試料から直接,25(OH) 濃度を測定できる試薬キットが日常検査法として一般に普及している.25(OH) 濃度は, 血中 25(OH) の総量 ( すなわち,25(OH)2 + 25(OH)3 の総和 :Total 量として算出 ) として定量されている. 一方, 25(OH) 測定については, 体

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はじめに

　ビタミン D は小腸，腎臓および骨におけるカルシウム代謝調節に必要な脂溶性ビタミンである．1α, 25- ジヒドロキシビタミン D（以下，1α, 25（OH）2D）の働きは小腸，腎臓および骨におけるカルシウム代謝調節作用であり，その血中濃度はカルシウム濃度と副甲状腺ホルモン（PTH）によって調節を受け，ビタミン D 栄養状態を反映しない．ビタミン D を考えるには，食事摂取量と皮膚産生量の総和を反映する 25- ヒドロキシビタミン D（以下， 25（OH）D）の血中濃度が有効な指標とされる．　食事から摂取されたビタミン D（植物性食品由来の D2 と動物性食品由来 D3）は，小腸リンパ本幹で吸収されカイロミクロンに取り込まれ肝臓へ輸送される．また紫外線 B 波によって皮膚で合成されたビタミン D3もビタミン D

結合蛋白質（vitamin D binding protein：DBP）と結合して肝臓へ輸送され，肝臓で 25 位が水酸化される．生成した 25（OH）D（血中半減期は 2 ～ 3 週間）は，体内需要に応じて腎臓で水酸化され，活性型の 1α, 25（OH）2D に代謝される（血中半減期は 4 ～ 6 時間）．活性型ビタミン D は核内ビタミン D 受容体に結合して，ステロイドホルモンとしての生理的作用（カルシウム代謝，がん細胞の増殖抑制とアポトーシス）を惹起する．血中半減期の長い 25（OH） D が体内蓄積量を反映し，1α, 25（OH）2D は骨代謝の指標としてこれまで広く用いられてきた．　近年，ビタミン D の代謝状態の評価には 25（OH）D 濃度測定の有用性が数多く報告され1）-4）_{，海外ばかりでなく} わが国においても 25（OH）D 濃度測定が注目されるようになった5）_{．体外診断用医薬品として 25（OH）D 濃度測定キッ} トが 2015 年 4 月に製造販売承認が取得され，2016 年 8 月よりビタミン D 欠乏症の診断の補助として保険適用され，ようやくわが国においても検査料の点数取り扱い項目として実臨床での使用が可能となった．　本稿では，ビタミン D 代謝物の検査項目として知られている血中 25（OH）D 濃度について，保険適用の概略なども含めてその濃度測定と評価について概説する．

25（OH）D 濃度の測定

（表 1）6）-8） 1．測定の目的　一般的には，25（OH）D はビタミン D 栄養状態の判定， 1,25（OH）2D は生体内のカルシウム代謝調節を知るうえで有用と思われる．特に，高カルシウム血症，低カルシウム血症，高リン血症，低リン血症，くる病・骨軟化症の診断と鑑別診断を行う際に測定が必要となる．近年，25 （OH）D 濃度測定により，ビタミン D 欠乏や不足の可能性を除外することは，骨粗鬆症診療には重要となってきている． 2．測定法　25（OH）D 測定は，試料を測定前に有機溶媒で抽出，簡易カラムまたは高速液体クロマトグラフィー（high performance liquid chromatography：HPLC）で精製し， DBP などの干渉成分を除去する方法が一般的であったが，この方法は労力を要することから 25（OH）D 測定を自動化し簡便に測定する方法が長らく望まれていた．最近では

三浦雅一　佐藤友紀

北陸大学薬学部生命薬学講座臨床解析学分野

骨粗鬆症の診断と治療における

25- ヒドロキシビタミン D 測定の意義

(2)

