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Immunologische Studien über den wasserlös-
lichen Bestandteil des Stuhles bei der bazillären Dysenterie.
I. Mitteilung. Antigenanalyse des Stuhles von einem Komagome-Bm-Ruhrfall (Versuche seitens des
Reaktinogens und des Immunogens.)*)
Von
Akitune KANEDA(金 田 晟經).
Aus dem Bakteriol. Labor. der. Pathol. Abt. des Biol.-Med. Forschungsinstitutes für Ostasien an d. Med. Fakultät zu Nagasaki (Vorstand: a. o. Prof. Y. Aom).
(Eingegangen am 9. März, 1942.)
Angenommen wir haben einen Fall , wo ein Organgewebe von einem pathogenen Keim infiziert ist. Am einfachsten gedacht, kann die Antigenität dieses infizierten Organs aus der vereinigten Antigenwirkung der normalen Ge- webe und des Erregers selbst sowie der von den beiden sezernierten Stoff- wechselprodukte erklärt werden. Man kann aber nicht ohne Weiteres diese Auffassung auf lebende, kompliziert ausgebaute und dazu mannigfaltig in Funktion tretende Zellen anwenden. Das ist selbstverständlich, und es lässt sich hierbei an eine andere Möglichkeit denken, nämlich an die Teilnahme eines in Gefolgschaft der Infektion in dem Gewebe auftretenden neuen Antigens.
Was das Wesen dieses Antigens ist und welcher Vorgang in dem infizier- ten Gewebe sich abspielt, das ist heute noch in Dunkel gehüllt. Es wird daher hier eine Hypothese entwickelt, welche die früheren Untersuchungen über den sog. „ begleitenden Stoff " bei Pocken, Tuberkulose, Mäusetyphus u. a. nach Prof. NAKAMURA"1"", das „ Eiter-Antigen " nach WITEBSKY- KOMIYA"", das „ Sputum-bzw. Käse-Antigen „ bei Tuberkulose nach HIRSZFELD- HALBER(1"(12) sowie DmocHowsid" sinnvoll zu erklären vermag und als Grundlage für die vorliegenden und kommenden Untersuchungen von mir sowie von meinen Kollegen, z. B. über den Darminhalt der experimentellen Meerschweinchen-Cholera von IKEDA, über die Malaria-Blutkörperchen von YAMAGUTI und über die mit dem GÄRTNER-Bazillus infizierten Mäuseorgane von HUKADA — zu dienen verspricht.
Hypothese : das fragliche neue Antigen entsteht teils durch die pathologisch veränderten Organgewebe und teils durch die infolge der Schutzwirkung des Wirts nach Variation umgewandelten Bakterienzellen. Dabei wird das Wort
„ Variation " in einem anderen Sinne als gewöhnlich gebraucht, nämlich nicht ) Mitgeteilt auf der 15. Tagung der Japanischen Vereinigten Mikrobiologischen Gesell- schaft am 6. April 1941 zu Kumamoto.
22 A. KANEDA
im Sinn der Kolonienv,ariation in vitro, sondern im Sinn der unktionellen f Variation in 'vivo und zwar im infizierten Organismus. Man kann, diese Hy‑
pothese weiter ausftihrend, sich noch denken, dass bei den Infektionsvorg ngen die obenerwaihnten beiden Tei]antigene nicht nur von den Gewebssubstanzen bzw. den Bakterienleibsubstanzen se[bst, s̲ondern auch von den Stoffwechsel‑
produkten der beiden lebenden, sich gecgenseitig widersetzenden Zellarten her‑
rtihren : seitens der Bakterien mag eine Umstimmung des Stoffwechsels statt‑
finden, wobei diese r̲, rscheinung nicht nur die Quantitd der Stofflwechselpro‑
dukte ' beeinflussen (z. B. Zu‑ oder Abnahme der Exotoxinmenge hervorrufen), sond̲ern auch die Qualiidt der Produkte ndern eine neue toxische Substanz ( 'sezernieren lassen konnte. )
Bekanntlich lie )crt heute haupts chlich ftir die gerichtliche Medizin oder die Rei'nserologie eine grosse Literatur tiber die Antigenit t der norrr]alen Organe, der Sekrete, der Exsudate und der Exkrete vOr. Die Darlegungen tiber die pathologischen IVlateria]ien treten aber nicht sehr in den Vordergrund und sind auch in ihrer Anzahl ziemlich beschr nkt, wenn wir den Zweck die‑
ser Arbeiten im Nacht 'eis von krankheitsspezifischen Antigenen suchen, mit anderen Worten, wenn lvir in diesen Arbeiten im Wesentlichen den Grtmd‑
versuch ftir die Serodiagnostik finden wolien.
