 検体，4 型：1 検体，および 2 型と 6 型の混合：

1 検体），ノロウイルス（Norovirus : NV）陽性糞便 43 検体，サポウイルス（Sapovirus : SV）陽性糞便 4 検 体，A 群ロタウイルス（Rotavirus : RV）陽性糞便 9 検体，およびアデノウイルス 40! 41 型（Adenovirus : ADV）陽性糞便 3 検体をウイルス RNA の調製に使 用した．これらの糞便検体について，PBS（−）を用 いて 10％ 糞便乳剤を作製した後，7,000rpm で 1 分間 遠心した上清を回収し，RNA の抽出時まで−80℃ に 保存した．

2．ウイルス RNA の抽出

HAstV 分離株の培養上清 200µL，または 10％ 糞便 乳剤 200 µ L から High Pure Viral RNA Kit（Roche）

を使用してウイルス RNA の抽出を行った後，RNA を DNaseI により処理した．すなわち，ウイルス RNA 45µL に DNaseI 反 応 液（5units! µL RNase-free DNaseI（TaKaRa）4.0µL と 10×DNaseIBuffer 21.0µL を混合）を 5 µ L 加え，37℃ で 30 分間反応させた後，

75℃ で 5 分間処理したものを DNaseI 処理ウイルス RNA とし，使用時まで−80℃ に保存した．

3．Real-time RT-PCR 用 プ ラ イ マ ー お よ び TaqMan MGB プローブの設計

HAstV ゲノムの ORF2 遺伝子領域のうち，各血清 型 間 で 保 存 性 の 高 い 5ʼ末 端 か ら 250bp の 領 域

を Real-time RT-PCR 法の標 的 配 列 と し て 選 択 し た．

GeneBank に登録されている HAstV 38 株の塩基配列 250bp をインターネット Web 上のソフトウェアであ る MultAlin（http:!! bioinfo.genotoul.fr! multalin! mul- talin.html）を用いてウイルス株相互の配列アライメ ントを行い，1 型から 8 型の共通配列を検索した（Fig.

1）．検索結果に基づき，プライマーまたはプローブ配 列と共通配列のミスマッチが最小となるように，sense プライマー 3 種類，antisense プライマー 1 種類，お よび TaqMan MGB プローブ 1 種類を設計した（Ta- ble 1）．なお，各プライマーの合成は Invitrogen に依 頼し，TaqMan MGB プローブについては Applied Biosystems（ABI）に依頼した．

4．コントロールプラスミドの作製

HAstV の各血清型（T1! Oxford! L23513，T2! Oxford

! L13745，T3 ! S3 ! AB000291，T4 ! ORF1b ! AF292075，

T5! Oxford! U15136，T6! ORF1b! AF292077，お よ び

T7! ORF1b! AF248738）に お け る ORF2 の 5ʼ末 端 領 域の遺伝子を後述の AC1ʼおよび AC230 プライマー

（Table 1）を用いた Conventional RT-PCR 法によっ て増幅させた．これらの PCR 産物を TOPO TA Clon- ing Kit for Sequencing（Invitrogen）を用いて pCR4- TOPO vector にサブクローニングした．PCR 産物の 塩基配列をダイレクトシークエンス法により確認した 後，Plasmid Mini Kit（Qiagen）により環状プラスミ ドを精製し，制限酵素 Spe I で切断した．得られた直 鎖状プラスミドの OD 値を測定し，TE buffer（10mM Tris-HCl，pH8.0 ; 1mM EDTA，pH8.0）にて 3.0×10

copies! 5µL の濃度に調製した後，使用時まで−80℃

に保存した．

5．ウイルス RNA の逆転写反応による cDNA の作 製

1 tube あたり 40 µ L の反応量で実施した．すなわち，

RNase-free 滅菌蒸留水 3.9µL，5×First-Strand Buffer 8.0µL，10mM dNTP Mix 2.0µL，1.0µg! µL pd（N）