がある．2016 年 8 月より 25（OH）D として保険適用（CLIA 法）となった，あるいは現在申請中，あるいは開発中の 25 （OH）D 測定試薬キットもそれぞれの測定試薬キット専用の全自動免疫測定装置による簡便かつ短時間で高感度に測定可能な免疫測定法である．　一方，日常検査法としてわが国ではあまり汎用されていないが標準法（reference method）として，液体クロマトグラフ質量分析技術を用いたタンデム型液体クロマトグラフ質量分析法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry：LC-MS/MS 法）を用いた測定も可能となり，各代謝物を特異的に測定できることも可能となっている（25（OH）D2と 25（OH）D3の定量解析が可能）．最近では，主要な LC-MS/MS による質量分析システムに対応した ready-to-use の LC-MS/MS キットもある．また，微量なアイソトープをラベルしたビタミン D 誘導体を生体内に注入し，尿中ビタミン D 代謝物質を定量化することで生体内でのビタミン D 動態を検出できるアイソトープ希釈法 / オンライン固相抽出液体クロマト試料から直接，25（OH）D 濃度を測定できる試薬キットが日常検査法として一般に普及している．25（OH）D 濃度は，

血中 25（OH）D の総量（すなわち，25（OH）D2＋ 25（OH）D3

の総和：Total 量として算出）として定量されている．一方， 25（OH）D 測定については，体外診断薬メーカーがアメリカ食品医薬品局（Food and Drug Administration：FDA）への 510（k）申請と承認（clearance）取得を行っているため，わが国でも厚生労働省への体外診断用医薬品の製造販売承認申請および保険適用申請が行われている（表 1）．　25（OH）D 測定法としては，DBP を利用した競合性蛋白結合性分析法（competitive protein binding assay： CPBA 法），抗体を利用した各種免疫測定法として放射免疫測定法（radioimmunoassay：RIA 法），酵素免疫測定法（enzyme immunoassay：EIA 法），化学発光免疫測定法（chemiluminescent immunoassay：CLIA 法），化学発光酵素免疫測定法（chemiluminescent enzyme immunoassay：CLEIA 法），電気化学発光免疫測定法（electro-chemiluminescence immunoassay：ECLIA 法）

CPBA：competitive protein binding assay, RIA：radioimmunoassay, EIA：enzyme immunoasaay, CLIA：chemiluminescent immunoassay, CLEIA：chemiluminescent enzyme immunoassay，ECLIA：electro-chemiluminescence immunoassay, LC-MS/MS：liquid

chromatography-tandem mass spectrometry．（筆者作成）

表 1　血中 25（OH）D 濃度の各種測定法（2016 年 9 月現在） CPBA RIA EIA CLIA CLEIA ECLIA LC-MS/MS オリジナル法（LSI メディエンス） Diasorin 25[OH]D125 I RIA

（DiaSorin：代理店セティ・メディカルラボ） 25（OH）-Vitamin D direct day

（Immunodiagnostik：代理店コスモバイオ）などリエゾン®_{25 水酸化ビタミン D トータル} （協和メデックス）

ARCHITECT®_{Vitamin D（アボットジャパン）} ADVIA Centaur Vitamin D（シーメンスヘルスケア） Access 25(OH) Vitamin D Total （ベックマン・コールター） Lumipulse®_{G 25-OH Vitamin D（富士レビオ）}

IDS-iSYS 25-Hydroxy Vitamin D（IDS） Elecsys®_{Vitamin D total}

（ロシュ・ダイアグノスティックス） Biocrates®_{Vitamin D kit}

（BIOCRATES：代理店キコーテック）試験研究目的（オリジナル法でキット化されていない）試験研究目的試験研究目的体外診断用医薬品製造販売承認済・保険適用開発中体外診断用医薬品製造販売承認申請中体外診断用医薬品製造販売承認申請中開発中試験研究目的（国内では未発売）体外診断用医薬品製造販売承認申請中試験研究目的測定法測定キット名（メーカー）など備考