Abgesehen von den inneren Organen, sind Sp̲krete, Exsudate und Exkrete leicht der Gewinnunt)o' zug nglich. Wenn es uns vergdnnt ̲sein sollte, in solchen, aus Krankheitsherden entstammenden K6rperfltissigkeiten das vermutete Antigen sicher und stetig nachzuweisen, wie ntit7,lich wtirde dies Verfahren als eines der Hilfsmittel der Krankheitsdiagnose werden k6nnen T
¥Vas die, wie gesagt, beschr nkte, mit dem Stuhle sich beschaftigende Literatur betrifft, so ergab sich aus meiner Zusammenstellung:
Obwobl BREZINA(s) seinerzeit ermittelt hat, dass im Kote von Hunden gewisse pr zip tino‑
gene, auf einzelne DarmpaJ'tien spezifisch wirkende Substanzen ¥'orhanden sind, gelang es ers‑t 1909 WILENI(o( 5) diese Erkenntnis auf die Menschenpathologie auszudehnen. Er stellte fest, 'dass man mit den Dtinn‑ bzw. Dickdarm‑Kotextrakten bei Erkrankungen bestimmter Darmpartien andere Reaktionen im Kote bekommt als bei Darmgesunden. Dies Abweichen von der Norm war aber bei den Cholerastuhlen nicht beobachtbar, und interessant ist bei Cho]era, dass Pr zi‑
pitation mit Anti‑Menschenserum‑Tierserum keine Niederschl ge erzeugt, was merkwilrdig ist angesichts der Tdtsache, dass im Kote von Enteritis, Darmtuberkuiose, Nephritis usTv. zLlweilen damit ein starker Niederschlag nachweisbar ist (KRAUS und WILF̲NKo)( =*'. Dcch war d:ese Ent‑
deckung lang̲ e Jahre hindurch in Vergessenheit geraten, bis zur Verdffentllchun** d r Abhandlung von LAID, CoNovER and BUTTS in 1923. Sie liessen Harn‑ und Kot.Filtrate tyl)hdser Kranker als Pr zipitinogen gegen das Anti‑Typhusbazillen‑Serum nach der Misr̲hmethode einwlrken, fanden bei 152 Typhuskranken das erwartete Auftreten der Reaktion, und behaupteten daraufhin, dass dasVerfahren eine wichtige Unterlage zur Diagnosestellung bietet. Ferner wiesen sie r]ach, dass diese IVlethode auch im Fall von Paratyphus und Dysenterie je gegen das gleichnamige Anti‑
serum einen positiven.Ausfall gibt. Wo, in Japan, hat die Versuche bald darauf nachgeprtift, dabei wandte er sowohl das von LAID u. a. angegebene Verfahren als auch die gew6hnliche Ringprobe an. Unter 1/ von Wo untersuchten Fallen von Typhuskranken und Typhusgenesenden, '6 von Paratyphus‑, 10 von Ruhrkranken und 7 von Gesunden als Kontrolle gaben nur 5 Falle von Typhus, 3 von Paratyphus, 7 von Ruhr mittels der Ringprobe positiven Ausschlag. Dieser Befund aber sichien ihm nicht voll befriedigend: die Positivitat war zu niedrig, als dass er diese Reaktion als ein diagnostisches Hil.fsmittel zu dienen ftir vtirdig hielt. Die Positivitat nach der LAIDSchen Technik war betrachtlich niedriger als bei der Ringprobe ‑ so achtete er diese letz‑
tere Methode gering.
Immunologi: ‑che Studien ilber den wasserl6slichen Bestandteil des Stuhles. 23
Am nennens̲wertesten in meiner Zusammenstellung ist die kfirzlich erschienene Arbeit von NAKh IURA in der Tohoku‑Universitat. Nach ihm ist der in folgender ¥Veise herg. estellte Extrakt fbr den Zweck der Kotprazipitation zu empfehlen: man reguliert mit 2 HCI die pH der Kot‑
aufs(hwemmung (1g Kot: 5 cc NaCl‑L6s.) in 3.5, erhitzt diese I Std. Iang auf 100'C, zentrifu‑
*‑iert, pipettiert das t berstehende ab und neutralisie̲rt mit 2.'/. NaOH. Diese Pr zipitation wird in iiblicher Weise im Reagenzg']as ad us. de r Ringprobe (6. cmx0.5cm durchgefuhrt. Unter rund 154 Versuchen der Pr zipitation und der Bazi!lenkultivierung an 94 Ruhrkranken und Ruhrver‑
d chtigen hatte er 85 Versuche, in denen die Pr zipitatlon positiv ausfiel, und 36 Versuche, in denen Ruhrbazillen nachgewiesen l 'urden.
lch habe mich auf der oben dargelegten Hypotbese fussend und nach den im hiesigen Laboratorium tiblichen Untersuchungslinien am Studium tiber die antiegfenen Substanzen im Stuhle bazillarer Dysenteriekranker betei]igt, und konnte, erstens vermittels der Komplementbind,u'ng inbezug auf den Nachweis der im Kotextrakt vorhandenelL Antigensubstanzen befriedigende Resultate er‑
zielen (1, und ll. Mitteilung), dann die Nachweismethode zu,m prahtischen Gebra'uch abwa'ndeln 111. Mitteilung) und schliesslich die auf diese Art modi‑(
fizierte Prd ipitationsmethode, ud)nlich ,meine Agar‑Prdzipitation, an zahlreichen Ruhrfit7len erproben IV. Mitteilung). (
Richtlinien der Untersuohungen.
Dass die Ruhrinfektion im Darmkanal sich vor viegend an des̲sen unterem Abschnitt entwickelt, ist der Pathologie seit .langem Lbekannt. Die Beschaffen‑
heit des Ruhrkotes ftihi't uns in erster Linie folgencles Bild vor : Vorhanden‑
sein von Blutserum, von Lymphe, von Blutkdrperchen und L erfall von normalen sowie von pathologisch ver nderten Darmwandgewebszellen ‑ da.ss daneben Nahrungsmittelreste vorhanden sein kiinnen, Iiegt auf der Hand. In zweiter Linie sieht man, als Substanzen bakterieller Herkunft : Iebende und gestorbene Bazillenleiber vom Ruhrerreger ; von der Darmflora haL]pts chlich die Coliba‑
zillen, deren Variationsformen, Abfallstoffe, Stoffwechselprodukte usw. So k6nnen vir uns die im Ruhrkot vork‑ommenden antigenen Sub̲.‑tanzen unz hlig denken. Unstreitig ist aber, dass wir in den von dem Erreger' selbst herrtih‑
renden Substanzen die M6glichkeit besitzen, einen duf den Erregertyp spezifisch reaktionsfahigen Stoff zu fulclen.
In dieser Untersuchung wurden vor allem folgende Substanzen zur Grund‑
lage der Komplementbindung gew hlt : Iel.)ende Bakterien, gekochte Bakterien, Karbolkochsalz‑Extrakt, Koch‑Extrakt, Nukleoproteid, ,, residue antigen," ,, an‑
tigene complet " nach Borvl T(7), toxische Substanz nach KOBAYASI(11), dito nach TAKITA(40) (die obigen sind aus vier Typen von Dysenteriebazillen zube‑
reitet), Serumglobulin, Serumalbumin, Darmkanalgewebe und Colibazillen.
Die Gewinnung von Kot‑Extrakt ftihrte ich nach der Methodik der
TRIBOL LET(1)(i5;( .(='4i(=")'̲Reaktion aus, deren Wesen haupts chlich in der Serum‑
albuminreaktion 7̲u liegen scheint, tmd die als chemisches Verfabren ftir die Beurtei]ung der Darmwandulzeration neuerdings viel Beachtung erfahrt, zum Teil auch dank meiner Vermutung, dass solche ein eiweissreaktionspositiver Extrakt der Komplementbindung zutr glich sein iTauss.
