【研究成果】
背景
オートファジーは、飢餓状態に陥った細胞が外部栄養 源、特にアミノ酸を供給する手段として細胞質やオルガ ネラを消化する現象として発見され、酵母から高等動物 細胞まで種を超えてよく保存されている。近年の研究で は，オートファジーの重要な役割の一つである細胞の代 謝回転—細胞にとって不要な蛋白質の分解除去—に加え て，傷害などにより正常な働きを失い細胞にとって危険 なミトコンドリアの除去や細胞に侵入した病原体の排除 など，細胞の恒常性維持やその生存に重要な働きを担う ことが明らかになってきた。これまでにオートファジー に関連する多くの蛋白質が発見されているが、トランス ゴルジ網に結合している蛋白質が存在するなど、エンド ソーム系とのバランスやユビキチン・プロテアソーム系 との相互作用／関連など未解明な点も多い。最近，オー トファジーで出現する隔離膜（オートファゴソーム）の 由来に関して，小胞体とミトコンドリアの二つの異なっ たオルガネラが協働することでオートファゴソームが出 現することが報告されるなど新しい知見も得られている。
オートファジーの正常な働きが阻害されると発がんや 神経変性疾患，生活習慣病，心不全，感染症などの危険 が高まる。パーキンソン病やアルツハイマー病などのア ミロイドーシスやポリグルタミン病などに代表される神 経変性疾患においては、異常蛋白質の蓄積が神経細胞死 の直接の引き金になっているが，この異常蛋白質の蓄積 にオートファジーの機能低下や機能障害など、その関与 が報告されている。さらに，中枢神経系においては，シ ナプスの可塑性や成熟脳の神経新生で重要な働きを持つ ことが明らかになりつつあるなど，基礎分野から臨床応 用まで精力的な研究が進められている。
一方、抗癌剤や放射線などによるストレス下において
腫瘍細胞はオートファジーによるエネルギー供給や蛋白 質原料の供給によって細胞死から免れていることが明ら かになりつつあり、オートファジーを特異的かつ効率的 に阻害することで治療効果を増強することが期待でき る。現在，オートファジー阻害剤を用いた治験が米国を 中心に進められているが，がんの進行度やその性状に よっても全く異なる働きを持つことも判ってきており，
さらに詳細な検討が求められている。
ここでは，外来ストレスのうち，とくにがんの超音波 力学療法における細胞傷害時のオートファジー関連蛋白 質 LC-3 と Beclin-1 の変化をアポトーシス関連蛋白質と ともに経時的に定量し，超音波力学療法の治療効果増強 における標的分子候補としての可能性を検討した。
材料と方法
試薬：オートファジー関連蛋白質，アポトーシス 関 連 蛋 白 質 お よ びβ-actin に 対 す る 抗 体（anti-LC3, anti-Beclin-1, anti-Caspase-3, anti-PARP, anti-cleaved Caspase-7, anti- β -actin） は そ れ ぞ れ Cell Signaling Technology 社 よ り 購 入 し た。 ま た，HRP 標 識 抗 マ ウス抗体と抗ウサギ抗体は Vector 社より購入した。
超 音 波 感 受 性 物 質 7,12–bis(1-(2-(2-hydroxyethoxy) ethoxy)ethyl)-3,8,13,17 tetramethyl-porphyrin-2,18- dipropionato]manganese（DEG）は光ケミカル社より供 与されたものを使用した。Saponin from Quillaja bark と FITC 標識デキストランは Sigma 社より，また，Cell Counting Kit-8（CCK-8）は同仁化学研究所よりそれぞ れ購入した。その他の試薬は，細胞培養用か試薬特級の ものを用いた。
細胞：ヒト胃癌細胞株 MKN-74 細胞を用いた。細胞 は DMEM に 10％ウシ胎児血清（FBS）とペニシリン，
ストレプトマイシンを添加した培養液で維持した。培養
オートファジー関連蛋白質の機能解析および 各種疾患における標的
オートファジーの治療への応用チーム（課題番号：117012）
研究期間：平成 23 年 7 月 22 日～平成 26 年 3 月 31 日
研究代表者：芝口浩智 研究員：三角佳生、坪井義夫
液は一週間に 2 度交換を行い，80％コンフルエントに達 したときトリプシン処置により浮遊させ継代培養を行っ た。
超音波照射：超音波照射は Sonitron 1000（Rich Mar 社）を用いて行った。照射条件は 0.5 ～ 1.0 W/cm
2, 50%
duty cycle, 1 min とした。MKN-74 細胞をトリプシン処 置により浮遊させた後，1 × 10
5cells/ml の濃度で PBS に懸濁し，48 穴プレート中に～ 700 rpm で撹拌した状 態で浮遊させ超音波照射を行った。