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グラフィー / タンデム質量分析（isotope dilution/online solid-phase extraction liquid chromatography/tandem mass spectrometry：ID-XLC-MS/MS）法などより精度の高い分離分析法も薬物動態学／ファーマコキネティクス（pharmacokinetics：PK）分野では使用されている．　表 2 と図 1 には，新規に保険適用となった CLIA 法による 25（OH）D 保険適用の概要（表 2）と全自動化学発光免疫測定装置「リエゾン®_{XL」による測定試薬キット「リエゾ} ン®_{25 水酸化ビタミン D トータル」の測定原理（図 1A）と} 装置外観（図 1B）を示した．本測定法の特徴としては，測定範囲は 4 ～ 150 ng/mL（10nmol/L ～ 375nmol/L），検体必要量 25μL，測定時間は 1 検体あたり 35 分の処理能力を有している． 3．測定のための試料と注意点　25（OH）D 濃度の測定試料としては，血清もしくは血漿を用いる．日内変動はなく，食事（食後）などの影響も少ない．生理的変動して，日照時間の影響で季節的変動を伴うので注意が必要である．25（OH）D は，夏に高く，冬図 1　「リエゾン®_{25 水酸化ビタミン D トータル」の測定原理（A）と装置外観（B）} D D D D D D ①磁性微粒子に結合した抗25水酸化ビタミンD抗体を添加すると，25水酸化ビタミンDはその結合蛋白質から解離してこの特異抗体に結合する． D-D D D D D D ②次にビタミンDとイソルミノール誘導体の結合体を添加すると，未結合部分に結合する． D-D D D D D D D D D D D D ③洗浄サイクルで遊離している未結合試薬を除去する． D-④スターター試薬を添加し，イソルミノール誘導体を発光させ，光電子増倍管により光信号を相対発光強度 (RLU)として測定する．光信号は25 水酸化ビタミンD濃度と反比例する． D-A B （協和メデックス社内資料より引用）（協和メデックス社内資料より引用）表 2　「リエゾン®_{25 水酸化ビタミン D トータル」の保険適用} の概要測定項目測定方法主な測定目的点数保険収載月検査料の点数の取扱いについて区分 E3（新項目） 25- ヒドロキシビタミン D 化学発光免疫測定法（CLIA 法）血清中の 25- ヒドロキシビタミン D 濃度の測定（ビタミン D 欠乏症の診断の補助） 400 点 2016 年 8 月 25- ヒドロキシビタミン D は，区分番号「D007」血液化学検査の「57」1, 25- ジヒドロキシビタミン D3の所定点数に準じて算定する．本検査は，CLIA 法により，ビタミン D 欠乏性くる病もしくはビタミン D 欠乏性骨軟化症の診断時またはそれらの疾患に対する治療中に測定した場合にのみ算定できる．ただし，診断時においては 1 回を限度とし，その後は 3 カ月に 1 回を限度として算定する．

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Force」による 25（OH）D 濃度の解釈例（表 3A）10）_，および厚生労働省のホームページに掲載されている「厚生労働省　統合医療に係る情報発信等推進事業　統合医療情報発信サイト」（「統合医療」情報発信サイトは，厚生労働省「統合医療」に係る情報発信等推進事業に基づき，患者・国民及び医療者が「統合医療」に関する適切な情報を入手するために構築されたホームページ（http://www.ejim.ncgg. go.jp/pro/overseas/c03/17.html）に公開されている 25 （OH）D 濃度（表 3B）をそれぞれ示す．参考基準範囲（基準値）については，地域や季節，患者の健康状態，食事，年齢，民族性，ビタミン D サプリメントの使用，あるいは環境により異なる可能性がある．各施設において独自の基準値設定が望まれる．　薬剤の影響として 25（OH）D では，市販のビタミン剤の大量服用などでは高値を示す．消化性潰瘍治療薬の腸内リン結合薬（アルミニウム製剤），抗痙攣薬（カルバマゼピに低い，同様の理由で，居住地の緯度により差異があり，高緯度居住者は低値傾向を示す．このような日照時間の影響による生理的変動は，25（OH）D で顕著に反映されるので注意が必要である． 4．測定データ判読，基準値と薬剤の影響9）　25（OH）D の基準下限値は，おおむね 10ng/mL 前後に設定されている．基準下限値未満は，骨軟化症をきたすビタミン D 欠乏症（成人では骨軟化症，小児ではくる病）と診断される．一方，100 ng/mL 以上ではビタミン D 中毒症と診断される．また，25（OH）D 測定値が基準値範囲内であっても低値の場合，ビタミン D 貯蔵量が不十分な非充足状態のことがあり，このような状態をビタミン D 不足（insufficiency または inadequacy）と呼んでいる．表 3 には，参考までに Holick らにより報告された「Clinical Guidelines subcommittee of the Endocrine Society Task