Random Hexamer（Amersham）1.0µL，100mM DTT 2.0 µ L，40units ! µ L RNaseOUT Recombinant Ribonu- clease Inhibitor（Invitrogen）1.1µL，200units! µL Su- perScriptII RNaseH（−）reverse transcriptase（Invi- trogen）2.0µL，および DNaseI 処理ウイルス RNA 20 µ L を混合した後，42℃ で 60 分間反応させた．次い で 99℃ で 5 分間処理したものを cDNA とし，使用時 まで−30℃ に保存した．なお，HAstV の cDNA につ いては，各血清型の 10 倍段階希釈液を作製した（10

から 10

倍希釈まで）．

6．Real-time RT-PCR 法

1 tube あたり 50µL の反応量で実施した．すなわち，

MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate（ABI）に QuantiTect Probe PCR Master Mix（Qiagen）25µL，

100µM プライマー各 0.2µL，10µM TaqMan MGB プ ローブ 0.5 µ L，および滅菌蒸留水 18.7 µ L，および 5.0 µ L の cDNA を加えた後，ABI PRISM 7000SDS（ABI）

を使用して増幅反応を行った．反応条件は，95℃ 15 分の後，94℃ 15 秒（熱変性）と 62℃ 1 分の反応を 45 回繰り返した．一方，コントロールプラスミドについ ては，TE buffer にて 10 倍段階希釈を行い，3.0×10

copies! 5µL から 3.0×10

copies! 5µL までの 10 倍希釈 系列を作製した後，cDNA と同様に増幅反応を行っ た．反応終了後に ABI Sequence Detection System Software ver. 1.1 を使用し，ウイルス遺伝子の検出と 定量解析を実施した．

7．Conventional RT-PCR 法

1 tube あたり 50µL の反応量で実施した．すなわち，

0.2ml PCR tube に 10×Ex Taq Buffer 5.0 µ L，100 µ M

プライマー各 0.25µL，2.5mM dNTP Mix 4.0µL，5

Fig. 1 Aligment of 38 conserved-region nucleotide sequences in the 5’ end ofthe capsid gene (ORF2)ofHuman Astrovirussero- type 1 (T1),2 (T2),3 (T3),4 (T4),5 (T5),6 (T6),7 (T7)and 8 (T8). The Serotype/accession number is shown beside the sequence.

Asterisksbelow alignmentindicate the consensusnucleotide sequence.Solid-line arrows:newly designed primers.Double-line arrow:TaqMan MGB probe.

Table 1 Primerand Probe Oligonucleotidesused forReal-time Quantitative Human AstrovirusRT-PCR and ConventionalRT-PCR.

Location Polarity ^＊b

Sequence (5’ → 3’ )^{＊ a} PrimerorProbe

PCR Assay

4349-4367 ^＊d

＋ CAG GTA ACT GTT GAG GTC A

HuAstVf2240 Real-time

RT-PCR HuAstVf2140 GCA AGT YAC TGT TGA GGT CA ＋ 4345-4364 ^＊e 22-39 ^＊f

＋ GAA GTC ACT GTG GAG GTC

HuAstVf2239T4

4562-4544 ^＊d

－ GTT TWG GTC CTG TGA CAC C

HuAstVr4123

4515-4501 ^＊d

－ FAM-TTA CGG ACA CGY TGA-MGB-NFQ

HuAstV/1-8/TP ^{＊ c}

1-21 ^＊g

＋ ATG GCT AGC AAG TCT GAC AAG

AC1’

Conventional

RT-PCR ^＊h AC230 GGT TTW GGT CCT GTG ACA CC － 236-217 ^＊g 4563-4545 ^＊d

＋ GAC GAA GCG GAC AGG TTT GA

AC4

6771-6748 ^＊d

－ GCT TCT GAT TAA ATC AAT TTT AAA AC6

＊ aMix basesin degenerated primersand probe are :Y,C orT ;W,A orT.

＊ b ＋ :Sense ;－ ,antisense.

＊ cThe MGB probe islabeled with 6-carboxyfluorescein (FAM)reporterdye atthe 5’ end,and with minorgroove binder(MGB)and a nonfluorescentquencher(NFQ)atthe 3’ end ofthe oligonucleotide.

＊ dLocation isrelative to the human astrovirusserotype 1 Oxford strain genome (accession numberL23513).

