財団法人 骨粗鬆症財団主催
第
46
回
教育ゼミナール講演会記録
講演/ 1 ─────────────────────────────1内分泌代謝異常に伴う骨粗鬆症の病態とその管理
島根大学医学部内科学講座内科学第一杉本利嗣
講演/ 2 ───────────────────────────── 6骨質を考慮した骨疾患モデルの形態解析
新潟大学超域研究機構網塚憲生
第 46 回骨粗鬆症財団教育ゼミナール講演 I
内分泌代謝異常に伴う骨粗鬆症の病態とその管理
島根大学医学部内科学講座内科学第一杉 本 利 嗣
は じ め に 加齢に伴う生理的な内分泌変化として性ホルモン系の抑制（menopause，andropause），成長ホルモ ン-IGF-I 系の抑制（somatopause），副腎系の抑制（adrenopause）などがあげられ，加齢に伴う骨減少 に関わっていることが知られている。骨粗鬆症は原発性と続発性に大別されるが，後者をきたす代表 例に内分泌代謝異常に伴うものがあげられる。ホルモン過剰症としてクッシング症候群，原発性副甲 状腺機能亢進症，慢性腎不全に伴う続発性副甲状腺機能亢進症，甲状腺機能亢進症，そして欠乏症と して性腺機能低下症，成人成長ホルモン（GH）欠損症などがある。また近年グルココルチコイド（GC） 服用（外因性クッシング症候群）に伴う骨粗鬆症は，臨床上の大きな問題と認識されてきている。この ように内因性，外因性あるいは生理的，病的を問わず内分泌系の異常は骨代謝に多大な影響を及ぼす。 一方，代表的代謝疾患である糖尿病においても，1 型はもちろんのこと，最近 2 型においても骨折危 険度が高まっていることが明らかとなってきている。さらに近年骨・血管連関，すなわち骨粗鬆症と 動脈硬化/血管石灰化さらには脂質代謝異常に密接な関連が存在することが注目されてきている。そこ で本稿では，内分泌代謝異常に伴う骨粗鬆症の病態生理とその管理について概説する。 1 内分泌異常 1）原発性副甲状腺機能亢進症 血清 Ca 濃度測定がルーチン検査として普及して以来，本症は高率に発見されるようになり，現在 では非常に頻度の高い内分泌疾患と認識されるようになった。わが国では，2,000～3,000 人に 1 人の 頻度と推計されており，男女比では 3：1 と女性に多くみられ，特に中高年女性に多い。近年，本疾患 は無症候性で発見される頻度が高いが，このような例においても皮質骨優位の骨密度低下をきたして いることが多い。そして軽症例においても骨折危険度が高まっており，これを適切に診断し，病的副 甲状腺の摘出術を行うことにより，骨折危険度の低減が得られるとのエビデンスが蓄積されてきてい る。術後の骨密度の推移に関する著者らの検討より，軽症例においても著明な骨密度の上昇が期待で きる結果を得ている1,2)（図 1）。以上を踏まえて，米国 NIH の手術適応に関するガイドラインが 2002 年に改訂され，手術適応基準が拡げられている3)。また軽症例の保存的治療法として，ビスフォスフォ ネート製剤の有効性が証明され，第一選択薬に位置づけられている。またラロキシフェンに関するエ ビデンスも蓄積されつつある。 2）クッシング症候群（内因性，外因性） 従来より内因性 GC 過剰をきたす代表的疾患であるクッシング症候群では，著明な骨代謝異常がみ られることが知られている。GC 過剰では海綿骨優位に障害を受けると認識されているが，著者らの pQCT 法を用いた前腕骨の骨形態の検討より，クッシング症候群の患者の骨は細くかつ薄くなってお り，皮質骨もかなりの障害を受けるものと考えられる。一方，本疾患では GC 過剰の解除によりこの 異常が著明に改善することより，GC 過剰の骨代謝異常はかなりの reversibility が期待できる。しかし外因性 GC 過剰，すなわちステロイド内服患者の大部分では原病の治療のため，内服持続が余儀な くされる。そして従来問題視されていなかった少量内服例においても早期から骨折危険度が高まって いることを示す結果が蓄積されつつある。すなわちプレドニゾロン（PSL）換算で 2.5mg/日以下の投 与例でも椎体骨折危険度が有意に上昇していることや，PSL 換算で 2.5mg/日以上投与例では投与後 3 ～6 ヵ月で骨折危険度が最大限に高まっていることが報告されている。著者らの PSL 投与後早期の骨 代謝マーカーの縦断的検討でも，投与開始後 1 週間以内に著明な骨形成と骨吸収のアンカップリング が起きていることを示す結果を得ている。一方，ステロイド服用患者では骨密度に反映されない骨脆 弱性の亢進が存在するため，骨密度低下を認めない例でも骨折危険度が高まっている。PSL5mg/日以 上を 6 ヵ月以上服用した女性例において，ROC 解析を用いて種々の測定部位での椎体骨折の骨密度カ ットオフ値を求めた著者らの検討でも，非投与女性では腰椎と前腕でそれぞれ young adult mean （YAM）の 71％と 72％であるのに対し，ステロイド投与例では YAM の 80％と 89％であり，後者で 明らかに高値を示した（図 2）4)。このようなエビデンスを踏まえて，米国，英国，加国，豪州などか らステロイド性骨粗鬆症の管理ガイドラインが策定，改訂されるに至っている。そしてわが国でも日 本骨代謝学会において名和田らにより 2005 年管理と治療のガイドラインが公表された5)。