（厚生労働省ホームページ「統合医療」情報発信サイト［http://www.ejim.ncgg.go.jp/pro/overseas/c03/17.html］より改変引用）表 3　25（OH）D 濃度の解釈例欠乏不足充足上限ビタミン D 状態＜20 20∼＜30 30∼100 ＞100 25（OH）濃度範囲（ng/mL）＜50 50∼＜75 75∼250 ＞250 25（OH）濃度範囲（nmol/L）一般に健常者が骨と全般的な健康を維持するのに十分であると考えられている．最新のエビデンスによると，このような高濃度，特に 150 nmol/L （60 ng/mL）を超えると，有害な影響をもたらす可能性がある． A 健康状態 30 未満 30 ∼ 50 50 以上 125 超 25（OH）濃度範囲（nmol/L） 12 未満 12 ∼ 20 20 以上 50 超 25（OH）濃度範囲（ng/mL） B ビタミン D が欠乏しており，小児ではくる病，成人では骨軟化症を引き起こす．（欠乏状態）一般に健常者が骨と全般的な健康を維持するには不足していると考えられている．（不足状態）（文献 10 より作成）

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ン，フェノバルビタール，フェニトイン，プリミドン），コレスチラミン，糖質コルチコイド，イソニアジド，リファンピシンにより低値を示す場合がある．　このため，25（OH）D 測定前後の患者指導として，総合ビタミン薬（ビタミン D 製剤を含む）などの服用の有無を確認しておくことを推奨される．