＊eLocation isrelative to the human astrovirusserotype 2 Oxford strain genome (accession numberL13745).

＊ fLocation isrelative to the human astrovirusserotype 4 Oxford strain genome (accession numberZ33883).

＊ gLocation isrelative to the human astrovirusserotype 6 Oxford strain genome (accession numberZ46658).The AC230 primerwasmodified to detected human astrovirusserotype 3 in thisstudy.

＊ hThe ConventionalRT-PCR wasdone using Sakon’ sprimerset.⁸⁾

units ! µ L Ex Taq（TaKaRa）0.25 µ L，および滅菌蒸 留 水 35.25µL，お よ び 5.0µL の cDNA を 加 え た 後，

GeneAmp PCR System 9700（ABI）を使用して増幅 反応を行った．反応条件は，94℃ 30 秒，55℃ 30 秒，

および 72℃ 1 分の反応を 35 回繰り返した．PCR 産 物の確認は 2.5％ アガロースゲル電気泳動により行 い，目的のバンドが確認されたものを陽性とした

．

結 果

HAstV 1 型から 7 型の各コントロールプラスミド の 10 倍段階希釈系列を用いて，Real-time RT-PCR 法 における増幅曲線および検量線の検討を実施した．そ の結果，1 型から 7 型の各血清型において，それぞれ 3.0×10

copies! tube か ら 3.0×10

copies! tube の 範 囲 内で，PCR サイクル数に比例した遺伝子の増幅が認 められ，cDNA 量に基づく PCR 増幅曲線が得られた．

また，X 軸にコントロールプラスミドのコピー数（対 数表示），Y 軸に PCR サイクル数（Ct 値）をプロッ トした場合の検量線は，Fig. 2（A〜G）に示すよう に 1 型（R

＝0.998，Slope：−3.065），2 型（R

＝0.999，

Slope：−3.792），3 型（R

＝0.998，Slope：−3.448），

4 型（R

＝0.999，Slope：−3.311），5 型（R

＝0.999，

Slope：−3.362），6 型（R

＝0.999，Slope：−3.232），

および 7 型（R

＝0.999，Slope：−3.305）の各血清型 において，それぞれ良好な直線性を示した．以上の結 果から，本法による HAstV 1 型から 7 型の各血清型 の遺伝子検出と定量が可能であることが明らかとな り，検出感度は各血清型ともに 3.0×10

copies! tube であると推定された．また，HAstV 陽性糞便 13 検体

（1 型，2 型，3 型，4 型，および 6 型）から作製した

cDNA を 用 い て Real-time RT-PCR 法 を 行 っ た と こ ろ，1.65×10

copies! tube から 4.15×10

copies! tube の範囲内で全ての検体に遺伝子の増幅が認められた．

なお，NV 陽性糞便 43 検体，SV 陽性糞便 4 検体，RV 陽性糞便 9 検体，および ADV 陽性糞便 3 検体につい ては，遺伝子の増幅は全く認められなかった．

さらに，HAstV 分離株か ら 作 製 し た cDNA の 10 倍段階希釈液を用いて，Real-time RT-PCR 法と Con- ventional RT-PCR 法の検出感度を比較した．その結 果，Real-time RT-PCR 法では，Table 2に示すように，

HAstV 1 型から 7 型の各血清型全てにおいて 10

希 釈まで遺伝子が検出された．また，10

希釈における 各血清型の Ct 値は 1 型で 41.27，2 型で 40.61，3 型で 38.09，4 型で 38.26，5 型で 38.16，6 型で 39.19，およ び 7 型で 36.71 であった．一方，AC1ʼ ! AC230 プライ マーセットを用いた Conventional RT-PCR 法では，

HAstV1 型で 10

希釈，2 型で 10

希釈，3 型で 10

希釈，4 型で 10

希釈，5 型で 10

希釈，6 型で 10

希釈，および 7 型で 10

希釈まで遺伝子が検出され た．また，AC4! AC6 プライマーセットを用いた場合 では，HAstV 1 型で 10

希釈，2 型で 10

希釈，3 型 で 10

希釈，5 型で 10

希釈，6 型で 10

希釈，およ び 7 型で 10

希釈まで遺伝子が検出されたが，4 型で は全く検出されなかった（Table 2）．

考 察

HAstV の検出として早期から ELISA 法が開発さ

れ，使用されてきたが，検出感度が低く，ウイルス量

が少ない糞便検体，食品，および下水等の環境由来検

体からの検出には不向きであった．

Fig. 2 Amplification of 10-fold serial dilution from Human Astrovirus serotype1 (T1),2 (T2),3 (T3),4 (T4),5 (T5),6 (T6),and 7 (T7)controlplas- mid template in Real-time Quantitative RT-PCR assay.