Die Antigenit t des Kotextraktes wurde in e̲rster Linie unter Verwendung
24 A. KANJ DA:
von mit obigen, ihrem Wesen nach bekannten Substanzen hergestellten Im‑
munseren, im Lichte der Reaktinogenwirkung kontrolliert. In vor]iegender, ftir den Zweck der praktischen Anwendung dienender Arbeit, bin ich in den ganzen Versuchen den folgenden Richtlinien nachgegangen. Nur im zweiten Abschnitt dieser Mitteilung und in der nacbfolgenden II. Mitteilung habe ich mir erlaubt, tiber die Hauptlinie hinauszuschiesen und die Antigenit t, noch weitergehend von anderen Gesichtc;̲punkten aus, d.h. seitens der Immunogen‑
wirkung und der Absorbenswirk'ung, zu untersuchen, einzig̲ und allein damit meine Antigenanalyse ins Detail eingehe und festen Grund gew nne. Unstreitig ist dabei, dass man die Immunogenwirkung nach der Komp]ementbindung im System ,, Anti‑Kotextrakt‑Serum +die obigen bekannten Antigensubstan7̲en,"
und die Absorbenswirkung nach der Antikdrperentfernung im komplementbin‑
denden System ,,Anti‑Kotextrakt‑Serum+Kot‑Extrakt " bew'erten kann.
1,aterial und lethodik.
Die Dysenteriebazillenstdmme, die uns zur Herstellung der Reaktionsmaterialien dienten, waren: je ein Stamm Typus Shiga, Typus Komagome‑A, dito B‑In und Fuchfl. ¥Vir haben diese St mme vom Inst. f. Infekt. ‑Krkh. an d. Tokyo‑Univ. bekommen. Es versteht sich, dass die Ty‑
penindividualitat von diesen St mmen biolo*"isch‑kulturell und serologisch sichergestellt wurde.
Die Darstellungsweise der Antigene und der Immunseren, die ftn･ die Komplementbindung in Bereitschaft gehalten wurden:
1) Das losliche Antigen, welches wegen seiner Reaktion a]s das dem lebenden Bakterienleib entsprechende angesprochen wird. Das ist Autolysat in Karbol‑Kochsalzldsung. Eine frische Kultur wird mit Karbol (0.5 )‑Kochsal (0.85 )‑L6sun*" im Verh ltnis 10 mg: I cc abgeschwemmt, 20 Minunten gut gescbuttlt, 48 Std. im Brutschrank stehen ge]assen und etwa 1/2 Std. zentrifu‑
,giert. Die erhaltene klare Fltissigkeit ist das gel 'tinschte Antigen.
2) Der 100'C‑Extvakt. Die Kultur wird mit Kochsalzlbsung im obigen Verhaltnis abgesch‑
wemmt, I Std. bei 100'C gekocht. und zentrifugiert. Man betrachtet den Extrakt,> als das dem g̲ ekochten Ba7‑illenleib entsprec.hende Antigen. Die obigen beiden Extrakte werden bei der Anti‑
kdrperanalyse des Anti‑Ruhrk'ot‑Serum gebraucht. Die antibakteriellen Seren beim Versuch tiber den Ruhrkot‑Extrakt werden nicht mit die*‑en Extrakten hergestellt, sondern in tiblicher Weise mit den lebenden oder gekochten Bakterien.
3) Das Nukleoproteid nach ZlNssER and PARKF]R( T:( ). Die Kultur wird in N/10O‑NaOH aufgeschwemmt, 6 Std. Iang mit Hilfe einer Schtittc'.lapparatur bewegt, irn EisschrJnk' aufbewahrt, mit NaCl im Proz. 0.85 versetzt, nochmals geschuttelt und schliesslich zentrifugiert. Zu de.m Filtrat der zentrifugierten Fltissigkeit sind N/10‑HCI sor "f lti*<･ zuzusetzten. Es bildet sich eine flockende 'Masse d.h. das Rohnukleoproteid. Dieses wird gentigend gereinigt und getrocknet.
Wiederum (5‑6 mal) immunisieren wird Kaninchen mit O.5 /.̲L6sung desselben, in der Weise:
0.1 subkutan, 0.1, 0.2, 0.2, 0.3 und 0.3 je i. v. (im Falle von Shiga)' oder 0.3, 0.5, 0.75 und 1.0 je i. v. (filr die anderen).
4) ,. Residue antigene " nach ZINssER and PARKERl T)(4 ,. Die tiberstehende Fltis̲sigkeit bei der Nukleoproteid‑Entfernung wird 3 mal mit Filterpapier filtriert. Wird das Filtrat 2 Std. Iang g̲ekocht, so bildet sich ein Niederschlag. Der durch Zentrifugierung niederschlagfrei gemachte Fltissigkeitsteil wird mit dem 9‑fachen Volumen von absolutem Alkohol versetzt. Die sich bilden‑
de Flockmasse wird noc.hmals in Aq. dest. geldst, mit Alkohol ¥vieder *"efallt. Die Alkoholf llung wird noch einmal ausgeftihrt, und die so gereinigte Antigensubstanz zur Konservierung getrock‑
net. Zur Immunisierung benutzten wir 3 ‑L6sun*", wobei die Impfung mit Schlepper 6 mal in 4 tagigem Abstand ausgefuhrt lvurde, um die Immunogenfunktion dieser Substanz ru aktivieren.
0.4 cc Antigenl6sung+0.1 cc Schweineserum, 0.8+0.2, 1.2+0.3, 1.6+0.4 und .0+0.5. Man muss die Mischl6sung 2 Std. Iang bei 3rC stehen lasse.n, ehe man s. ie jedesmal intraven6s anfuhrt.
5) Die spezifsch‑toxische Substanz nach KOBAYASI( l). 100 gl von der luf O 5 .. Trauben
rmmunologfsc.he Studien ilber den wasserl6slichen Bestandtell des Stuhles. 25
zuckeragar gLrt ausgewachsenen Kultur werden in 500 cc Aq. dest. suspendiert, 3 Std. Iang kr f‑
tig geschtittelt, 2 Std. Iang im Wasserbad bei 60'C di*'eriert (oftmals geschuttelt), ze̲ntrifugiert, und der tiberstehende Teil filtriert. Nac.hdem man das mit Toluol tiberschichtete Filtrat in einenl Zellophanbeutel dialysiert hat, wird die Medium‑pH durch Zusatz von N/iO‑HCl in 2.5 reguliert und die doppelte Menge Aceton hinzugeftigt. Es bildet sich eine flockende Masse. Man l sst das Reagens*"las im Eisschrank tibernachten, das Flock‑ende in 50 cc Aq. dest.
zergehen und mit HCI und Aceton nochmals fallen. Nach 5‑f ltiger Wiederholung der Aufl6sung‑
F llung wird der Niederschlag 3‑mal mit Aceton und einmals mit Aether ausgewaschen, getrock‑
net und konserviert. Immunisierun* . 0.25 cc von 0.2 ‑Ldsung subkutan, dito intraven6s, 0.3 i.v., dito i. v. und 0.35 i. v.