25（OH）D 濃度測定の評価

　25（OH）D 測定は，ビタミン D 欠乏症の診断および鑑別診断には必須である．ビタミン D は，25 水酸化酵素により体内で急速に代謝を受け 25（OH）D に変換されるが，それ自体は生理活性をほとんどもたない．ビタミン D 自体は代謝や脂肪組織への移行などにより血中濃度が大きく変動するため，一般にはあまり測定されない．主にその代謝物が測定されるが，特に 25（OH）D はその状態を反映するので，ビタミン D の代わりに測定され，欠乏症などの栄養状態の診断にも用いられる．　通常ビタミン D は DBP と結合して血中を循環し，最終的には胆汁中に排泄される．このため，肝疾患などによる胆汁分泌低下や，25 水酸化酵素の活性低下により低値になることがある．また，ビタミン D は脂溶性のため，胆汁分泌不良では吸収障害のため低値となる．ビタミン D の作用は血中のカルシウム濃度上昇にあるため，ビタミン D 不足により，小児ではくる病，成人では骨軟化症をきたす．種々のビタミン D 代謝異常症の正しい診断には 25（OH）D 測定を行わない限りは不可能である． 1．ビタミン D 欠乏症とビタミン D 不足の場合　25（OH）D の測定が体内のビタミン D の充足状態を最も正確に反映するものとして，近年，その測定の重要性が世界的に注目を浴びている11）_{．ビタミン D 欠乏症の診断} では，25（OH）D 測定値により行うことが重要であり12）_，保険適用の意義は大きい．　ビタミン D 不足は，下肢運動低下などの関連も示唆されており，骨折の原因ともなる転倒との関連性も示唆されている13）_{．すなわち，25（OH）D のビタミン D 不足によ} り荷重骨の骨折率が有意に高く，QOL を低下されることから，ビタミン D を補う必要性も指摘されている．また，ビスホスホネート薬の薬物治療においては単独群に比較して活性型ビタミン D3薬投与群では（エビデンスがあるのはアレンドロネートとアルファカルシドールの併用），単独群で新規骨折とベースライン時の危険因子との関連とをみると，椎体骨折では既存椎体骨折数と BMD，非椎体・荷重骨の骨折では BMD と 25（OH）D が関与し，活性型ビタミン D3薬併用により有意な改善が認められると報告されている14）15）_．　さらに，近年ではビタミン D 不足が，糖尿病，動脈硬化，感染症，がん，サルコペニア，フレイルなどの種々の疾患や病態と関連していることも示されている． 2．くる病・骨軟化症の場合　日本小児内分泌学会ビタミン D 診療ガイドライン策定委員会より「ビタミン D 欠乏性くる病・低カルシウム血症の診断の手引き」として，すでに 25（OH）D 測定の意義が公表されている．ビタミン D 欠乏症の判定における 25 （OH）D 濃度については，20 ng/mL：50 nmol/L 以下（15 ng/mL：37.5 nmol/L 以下であればより確実）と報告されている． 3．高カルシウム血症を呈する場合　天然型ビタミン D の過剰摂取で起こる古典的ビタミン D 中毒症では，25（OH）D 濃度は高値を示す．悪性腫瘍による高カルシウム血症の 25（OH）D 濃度は，ほとんど変化が認められない． 4．骨粗鬆症の場合　米国では，股関節骨折を起こす高齢者のうち，血清 25 （OH）D 濃度が 12 ng/mL：30 nmol/L 未満の人が半数にものぼっている可能性がある16）_{．また，69 歳以上の女} 性を平均 4.5 年間にわたり追跡調査した大規模試験では，ベースライン時の 25（OH）D 濃度が低め（20 ng/mL：50 nmol/L 未満）でも高め（30 ng/mL：75 nmol/L 以上）でも脆弱化のリスクが増加することが観察されている17）_．　一方，国内における臨床研究では，25（OH）D 濃度低値と骨粗鬆症性骨折の関連を示した報告が複数存在する．大腿骨近位部骨折のために入院した 50 人の平均血清 25 （OH）D 濃度は 17.8 ng/mL であり，対照群の非大腿骨近

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　今後は，わが国においても 25（OH）D 測定は全自動免疫測定装置を用いた測定法が中心となると思われ，試薬メーカーの違いによる測定キットの測定間是正のためにも標準化作業の結果が待たれる．

今後の課題

　全自動免疫測定装置による 25（OH）D 濃度測定は，LC-MS/MS 法により測定された 25（OH）D 濃度と有意な相関を示すものの，25（OH）D2との反応性以外にも健常人と比較して測定試薬キットによっては妊婦，透析患者，集中治療患者ではその値に差があることも報告されている8）_．その違いは，血中の DBP 濃度の違いによるものであり，今後，25（OH）D の測定結果を解釈する場合，測定方法を慎重に考慮する必要がある．このため，わが国においても 25（OH）D 測定の標準化が一刻も早く行われることが待たれる．　ビタミン D 欠乏症はくる病以外にも，骨粗鬆症などの多因子疾患や現代社会においてはまれではなく，その診断のための 25（OH）D 測定は重要であり，再認識する必要がある．また，ビスホスホネート薬の薬物治療においては，活性型ビタミン D3製剤併用の有用性が確認され，その薬物治療の適正使用のためにも 25（OH）D 測定は有用である．さらに，骨粗鬆症患者では 25（OH）D 濃度測定は，ビタミン D 不足による骨折・骨密度低下のリスクが高い患者の選択にも使用できるものと思われる．このため，25 （OH）D 測定については，骨粗鬆症での早期の保険適用の実現化を目指す必要がある．文　献

1） Holick MF, Binkley NC, Bischoff-Ferrari HA, et al : Guidelines for preventing and treating vitamin D deficiency and insufficiency revisited. J Clin Endocrinol Metab 97 : 1153-1158, 2012