Log10 ofknown numbersofT1 (A),T2 (B),T3 (C),T4 (D),T5 (E),T6 (F), and T7 (G)controlplasmids,containing of3.0×10⁷to 3.0×10¹copiesperre- action,plotted againstthe corresponding cycle threshold (Ct),to generate a standard curve.

近年，PCR 法や RT-PCR 法をはじめとする遺伝子 検出法が各種ウイルス感染症の診断に広く用いられる ようになった．中でも迅速性，高感度，および定量性 を併せ持った Real-time PCR 法は，優れた遺伝子検 出法として着目され，既に NV

，SV

，および RV

等の下痢症ウイルスの遺伝子検出に用いられている．

HAstV においても Real-time RT-PCR 法を用いた遺

伝 子 検 出 が 試 み ら れ て お り，Royuela ら

と Zhang

ら

は SYBER greenI を用いた検出方法を報告してい

る．しかし，SYBER green 法は TaqMan プローブ法

に比べ，反応系の構築が容易である反面，非特異的な

PCR 産物も測定してしまうために特異性が低くなる

Table 2 Human AstrovirusReal-time Quantitative RT-PCR vs.ConventionalRT-PCR Sensitivity.

Maximum 10-fold serialdilution detected by PCR assay ^{＊ a} ViruscDNA

concentration (copies/tube)

Serotype ConventionalRT-PCR ^{＊ c}

(AC4 & AC6 primerset) ConventionalRT-PCR ^{＊ c}

(AC1’ & AC230 primerset) Real-time RT-PCR

(Ct^＊b)

10 ^－3 10 ^{－ 4}

10 ^{－ 5}(41.27) 2.78×10⁶

T1

10 ^－2 10 ^－3

10 ^{－ 5}(40.61) 2.54×10⁵

T2

10 ^－3 10 ^{－ 4}

10 ^{－ 5}(38.09) 1.91×10⁶

T3

Notdetected 10 ^{－ 4}

10 ^{－ 5}(38.26) 1.25×10⁶

T4

10 ^－3 10 ^{－ 2}

10 ^{－ 5}(38.16) 1.84×10⁶

T5

10 ^－3 10 ^{－ 4}

10 ^{－ 5}(39.19) 1.34×10⁶

T6

10 ^－3 10 ^{－ 4}

10 ^{－ 5}(36.71) 2.08×10⁶

T7

＊ acDNA solution obtained from human astrovirusRNA serotype by the RT reaction was10-fold serialdiluted by sterilized TE buffer.

＊ bCt,threshold cycle

＊ cAC1’ and AC230 primerwere prepared using the 5’ end ofthe ORF2 region.AC4 and AC6 primerwere pre- pared using the 3’ end ofthe ORF2 region.ConventionalRT-PCR resultswere considered positive when the excepted amplification productwasvisible on agarose gel.

ことも知られている．一方，Le Cann ら

は ORF2 の 3ʼ末端に設定したプライマーと TaqMan プローブを 用いた遺伝子検出を報告しているが，他の下痢症ウイ ルスとの交差反応の有無，およびプローブが全ての血 清型を検出できるか否かについては示されていない．

また，Grimm ら

は ORF2 の 5ʼ末端に設定したプラ イマーと TaqMan プローブによる検出を行っている ものの，全ての血清型を検出するために 4 種類のプ ローブを使用するため，コスト削減の面で問題がある．