6) ,, Antig ne complet " nach BomN(7). Eine Mischungvon Bakterienauf̲schwemmung (100mg:
1 cc)+N/2‑Trichloressigsaurel6sung zu gleichen Teilen wird mit Hilfe der Schilttelapparatur kr ftig bewegt. Nach Stehenlassen im Eisschrank wird sie zentrifugiert und der tiberstehende Teil in einem Zellophanbeutel dialysiert. Wenn der Trichloressig davon frei geworden ist, wird der Dialysator mit Bk‑.RKEFELD‑N filtriert und das Filtrat mit der 3‑fachen Menge von absolutem Alkohol versetzt. Es bildet sich ein Niederschlag. Man trennt ihn durch Zentrifugierung ab und wiederholt die Aufl6sung in Aq. dest. und die Alkoholf llung, bis die Aq. dest.‑L6sung nie‑
derschlagfrei bleibt (gew6hnlich 3‑4 Mal). Der letztmalige Niederschlag wird mit ‑ lkohol und mit Aether aus*"ewaschen, getrocknet und konservip̲rt. Immunisierung. 0.3 cc von 0.5 ;‑L6sung, 0.5, 0.8, 1.2, 1.5 und 2.0, jedesmal intraven6s.
7) Die toxische Substanz nach TAKITA(40). Man tut 50 cc Bouillon von pH 7.2 in einen Zellophanbeutel und lasst ihn in einen, mit besonderer Sorgfalt angefertigten ERLEN'MEYER‑Kolben mit weiterem Grund eingehen, der zuvor mit 100 cc Bouillon beschickt ist. Nachdem man den Wattepropf angesetzt hat, sterilisiert man in fraktionierter Weise bei 100'C, impft die Ruhrbazillen auf die Bouillon im Zellophanbeutel tiber und l sst 4 Tage lang im Brutschrank stehen (die Kulturdauer beruht auf der Erfahrung von HUKIJDA im Bakteriol. Inst. der hiesigen Fakult t)̲
Man nimmt die Bouillonkultur aus dem Zellophanbeutel heraus, Iasst sie in Einzelmengen von je 6 cc in Zentrifugerohrchen eingehen und zentrifugiert kraftig (tiber 6000 Minutendrehungsge‑
schwindigkeit) 2 Std. Iang. Wenn die Bakterien fast vollst ndi*‑ davon beseitigt sind, gibt man Toluol unter Umschutteln in den tiberstehenden Teil der Flilssigkeit, behufs der Abtdtung der Bakterien und zugleich der Konservierung* der Ausbeute. Immunisierung. 0.5cc, 0.75, 1.0, 1.5 und 2.0 intraven6s.
8) Geformte Blutbestandteile (Erythro‑ und Leukozyten). Das entfibrinierte Menschenblut wird mit NaCl‑L6s. sehr grtindlich ausgespillt und in die NaCl‑Lds. im Proz. 20 gebracht. Wir immunisierten mit je 4 cc dieser Aufschwemmung am 1., 3. und 6. Immunisierungstage.
9) Albumin‑ und Globulinfraktion des Menschenserums(2 ). Durch Halbs ttigun*" des Serums mit Ammonsulfat und durch Zentrifugierung wird das Serumglobulin in geflopktem Zu‑
stande gewonnen. Aus der tiberstehenden Fltissigkeit fallt HCI das Albumin aus. Es wird dar‑
auf durch Zehtrifugierung aus dem Medium isoliert. Die beiden Substanzen werden in NaCl‑
L6s. gelost, in einen Zellophanbeutel gebracht und *‑e*"en str6mendes Wasser 2 Tage lang dialy‑
siert. Einzeldosis der Immunisierung cc. Es wird 4 Mal injiziert.
10) Darmgewebe. Filr die Extraktion wendete ich die Sigmoideus‑Gegend des unteren Darmabschnitts einer Tuberkulosekranken und einer Gesunden an. Die Materialien wurden mir vom Pathol. Inst. der hiesigen Fakult t freundlichst zur Verftigung * estellt. Der Epithelteil wird vom Muskel‑ und Fetteil abgetrennt. Nach m̲ehrmaligem Auswaschen mit NaCl‑L s. wird er im M6rser frei zerrieben, die 5.‑fache Tenge NaCl‑L6s. hinzugeftigt, 4 Std. Iang mit Hilfe der Schttel‑
apparatur kr ftig extrahiert, und behufs Entfernung ungel6ster Substanzen scharf (mit Schnell‑
zentrifuge, 3 Std. Iang) zentrifugiert. Mit der so pr parierten opalisierend getrtibten Fltissigkeit wurde das Immunserum gewonnen, indem ich Kaninchen damit dreimal immunisie̲rte (1.0, 1.5 und 2.0 cc von der Stammlosung).
11) Kot‑Alttigen. Es stammt aus den Dyse̲nteriekranken namens IKED̲ L, YAMANE und AKIT' sl sowie aus einem Gesunden namens KANEDA. Die Probestucke der Kranken 1 rurden am 3. oder 4. Krankheitstage entnommen. Sie zeigen sowohl die ftir den Dysenteriestuhl charak‑
terische Beschaffenheit a]s auch die stark‑positive TRIBoULET‑Reaktion, und enthalten m ssig den Erreger (Y̲A lANE und IKI".DA ‑ Tv. pus Komagome Bul, und AKITOSI ‑ T̲vpus Schmitz). Man taucht 6 cc vom blutig.schleimigen Ruhrstuhl oder den daumenspitze̲ngrossen Gesunde.nkot in
26 A. KA EDA
30 cc Aq. dest., vermischt und l sst 6 Std. Iang bei 52=C, ste̲hen (oftmals krafti'*' ges̲chuttelt).