2） Shea B, Wells G, Cranney A, et al ; Osteoporosis Methodology Group and The Osteoporosis Research Advisory Group : Meta-analyses of therapies for postmenopausal osteoporosis. VII. Meta-analysis of calcium supplementation for the prevention of

位部骨折入院患者 53 人の 25.8 ng/mL より有意に低値であったことが報告されている18）_{．また，大腿骨近位部骨} 折で受診した 225 人の平均 25（OH）D 濃度は 16.3 ng/mL であり，同時期に新規椎体骨折で受診した 64 名の平均 25 （OH）D 濃度 18.1 ng/mL より有意に低値であったとの報告がある19）_{．さらに，整形外科を受診した未治療閉経後} 女性 330 人において 25（OH）D 20 ng/mL 未満群では，20 ng/mL 以上群と比較して有意に既存椎体骨折が多い20）_との報告，閉経後日本人女性 202 人を対象とし，既存骨折「あり」群での平均濃度は 25（OH）D 14.6 ng/mL であり，「なし」群に比して有意に低値であるとの報告21）_がある．　これまでの結果からも骨粗鬆症患者での 25（OH）D 濃度測定は，ビタミン D 不足による骨折・骨密度低下の高リスク群の検出に臨床的有用性が高いと思われる．成人における骨粗鬆症の補助診断（ビタミン D 不足による骨折・骨密度低下のリスクが高い患者の選択）として，25（OH）D 濃度測定の意義は大きい．

25（OH）D 測定の標準化

　日本臨床化学会栄養専門委員会および日本ビタミン標準化協議会などが中心となって血清 25（OH）D 濃度測定の標準化作業が行われている22）_{．欧米にて治療に使用される} ビタミン D2に由来する 25（OH）D2に対する反応性の不足が報告されたことにより，アメリカ臨床化学会（American Association for Clinical Chemistry：AACC）から LC-MS/ MS を基準測定操作法として測定系の標準化が提唱された．現在，アメリカ国立標準技術研究所（National Insti-tute of Standards and Technology：NIST）で製造された血清材料をベースとした Standard Reference Material

972（SRM 972）標準品を用いて 25（OH）D2と 25（OH）D3濃度について LC-MS/MS での値付けが行われている．一方，標準法とされる質量分析法や一部の免疫測定法において，特に幼児に高濃度で存在するとされる 3-epi-25（OH） D（C-3 epimer of 25-hydroxyvitamin D3 3）への交差反応性の問題が指摘されている23）24）_{．ビタミン D 栄養の正確な} アセスメントには，これらを分別し，特異性および正確性に優れた測定法を基準測定操作法として制定することが求められている．

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postmenopausal osteoporosis. Endocr Rev 23 : 552-559, 2002

3） Tang BM, Eslick GD, Nowson C, et al : Use of calcium or calcium in combination with vitamin D supplementation to prevent fractures and bone loss in people aged 50 years and older : a meta-analysis. Lancet 370 : 657-666, 2007

4） Boonen S, Lips P, Bouillon R, et al : Need for additional calcium to reduce the risk of hip fracture with vitamin d supplementation : evidence from a comparative metaanalysis of randomized controlled trials. J Clin Endocrinol Metab 92 : 1415-1423, 2007

5） Nakamura K, Tsugawa N, Saito T, et al : Vitamin D status, bone mass, and bone metabolism in home-dwelling postmenopausal Japanese women : Yokogoshi Study. Bone 42 : 271-277, 2008

6）上田哲也 , 若林弘樹 , 三浦雅一 : ビタミンの測定法の進歩 . 検査と技術 35 : 647-653, 2007

7）三浦雅一 : ビタミン D の分析 . ビタミン D と疾患（岡野登志夫編）. 医薬ジャーナル社 , 大阪 , 2014, p33-39

8） Heijboer AC, Blankenstein MA, Kema IP, Buijs MM : Accuracy of 6 routine 25-hydroxyvitamin D assays : influence of vitamin D binding protein concentration. Clin Chem 58 : 543-548, 2012