細胞生存率：超音波照射後，96 穴マイクロプレート に細胞懸濁液 100 µl を移し CCK-8 を 20 µl 添加後，２
～４時間 37℃にてインキュベート，マイクロプレート リーダーにて吸光度（測定波長 450 nm，参照波長 750 nm）を測定した。細胞生存率は，（超音波照射群の吸光 度−バックグランド）/（未処置群の吸光度−バックグ ランド）× 100 で算出した。
フローサイトメトリー：超音波照射後の細胞のデキス トラン取込みと生死の確認は，フローサイトメトリー
（FACS Calibur, BD Biosciences 社 ） に て 行 っ た。
MKN-74 細胞を 1 × 10
5cells/ml の濃度で分子量の異 なる FITC 標識デキストラン（平均分子量は 5000 と 15 万）を含んだ PBS に懸濁，超音波を照射（0.5 W/cm
2,50% duty cycle, 1 min）した後，死細胞をエチジウム ブロマイド（EB）で染色，それぞれ解析した。解析は CellQuest Pro（BD Biosciences 社）を用い FITC に対 する死細胞のドットプロットにて行った。
ウエスタンブロット：超音波照射による蛋白質の変 化はウエスタンブロットにより定量した。超音波照射 後，遠心分離により培養液に交換，72 時間まで培養 し，経時的に PBS にて洗浄後細胞を lysis buffer にて 溶解してサンプルとした。陽性コントロールとして，
2％ Saponin from Quillaja bark に 4 時間暴露した細胞
（Saponin 処置群）と培養液を FBS 不含 DMEM に 24 時間置換した細胞（血清除去群），24 時間非接着状態に 置き人為的なアノイキスを惹起させた細胞（アノイキス 群）をそれぞれ同様に lysis buffer に溶解した。得られ たサンプルは SDS-PAGE にて分離後ニトロセルロース 膜（Hybond ECL, GE ヘルスケアバイオサイエンス社）
を用いて特異的抗体（一次抗体と二次抗体の希釈倍率は それぞれ 1:200 と 1:1000）により反応後，ECL Plus（GE ヘルスケア社）を用いて化学発光させ X 線フィルムに 感光，検出した。それぞれのバンドのシグナル強度は BAS-2000（富士フィルム社）にて画像解析を行い，得 られた数値はβ-actin のシグナル強度を用いて標準化し た。
統計解析：得られた数値データは平均値±標準偏 差とした。解析は統計解析ソフト Prizm（GraphPad software 社）にて行った。二群間比較と多群間比較 はそれぞれ Student's t 検定と一元配置分散分析後に
Dunnett 検定を用いて解析し p < 0.05 を有意差ありと した。
結果
細胞傷害活性：超音波感受性物質 DEG 存在下で超音 波照射を行ったところ，これまで報告してきた通り超音 波照射によって超音波感受性物質からの活性酸素産生に よる細胞傷害が認められた。超音波照射で，強度を 0.5
～ 1.0 W/cm
2に変化させ，細胞傷害活性に与える影響 を検討したところ，照射する超音波強度に依存し細胞を 傷害した。従来の照射条件である 1.0 W/cm
2, 50% duty cycle, 1 min では，超音波照射直後の生細胞は 30％程 度だったが，0.5 W/cm
2, 50% duty cycle, 1 min の実験 条件下では超音波照射直後の生細胞は，超音波単独で 90％，DEG 存在下で 70％であり，これを各種蛋白質量 の定量実験における超音波照射条件とした。この条件下 では，生細胞は超音波照射後 24 時間まで未処置群のそ れぞれ 90％と 70％程度であり，特に増減は認められな かったが，その後超音波単独群では DEG 群に比べ細胞 増殖が亢進した。
超音波照射による穿孔：DEG 存在下，非存在下での 超音波照射（1.0 W/cm
2, 50% duty cycle, 1 min）によ る穿孔をサイズの異なるデキストランの細胞内取込みを 指標に検討した。デキストランの取込みは，超音波の単 独照射と DEG 存在下での照射のいずれの場合でも増加 したが，DEG 存在下での照射でより多く取込まれた。
このとき，EB 染色された死細胞群ではほとんど全ての 細胞にデキストランが取込まれており，一方，照射直後 に EB 染色されず生存している細胞では DEG 存在下，
非存在下での超音波照射による取込みは非特異的なデキ ストランの取込みと同程度であり有意な差は認められな かった。また，今回の実験条件下では生細胞におけるデ キストランの細胞内への取込みは超音波照射の有無にか かわらず平均分子量 5000 のものが 15 万のものより多 かった。その一方で，特に 15 万のものでは DEG 存在 下での超音波照射で増加する傾向は認められたものの，