Der tiberstehende Teil bei der Zentrifugierung ist das̲ Kot‑Antigen. Als Extraktionsmittel nahm ich daneben die l TaCl‑L6s., die NflO‑NaOH‑L6s. und die 10‑fache Ess̲i s ureldsung in Verwen‑
dung und konnte der Aq. dest. den Vorzug geben. Das Anti‑Ruhrkot‑Serum w'urde mit dem YAMANE‑Anti 'en in der folgenden Weise hergestellt: 1. Einspritzung 0.3 cc Antigeh+0. cc NaCl‑
Lds., . Einspr. 0.0' Antigen, 3. 0.75, 4. 1.0 und 5. 1.5, intravends̲ in zeitlichen Abst nden von je 4 Tagen; das Kaninchen wird nach der letzten Einspritzung entblutet und c]as Serum unter Zusatz von Karbol 0.5+ konserviert.
Reaktionsm ethodik :
Die Anti, ･en‑Antikdrper‑Reaktion mit den obigen Materialien wircl in diesl'̲er und in der nachfolgenden TVlitteilung̲ nicht mittels der praktisch‑zweckm ssigeren Pr zipitation, sondern mit‑
tels der Komplementbindung ausgeftihrt, aus zwei Gr nden : einmal die ausgezeichnete Empfindlichkeit und zugleich die g'enaue Ablesbarkeit der I¥"omplementbindung, bei lvelch(･r man mit r]ur geringer Menge von Antiserum und Komplement die Reaktion durchfuhren kann. Die Ergebnisse verden sich auf meine weiteren Mitte̲ilungen tibertragen lassen. Was nun nattirlich in Frage kommt, ist die Identitat der beiden Reaktionen. Aus unserer t g]ichen Erfahrung, be‑
sonders auf Grund der neucsten, umfangreichsten, Feld und Phdse der Prdzipitation behandeln‑
den Arbeit von Sn.lIZLT':; ) aber k‑ann man sagen, dass die I̲dsun '+ dieser Frage in ihren g'rossen Ztigen als̲ erreicht betrachtet l¥ erden darf.
Meine Komplem,entbindungsmethode wurde nach ^'1[assgabe deT sog. AntigenverdiinnuJl'gsme‑
thode durchgefahrt. Die Gebrauchsdosis del' Antiseren kann man au,s de'n Nachschlagebfichern erfahren, aber es eru'eist sich hei Ineinem Fall als n(jtig, ul?te" Veru;endung der 7tdchstht'he7'en Dosierung derselbe̲n die Nebe7lreaktit'itdt ･md lichst ge?7au zu erlnitteln. Untereitig ist auch die Notwendigkeit, die Gebrauchsdosis der A7?tisere'n im Voraus festzustellen. Aus den Untersuch‑
ungen erg(1b sich, dass das 1()‑fach. verdeinnte Antiserum am besten an‑'uspreche'n scheint.
I,n eine Reihe t'017 Rdhrchen ftb,･t 7nar2 je 0.2cc Antiscrum 7nit zunehmenrjer A onzentrati(̲jn, dazu kommt je O̲ .2 cc Komplement I : 15. Nach Bindung bei 31 'C wdhl‑elld Z Std. u;i'rd je 0.4cc einer Mischung t'or' Ziege'nblutkdrpe7 chen‑AufschlJ'emmlJn̲!' ul'd des entspre'chenden A,mbczeptors hinzugegeben und nach 2(;eiterem halhstiindigen I"eru'eilen bei . 7'C wio(J das Ergebnis abgelesen.
Die Abstufun,gen heint Ablesen. der einzelnen Rbhrchen iiber die ganze U1ltersuchungsdauer siud wie folgt : ‑ omplette Hdlnolyse, dl fast komplette Hdmolys(?, + mdssige Hdimolyse, Hrh Spur‑
Hdmolyse, ‑}} keine Hdmolyse.
VorversUche.
i J x
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ABP SABP
o o
; l och‑E
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,1
Fig. I.
Antik6rpergehalt der lrr!!'uneerer*
Fuc hu Shigs Roma‑ A R oEla‑ B
SABP SABF xtraJ te
: L sjA B P S A B P S A B F
(D ̲ H
Nuk eoprote
a,4‑F:
,Is 4'I
;:･, cD 1:
SA8P ide SABP SABF Sf.B'P SABE
R08idue antigens Antigene
Es bed:eutet: S.. . .Shiga, ..Koma‑A, B.. . .Yo l;a‑B und A..
. . . .Fl chu ,
F
Reaktionsspezifitdt der t'on 7nir hel estellten An,ti "ene und der Antiseren.
Ehe ich meine Hauptversuche ausftihrte, muss‑
t(･ i('h in erster Linie die typent pezifische Reak‑
tion 'f higkeit der vom I azillenleib stammenden Antigen(i und der Antiseren Eeststellen. Unstreitig ist r̲lurch die Kreuzversuch̲e cler Agglutinatio]1 und der A,hfglutininabs ttigung bereits festgestellt wor‑
dt>n, das . einerseits die Ausgan'h"‑ssttimme cler Dysen‑
t( l'i(>ba/.illen immunologisch sich s̲elbst ndig verhal‑
ten, und dass ferller die Anti‑19azillenleil)‑Ser(>n‑
sowohl die mit den nativen Bazille̲n a]s auch die mit den gekochten hergestellten‑jedes f'iir sich je einen selb. s'̲tindigen Reaktion, stoff enthaltc･n.
Die c /egenseitige 13eziehung zwischen den ¥'on den 4 St mmen stammendr,n Koch‑Extrakten, den Nukleoproteidfraktioncn und den ,,residue anti‑
gens " ist in 'Fiho'. I veransc'haulicht. Die spezifische Antigenit t der Substanzen d. h. die Re'aktions̲fahig. ‑ keit mit den '*"leichnarr]ig'en Antiseren macht sich bemerkbar; be̲ ' onders die ‑Spezifitat der req̲idue antigens ist m chti,*.‑ und exqui ̲it; die Koch‑ und
Immunologische Studien tiber den wasserl6slichen Bestandteil des Stuhles 27
Nukleoproteidantigene disponieren zu unspe7‑ifischer Reak‑
tionsfahigkeit, was s. ich in der gemeinschaftlichen Reaktlol ftir Smc.A, Koma‑A und Koma‑B zeigt.