9）三浦雅一 : 25-OH ビタミン D. 薬の影響を考える　臨床検査値ハンドブック（木村　聡，三浦雅一編）. じほう , 東京 , 2012, p88

10） Holick MF, Binkley NC, Bischoff-Ferrari HA, et al : Evaluation, treatment, and prevention of vitamin D deficiency : an Endocrine Society clinical practice guideline. J Clin Endocrinol Metab 96 : 1911-1930, 2011 11） Kuwabara A, Tsugawa N, Tanaka K, et al : Improvement

of vitamin D status in Japanese institutionalized elderly by supplementation with 800 IU of vitamin D3. J Nutr

Sci Vitaminol 55 : 453-458, 2009

12） Okazaki R, Sugimoto T, Kaji H, et al : Vitamin D insufficiency defined by serum 25-hydroxyvitamin D and parathyroid hormone before and after oral vitamin D3 load in Japanese subjects. J Bone Miner Metab 29 : 103-110, 2011

13） Nakamura K, Saito T, Okama M, et al : Vitamin D sufficiency is associated with low incidence of limb and vertebral fractures in community-dwelling elderly Japanese women : the Muramatsu Study. Osteoporos Int 22 : 97-103, 2011

14） Orimo H, Nakamura T, Fukunaga M, et al : Effects of alendronate plus alfacalcidol in osteoporosis patients with a high risk of fracture : the Japanese Osteoporosis Intervention Trial （JOINT）-02. Curr Med Res Opin 27 : 1273-1284, 2011

15） Shiraki M, Kuroda T, Miyakawa N, et al : Design of a pragmatic approach to evaluate the effectiveness of concurrent treatment for the prevention of osteoporotic fractures : rationale, aims and organization of a Japanese Osteoporosis Intervention Trial （JOINT） initiated by the Research Group of Adequate Treatment of Osteoporosis （A-TOP）. J Bone Miner Res 29 : 37-43, 2011

16） Cranney A, Horsley T, O’Donnell S, et al : Effectiveness and safety of vitamin D in relation to bone health. Evid Rep Technol Assess （Full Rep） 158 : 1-235, 2007

17） Ensrud KE, Ewing SK, Fredman L, et al : Circulating 25-hydroxyvitamin D levels and frailty status in older women. J Clin Endocrinol Metab 95 : 5266-5273, 2010 18） Sakuma M, Endo N, Oinuma T, et al：Vitamin D

and intact PTH status in patients with hip fracture. Osteoporos Int 17：1608-1614, 2006

19） Sakuma M, Endo N, Hagino H, et al: Serum 25- hydroxyvitamin D status in hip and spine-fracture patients in Japan. J Orthop Sci. 16：418-423, 2011

20） Ikegami S, Kamimura M, Uchiyama S, Kato H：Women with insufficient 25-hydroxyvitamin D without secondary hyperparathyroidism have altered bone turnover and greater incidence of vertebral fractures. J Orthop Sci 16： 573-580, 2011

21） Yamauchi M, Kaji H, Nawata K, et al : Role of parathyroid hormone in bone fragility of postmenopausal women with vitamin D insufficiency. Calcif Tissue Int 88：362-369, 2011

22） Ihara H, Hirota K, Miura M, et al : National Institute of Standards and Technology SRM 972 as a reference material for serum total 25-hydroxyvitamin D measurements. Int J Anal Bio-Sci 2 : 1-6, 2014

23） Singh RJ, Taylor RL, Reddy GS, Grebe SK : C-3 epimers can account for a significant proportion of total circulating 25-hydroxyvitamin D in infants, complicating accurate measurement and interpretation of vitamin D status. J Clin Endocrinol Metab 91 : 3055-3061, 2006 24） Lensmeyer G, Poquette M, Wiebe D, Binkley N : The

C-3 epimer of 25-hydroxyvitamin D3 is present in adult