今回，著者らが開発した Real-time RT-PCR 法では，

全ての血清型（1 から 8 型）を検出するために設計し た 3 種類の sense プライマーと AC230 プライマー

の 配 列 の 一 部 を T か ら W に 変 更 し た 1 種 類 の an- tisense プライマーを使用した．また，プローブにつ いては，Tm 値の上昇，特異性の向上，および全ての 血清型を検出可能とするために設計した 1 種類の 15 mer の TaqMan MGB プローブを使用した．その結 果，1 型から 7 型いずれの血清型においても 30copies!

tube 以上の遺伝子が存在すれば，HAstV 遺伝子の検 出 と 定 量 が 可 能 で あ る こ と が 確 認 さ れ た．ま た，

HAstV 1 型，2 型，3 型，4 型，および 6 型が陽性の 糞便検体からも，本法によって問題なく遺伝子の検出 が可能であり，他の下痢症ウイルス（NV，SV，RV，

および ADV）との交差反応もなく高い特異性を有す ることが明らかとなった．本法の検出感度についても，

AC1ʼ! AC230 プ ラ イ マ ー セ ッ ト を 用 い た Conven- tional RT-PCR 法に比べ，10 倍から 10

倍高く，A4!

AC6 プライマーセットを用いた場合と比べても 10

倍 から 10

倍高いことが確認された．

さらに，今回はアニーリング温度を 62℃ に設定し たが，これは Oka ら

が報告した SV の Real-time RT- PCR 法と同じ温度であり，HAstV と SV Real-time RT-PCR 法を 1 台の装置で同時に実施できることを示

している．現在，食中毒や感染性胃腸炎集団発生事例 における原因ウイルスの殆どが NV であるが，HAstV による事例も少なからず報告されている

．従って，

患者から NV が検出されなかった場合には，他の下痢 症ウイルスの効率的な検索が必要であり，本法は検査 効率の向上にも貢献できるものと考えられる．

な お，T4! Oxford! Z33883 株（HAstV 4 型），お よ び HAstV 8 型については，ウイルス株，プライマー，

およびプローブの塩基配列から，本法を用いて理論上，

検出可能であると推定されるが，今回は実際のウイル ス株を用いて検討を行っていないため，さらなる検討 が必要であると思われる．しかし，sense プライマー の 3ʼ末端側にミス マ ッ チ の あ る T4! Ehime1992! AB 025810 株（HAstV 4 型）については，増幅効率が低 下し，場合によっては検出できないことが問題点とし て示唆された．

以上のことから，今回開発した HAstV の Real-time RT-PCR 法は，PCR 反応後の電気泳動や PCR 産物の 確認検査（ハイブリダイゼーションまたはシークエン ス）が不用であることから，簡便で迅速にかつ高感度 に HAstV1 型から 7 型までの各血清型の遺伝子検出 と定量が可能であり，食中毒や感染性胃腸炎の集団発 生時における行政検査，HAstV の流行状況等に関す る疫学調査，および臨床検査等に応用可能であると考 える．

謝辞：今回，血清型 1 から 7 のアストロウイルス株を分 与していただいた愛媛県立衛生環境研究所 山下育孝先 生，並びに元愛媛県立衛生環境研究所 大瀬戸光明先生に 深謝致します．

文 献

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Astrovirus RNA Detection Using Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Hajime YOKOI & Tomoko KITAHASHI

Chiba City Institute of Health and Environment

The TaqMan-based real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）as- say we developed is sensitive and detects seven (1-7) human astrovirus (HAstV) serotypes. We chose con- served regions at the 5ʼ end of the open reading frame2 (ORF2) was chosen at the assay targets for design- ing new primers and the TaqMan MGB probe that detects all HAstV serotypes.

Real-time RT-PCR reactivity was confirmed with HAstV serotype 1 through 7 control plasmids and effi- ciency ranged from 30 to 3.0×10

copies ! tube. The assay developed detected HAstV sequences from clinical HAstV-positive samples.

The assay was 10 to 10

times more sensitive than Conventional RT-PCR assay and free of cross- reactivity against other enteric viruses, including norovirus, sapovirus, rotavirus, and adenovirus.

These results indicate that our real-time RT-PCR assay rapidly detects and quantitatively analyzes

HAstV serotype 1 through 7.