Hier wird nun die weitere Frage erhoben, in welcher Beziehung die dreierlei to.xischen Substanzen d.h. die Sub‑
stanzen nach de̲.r Methode von KORAYASI, von BOIVlN und von TAKITA, beztiglich der Antigenit t im Reagenzglas ge‑
genseitig stehen. Inbezng auf df r L6sung( n dartibeT' gibt Fig.
II Aufschluss. Jede hat einen besonderen Charakter; die einzelne toxische Substanz wird ¥'orl dem Hauptfaktor beherr‑
scht und ¥‑om Nebenfaktor beil uh g beeinflusst. Es ist aber an er Nebenredktion erl¥‑enntlich, dass das BolvlN‑
und TAI<rrA‑Toxin cinerseits untereinande̲r innig verbunden sind und nur dds Toxin von KOBAYASI etwas weiter ent‑
fernt mit ihnen ¥erwandt ist. Bei der Retrachtungf meiner Daten im folgenden Hauptversuche muss man das Ver‑
lvandtschaftsverh ltnis aleser Antigene imrner in Erlv gung Chemische Reaktionen der Antigensubstanzen.
Tabelle T zeigte die Farben‑ und die Fallungsreaktion mit Eiweiss‑, Arninos ure‑ und Kohlehydrat‑Reagenzien. Die Zweck : ers‑tens der Feststellung der Wesens¥'erschiedenheit rung der Richtigkeit meiner Herstellunh"stechnik, unter schaften nach dem originalen Schrifttum. Man kann Eigenschaften zweier Substanzen von verschiede.ner der Dinge lirb･'t; die̲ BedeuLung der chemischen Reaktionen
Fig II.
Gegonseitige Beziohung der dreierlei toxischen substanzen.
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dL) : (:)4D oa HO to :: i : o eo ' (!) ; ; !o:s as"a'o;' c' 4"o;:,80:' .o r';' OQ /) ;'; a > H at > f4 a ')HH oo(s h +' Q :1 hT JJ (a) :! h 4D ol: oE 'z;'t: ::) 1:; l o pH; ;'toD ooc :so "
An 8epon'
h obaya 8hi Boi n )aki ta
ziehcu.
der von mir he̲rgestellten Antigene Ergebniss̲e dienen einem doppelten deTSelben; zlveitens der Beweisftih‑
Vergleichung mit den chemischen Eigen‑
keinen Unterschied zwischen den chmischen Typenherkunft feststellen, was in der Natur liegte in der Ves‑ens¥'erschiedenheit
TABELLE I. TABELLE II.
Extrakte
chem. Reaktion '
¥ ¥ Sulf osalicvl Biulet Millon
Diazo (EHRLICH) Schwef elblei Nitroprussidna.
Xantho protein MOLISCH
l 1CCI <C < C) ‑(/
* c:S c:S< ; ‑ ::S (:1<‑* '* cF ‑ C S j i : *
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Halbs ttig. Amm, Vollsattig. Amm.
Sulf osalicvl Biulet lviillon
Dia7,0 (EHRI.IcH) Schwef elblei Nitroprussidna.
Xanthoprotein MoLrscrl
TRIBoL 1.'‑+T
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der Substanzen, nicht in der Typendifferenzierung.
Der zweite Teil des Vorversuches befasst sich mlt den Kot‑A,ntigenen. Die Dlagnose der darau̲s isolierten Dysenteriebazillen wurde biologischkulturell und serologisch sichergestellt : Stamm YAMANE und IKEDA Sind Ruhrbazillen Typus Komagomp‑Bnl, und Stamm AKITosl‑Typus SCHMITZ.
Die Reaktion n]it den chemischen Reagenzien sind in Tabelle 11 ersichtlich. Die Reaktionen verlaufen nicht gleichermas̲sen in den Krankenmaterialien einerseits und in dem Gesundenkotan‑
tigen anderel'seits; dieser ergibt negative Reaktion gegenuber der Halbs ttigung mit Ammonsul‑
fat, Biuret‑, Nitroprussid‑ und MouscH‑Reagenz, im Gegensatz zum positiven Ausfall von jenen,
28 A. KANEDA:
TRlBoul.ET‑Reaktion: YA¥.,IANE(+h), IhCED i +), AKITosl 4rF und K l EDA )
lla,u ptversuche.
Die Kotantigene YAIIAN'E und IKEDA, deren Erregertypus Komagome‑
Bm ist, habe ich als Hauptmaterial ange vandt und das typenfremde Dysen‑
terieantigen AKITOSI sowie das vom gesunden Menschen stammende Antigen KANEDA Zur Kontrolle benutzt. Wie bekannt lasst sich die Wertscbatzung der Antigenitat einer Substanz und besonders deren Erforschung im Lichte der Antigenanalyse von drei Seiten in Angriff nehmen, n mlich seitens der Substanz als Reaktinogen, als Immunogen und als Antik6rperabsorbens. Wir machen uns immer diese drei Beobachtun*aslinien zum Prinzip, woftir die Arbei‑
ten von NAITO(='o), von AoKI( ;, von AoKI‑OBI‑TANAKA'*)', von AoKI‑ANN‑AoKI( t) usw. gute Beispiele bieten.
Komplementbindung der bereits bekannten Immunseren mit den Kotan‑
tigene;n (Analyse des Antigens als Reaktinogen.)
Verf. bringt in diesem Abschnitt das Protokoll einer Komplementbindung, die unter Benutzung der von ihm in Bereitschaft gehaltenen Immunseren be‑
kannter Herkunft und von Kot‑Extrakten die Analysierung der in den letzteren vorhandenen Substanz bezweckt. In Tabelle 111 sind die ausgeftihrten Reak‑
tionen tibersichtlich angegeben. Die beigeftigte Komplen]entbindungsreaktion 'der Seren mit ihrem eigenen, dem Immunogen entsprechenden Antigen bildet eine wichtige Unterlage zur Beurtei]ung der Ergebnisse der Kot‑Materia]ien.