デキストランのサイズにより超音波照射による細胞への 取込みに有意な違いはなかった。
ウェスタンブロット：超音波非照射（コントロール）
群では，24 時間までアポトーシスとオートファジーい ずれの関連蛋白質にも有意な変化は認められなかった。
一方，陽性コントロール群では，Saponin 処置群と血清 除去群，アノイキス群のいずれにおいてもアポトーシス 関連蛋白質の cPARP の発現増加が確認できた。また，
cCaspase-7 は，Saponin 処置群とアノイキス群では増加 したものの，血清除去群では変化が認められなかった。
オートファジー関連蛋白質の LC-3 は，Saponin 処置群
と血清除去群では増加したが，アノイキス群ではほとん
ど発現していなかった。超音波照射群では，超音波照射
直後で超音波の単独照射を行った単独群と DEG 存在下 で照射を行った DEG 群は非照射のコントロール群に対 してアポトーシスとオートファジーぞれぞれの関連蛋白 質においてその発現量に変化は見られなかった。単独群 と DEG 群のいずれにおいても 24 時間後においては，
cCaspase-7 が照射直後に比べてやや増加する傾向を示 したものの有意な変化はなかった。cPARP では，24 時 間後の単独群においてコントロール群と照射直後の 0 時 間に対して有意な増加が見られた。また cPARP は，
DEG 群では 24 時間まで増加傾向は示したものの有意な 変化はなかった。LC-3 の発現量はいずれの群において も 24 時間には増加する傾向を示し，DEG 群では有意に 高かった。一方，Beclin-1 は発現量が多く群間の差を検 出できなかった。
考察
ここで用いた低出力超音波と DEG の併用によるがん 超音波力学療法における主要な細胞傷害機構は細胞膜の 脂質過酸化と細胞膜流動性の低下によるネクローシスで あるが，今回の検討で，DEG 存在下の超音波照射によ る直接的な傷害を免れた腫瘍細胞では，オートファジー が活性化していることが示唆された。
今回の陽性コントロールの結果から，アノイキス群 ではアポトーシス，血清除去群ではオートファジー，
Saponin 処置群では両者がそれぞれ惹起されており異な る機序での細胞死の陽性コントロールとして有用であっ た。超音波感受性物質と低出力超音波による細胞傷害で は 24 時間まで細胞生存率に変化がなかったが，超音波 照射単独群と DEG 群では照射直後に細胞死を免れた細 胞ではアポトーシスとオートファジーそれぞれ異なる機 序で細胞傷害が起きていることが示唆された。また，
超音波単独群では，アポトーシスは惹起されているも のの DEG 群と比べ細胞増殖の回復が早いことから，低 出力超音波の照射は，治療目的では超音波単独ではなく DEGなど感受製剤の併用が必要であることが示された。
音響キャビテーション現象によるマイクロジェットで の細胞の一過性穿孔が報告されているが，今回の実験条 件ではデキストランの取込みは主に死細胞における非特 異的なものであることが示された。また，超音波照射後 に細胞死を免れた生細胞においてデキストランの取込み に差がなかったことからマイクロジェットによる穿孔は 細胞傷害にほとんど関与しないかあるいは逆に修復でき ないほど大きな傷害となることが示唆された。
今回がんの超音波力学療法において細胞傷害を免れた 腫瘍細胞においてオートファジーの活性化が認められた ことから，オートファジー阻害剤の併用が治療効果増強 に有用であることが示唆された。今後は，さらに他のア ポトーシスとオートファジーの関連蛋白質の変化の検討 を続けるとともに in vitro, in vivo の両実験系において
実際にオートファジー阻害剤併用による細胞傷害の増強 効果の確認が必要と考える。
【研究業績】
論文
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知的財産権
1. 超音波感受性物質を含む腫瘍増殖抑制剤および腫瘍 増殖抑制剤と低出力超音波を用いた腫瘍増殖抑制方 法．芝口浩智，特願 2012-531890.
2. Tumor proliferation inhibitor containing ultrasound- sensitive substance and method for inhibiting tumor proliferation by using tumor proliferation inhibitor and low-intensity pulsed ultrasound. Hirotomo Shibaguchi, Hirofumi Tsuru, US No.14-186.859.
3. 迅速アレルギー検査方法．芝口浩智，安高勇気，二神 幸次郎，特願 2013-025991；PCT/JP2014/053259.
【謝辞】