Zuerst wollen wir tiber die Reakton des Antigens YAMANE Sprechen. Am 'st rksten reagiert es mit dem Antiserum Koma‑B‑Bazil]enleib (sowohl der lebenc]e als auch der gekochte), Colibazillen, Serumglobu]in und Blutkdrper‑
chen, m ssig mit dem Antiserum Koma‑A‑Bazillenleib, Koma‑B‑Nukleoproteid, dito KOBAYASI und dito Boivin, und gar nicht oder nur in geringem Grade mit dem Al tiserum von SHIGA‑ und Fuchfi‑Pr parat und von Darmgewebe.
Dic anderen Seren stehen unter den m ssig reagierenden Seren. Die Reak‑
tion des Serums IKEDA, dessen Bazillentypus dem des YAMANE‑Anti**ens gleich ist, zeigt im Grossen und Ganzen Para]lelismus mit der YAMANE‑Antigen‑
Reaktion.
Man kann lediglich insofern einen graduellen Unterschied feststellen, dass das Anti‑Globu]in‑Serum mit dem Antigen YAIVIANE St rker reaktionsf hig als mit dem IKEDA‑Antigen ist. Dies ist merkwtirdig, weil die Verhaltnisse der Intensitat der TRmoULET‑Reaktion. Auch das Antigen AKrrOsl, dessen Er‑
regertypus dem der Antigene YA IANE oder IKEDA ungleich ist, ruft mit diesem Serum starke Komplementbindung her'vor. An dieser Stelle muss ich an die TRIBoULET‑Reaktion von drei Antigenen: YAMANE (++), IKEDA (+) und AKI‑
TOsl (+++) erinnern. Es hat also den Anschein, als wichen die hier erzie]ten serologischen Erfolge etwas von dem ab, was bisher tiber das Wesen dieser Reaktion durch die chemische Methode bekannt wurde. Wie in dieser Tabelle ersichtlich ist, war die Reaktion mit dem Anti‑Albumin‑Serum unerheblich.
Das vom Ruhrkot Typus SCHMITZ stammp̲nde Antigen AKITOSI verh lt
Immunologische Studien廿ber den wasser1δslichen Bestandte量l des Stuhles・ 29
TABELLE III．
＼ Antigen
Hau聖）tversuch Kontrollversuch
Antiserum
（10。fach）
YAMAN巨 丁 IKED入 ｝ ㌔ 蓋KITosl l KANEDA
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二一二一引・28
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sich verschieden obigen beiden durch die Reaktioll mit，dem Anti−Ruhrbazillen・
leib，und dem Anti・Ruhrbazillellleibsu1）stanz−Serum． Des Fehlens der von dem ScHMITz−Bazi11en stammenden Antiserumreihe halber kann ich die Entstehung der Reaktionsspezi6tat zwar vermuten aber nicht gena日feststellen，was sehr bedauerlich ist． Die Emiedrigung der Reaktivitat gegenUber der Koma。B．
Serumrelhe，besonders die Erschδpfung dersel卜）en gege面ber dem Serum
，，residue antigene un（I dem Serum BolvIN・Toxin−die typenspezinsche Reak・
tionsf試higkeit der letzteren belden ist schon in （ien Vorversuchen festgestellt worden一一悟sst aber diese Vermutung aufkommen．
Die Reaktion mit den Antiseren von den Serumeiweissen wurde bereits erw議hnt．Wir haben ledoch die Frage mch dem Allti−Blutkδrperchen・Serum
30 A. KANEDA:
noch offen gelassen. Das Serum hat schlecht mit der Serumeiweis̲sreaktion tibereinstimmende Resultate ergeben : das Antigen AKrrosl ruft mit dem Blutkdrperchen‑Serum intensive Komple̲mentbindung hervor, dagegen die bei‑
den anderen halten den Reaktionswert niedrig. Die Reaktion der Kot‑Extrakte mit dem Anti‑Blutk6rperchen‑Serum hat anscheinend nichts mit der TRIBOULET‑
Reaktion zu tun, da sie dem Blutkdrperchengehalt im Kot parallel geht. Die Komp]ementbindung des von einem normalen Material stammenden Antigens KANEDA hat den Erwartungen vollaus entsprochen. Keine Seren, die aus Dysenteriebazi]len sich auf]oauen, kommen damit zur Reaktion. Es reagierte auf das Colibazillen‑Serum intensiv, auf das Serum ¥'om gesunden Darmgewebe m ssig und auf das Anti‑Globulin‑ oder Anti‑Blutk6rperchen‑Serum in geringem Grade.
lch habe ftir al]e ¥,rersuche in diesenl Abschnitt sowohl die 10‑fach als auch die 20‑fach verdtinnten Serummaterialien benutzt. Es ist aber hier nur das Ergebnis tiber die 10‑facher^ Sere̲n aufgeze.igt, das es mir zuverl ssige Er‑
gebnisse geliefert hat.
Versuche der Erzeugung komplementbindender Antik6rper im Tierk6r‑
per (Analyse des Antigens als Immunogen oder Analyse der Antik6rper im Anti‑Kotextrakt‑Serum.)
Nun hat hier der Vors‑ch]ag gemacht ¥verden konnen, dass es sich zur L sung der Frage, ob jeder einzelne im obigen Versuch fraktionierte Antigen‑
faktor des Kotex traktes dem Antigen im Sinne des Vo]lantigens ¥virklich ent‑
spricht, empfehlen wiirde, durch Immunisierung mit dem Kot‑Antigen den den einzelnen Fraktionen entsprechendcn Ant,ikdrper zu erzeu en. Wir m6chten im folgenden tiber Versuche berichten, die zur Beantwortung dieser Frage
TABELLE I V.
Antiserum I Kontrouversuch
Hauptversuch (10‑f.) ̲̲YA 'iANF;,Ko' Y, MANF'iKbt orm. Kaninchen
I¥iTr. I Nr. 2
Antigen ,HC¥2 OQC C¥ 'HCY coc¥2 oo rfC¥2 POQ CC¥ ¥ rfCf ̲ C) oo c¥2
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.. Koma‑A Koma‑B :
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Immunologische Studien tiber den wasserl6slichen Bestandteil des Stuhles̲. 31
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+
YAMAME‑KOt ++ ++f +H +++ +}} ++ ++ +++ +++ +f} ++} ++
+‑‑
von uns angeste]It worden sind. Zu diesem Zwecke stellt ich z vei Antis̲‑eren vom Kot‑Extrakt YAMANE her, und ftihrte mit denselben ‑ dazu wurde ein normales Kaninchenserum als Kontrol]e mit einbegriffen ‑‑ geb"entiber bereits ihrem Wesen nach bekannten 9 Antigenl6sungen die Komplementbindung durch. In Tabelle IV sind die Ergebnisse eingetragen. Zu diesem Versuch sind Bazi]lenleib‑Extrakte anstatt der Bazillenleib‑Antigene angewandt worden, was nichts anderes als auf der Arbeit von OBI(=>3) begrtindet ist. Ferner muss ich hier hinzuftigen, dass die Antiseren in der Verdiinnung I : 9 zur Reaktion benutzt wurden. Ausser dass die komp]ementbindende Fabigkeit des Serums Nr. I intens̲iver a]s die des Serums Nr. 2 ist, verhalten sie sich beztiglich des Zutagetretens der Reaktion nach den Antigenarten ganz gleich in allen Nummern.
Sie reagieren sehr stark mit Colibazillen‑Extrakt, Serumglobulin, stark mit Koma‑B‑Kochextrakt, dito Nukleoproteid, Blutkdrperchen und m ssig mit Koma‑A‑Extrakt, ,,residue antigene," KOBAYASI‑TOxin und BorvlN‑Toxin.
Demgegentiber reagiert das Kontroll‑Serum so schwach mit einigen Antigenen;
dass es als praktisch bedeutun ".̲slos gewertet werden kann. Der Befund deckt sich in allen Punkten mit den Ergebnissen bei der Analyse der Reaktinogen‑
wirkung des Kot‑Extraktes. Deshalb kann angenommen werden, dass sdintliche antigene Substanzen im Ruhrkot‑Extrakt auch als Immunogen aktiv sind. Noch darf dazu gesagt werden, dass die Ergebnisse in diesem Abschnitt einerseits zur Erhd, twag meiner analyiischen Anschauung dienen und andererseits die Vollantigenitdt der einzelnen analysierten Fak"toren feststellen.
In diesem Versuch is.̲t die Reaktion gegentiber den beiden Serumehveiss‑
:32 A. KANEDA:
Antigenen sehr beachtenswert. Aus dieser Reaktion ersieht man, dass das Verhaltnis ,,Globuljnreaktion : Albuminreaktion " eine lveitgehende Aufklarung erfahren hat. Man darf ganz allgemein sagen, dass ‑ im Falle von Ruhrkran‑
ken ‑ das Serumglobulin in der vom 1 lutserum stammenden, in den Darm transsudierenden Flljssigkeit (dem sog. Darmsaft) im Mittelpunkt steht.
Zusammenfassung der llrmitt,elungen.
1) Verf. hat sic'n der Aufgabe unterzogen, irgendeinen auderen spezifisch‑
antigenetischen Faktor ausser dem Erre lerleib im Wasse'rextrakt des Stuhles von Dysenteriekranken zu suchen. Zu diesem Zweck wurde ein analytisches Studium haupts chlich bei einem Ruhrkotfalle eingehend durchgeftihrt, wonach die Komplementrbindung bald des Kotextraktes mit einer Reihe von Immun‑
seren bekannter Herkunft, bald des Anti‑Ruhrkotextrakt‑Serums mit einer Reihe von bekannten Antigenen erfolgte.
2) Die obenerw hnten, zur Analyse bereit gehaltenen Materialien sind : Dysenteriebazillen oder deren Autolysate und Kochextrakte, deren Nukleopro‑
teidfratronen deren ,,residue antlgens " (die obigen sind vom SHIGA, Koma‑A, Koma‑B un Fuchti‑Typus hergestellt), die toxische Substanz des Koma‑B‑
Typus nach der Methode von KOBAYASI, dito nach Bol¥'1N, dito nach TAKITA, das S̲erumglobulin, das Serumalbumin, die Blutk6rperchen, das gesunde Darm‑
gewebe und das Tuberkulose‑Darmgewebe.
3) Im Vorversuche wurde festgestellt; (a) der aus dem Stuhle des Pati‑
enten namens YAltlANE geztichtete Ruhrbazillus ist der Erreger ,vom Typus Komagome‑Brn, (b) zur Gewinnung des Kotextraktes eignet sich die 6 Sid.
lang dauernde Aq. dest.‑Digerierung bei 52'C, (c) Verf. bekommt mit dem Extrakt bei Erkrankten andere chemische Reaktionen als bei Gesunden ; jener ergibt Biulet, Nitroprussidnat,rium, MOLISCH ulid TRIBOULET ( + ), im Gegensatz (‑) zu diesem, und (d) die Antigenit t und die chemische Reaktionsfahigkeit der von den Dysenteriebazillen herkommenden Pr parate unter Anziehung der Eigenschaften nach dem originalen Schrifttum sind voll befriedigend, auch die Typenspezifit t bei den von den 4 Typen s̲tammenden Extrakten hat sich gut gehalten.
4) Der Versuch zeigt sowohl seite'ns der Reakti,nogenwirkung als auch se'itens der Immunog"enwirkung, dass im Kotextrakt des Patienten namens YAlviANE die thermostabile Koma‑B‑Leibsubstanz, die Colibazillensubstanz, das Serumglobulin, die Blutho perchen, das Koma‑B‑Nukleoproteid, die Toxinsub‑
stanz nach KOBAYASI und nach Bol¥rlN enthalten sind. Die Ana]yse ist aber mit den vom Verf. bereit geha]tenen Materialien, d. h. in einer begrenzten M6glichkeit durch.gefuhrt worden. So hat der E̲inwand gemacht verden k6nnen, dass es sich allerdings nicht immer um eine Erzeugung aller analy‑
sierbaren Teilantigene handele. Fussend auf diesen Ergebnissen, m6chte der Verf. in der nachfo]genden Mitteilung die Erforschung der Antigene seitens des Absorbens ausftihren und der Ana]yse weiter entwickeln.
.5) Die Reaktion des Ruhrkotextraktes gegentiber dem Anti‑Globulin‑
Immunologische Studien iiber den wasserldslichen Bestandteil des Stuhles. 33
Serum iSt merklich intenSiv und z¥ ar lauft sie mit der Intensitait der TRIBOULET‑
Reaktion gleich, was darauf hinzudeuten SCheint, daSS das Wesen der TRIBOULET‑
ReaktiOn nicht au,f dem in den Darm transsudier nden Serulnalbumin beruht, sondern auf de7n Serumglobulin.
LiteraturverZeichnis.
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