すなわち経 口ステロイドを 3 ヵ月以上使用中あるいは使用予定を管理対象とし，既存脆弱性骨折あるいは治療中 新規骨折あり例，またなし例においても骨密度が YAM の 80％未満例，そして YAM の 80％以上例で も PSL 換算で 1 日投与量が 5mg 以上例を治療対象としている。1990 年代末よりステロイド性骨粗鬆 年齢（歳） 80 70 60 50 40 30 20 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 年齢（歳） 80 70 60 50 40 30 20 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 年齢（歳） 80 70 60 50 40 30 20 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 骨密度 腰椎 大腿骨頸部 橈骨 （g/m2） 椎体骨折（－）， 椎体骨折（＋） 図 2 グルココルチコイド服用女性患者における脊椎圧迫骨折の有無での骨密度の比較 （文献 4 より改変） * p＜0.01 vs ベースライン 0 5 10 15 20 25 30 0 6 121824 36 48 60 72 観察期間（ヵ月） 5 10 15 20 25 30 6 12 18 24 36 48 60 72 0 * * * * * * * * * ** * * * * * * * 0 橈骨骨密 度の変 化率 （％） 腰椎骨密 度の変 化率 （％） 図 1 原発性副甲状腺機能亢進症女性患者における副甲状腺摘出術後の骨密度の推移 （文献 2 より改変）
症に対するビスフォスフォネート製剤の著明な骨折防止効果が次々と報告され，一次予防と二次予防 における有効性が立証されている。以上をふまえて，いずれのガイドラインにおいても薬剤の第一選 択薬はビスフォスフォネート製剤である。最近のステロイド性骨粗鬆症例におけるメタ解析で活性型 ビタミン D3製剤の椎体骨折防止効果が示されていること，そしてわが国における 2 年間の縦断検討で ビタミン K2の椎体骨折防止効果を示すエビデンスがあることより，わが国のガイドラインではこの 2 剤が第 2 選択薬としてあげられている。 3）成人 GH 欠損・不足症 小児の GH 欠損症のみならず，成人においても骨減少そして骨折危険度が高まっていること，そし て成人 GH 欠損例に対する GH 補充の有効性が明らかとなってきている。また著者らの検討では，加 齢に伴う GH 分泌能の減少と，これに伴う血中 IGF-I と IGF 結合蛋白-3（IGFBP-3）の低下が骨量な らびに骨強度の低下に密接に関連していることを示す結果を得ている6,7)（図 3）。さらに GH 分泌の相 対的低下が示唆される血中 IGF-I 低値を示す骨粗鬆症女性に対する GH 補充の検討より，かなりの骨 量増加が期待できる結果を得ている8,9)。海外においても最近，骨粗鬆症に対する GH 治療の有効性が 見直されてきており，今後の臨床応用への展開が期待される。 2 代 謝 異 常 1）糖 尿 病 1 型糖尿病においては骨量低下と骨脆弱性の亢進が存在することはよく知られている。一方，2 型糖 尿病においては，骨量については一定の見解が得られていないが，骨折危険度が高まっていることが 明らかとなってきている10)。著者らの 2 型糖尿病例における骨折閾値の検討でも，男女ともに椎体骨 折の腰椎骨密度のカットオフ値が明らかに高い（表 1）。治療面においても，2 型糖尿病例におけるビ スフォスフォネート製剤の有効性が報告されてきている。 GH 下垂体 肝臓 骨 IGF-I＝IGFBP-3 加齢 GH分泌能↓ 血中IGF-I↓ IGFBP-3↓ 骨量↓ 骨脆弱性↑ GH 図 3 成長ホルモン（GH）の骨に対する作用様式と加齢によ る影響（文献 6，7 より改変） 表 1 2 型糖尿病女性患者と対照女性における脊椎圧迫骨折の有無での腰 椎骨密度の比較 カットオフ値 （g/cm2） T score（％） 感度 （％） 特異度 （％） Control 群 0.716 －2.66（71） 74.8 74.8 DM 群 0.810 －1.83（80） 66.5 66.5
2）動脈硬化症，脂質代謝異常症 近年，骨粗鬆症と動脈硬化・血管石灰化に密接な関連が存在することが注目されてきている。すな わち骨密度と動脈石灰化の程度や動脈硬化指数との間に負の相関があること，そして骨量減少度や既 存骨折の存在と脂質代謝異常や心血管イベントの発症率/死亡率にも関連があることが数多く報告さ れている。しかし動脈硬化の原因となる脂質代謝異常と骨粗鬆症との関連性については不明であった。 われわれはこの関連性を検討する目的で，閉経後女性において血中脂質値と骨密度の関係について重 回帰分析を行った。その結果，総コレステロールや LDL コレステロールと骨密度に有意の負相関，そ して HDL コレステロールと骨密度に有意の正相関が存在する結果を得た11)。この結果は高 LDL 血症 および低 HDL 血症は動脈硬化のみならず骨量減少を促進する可能性を示唆する。これに一致して，in vitro でも酸化 LDL の骨芽細胞分化阻害作用が報告されている。一方，高脂血症，特に低 HDL 血症を きたす危険因子である体脂肪増加は骨量に保護的に働くことが知られているが，高 LDL 血症は女性で は非肥満者にもよく合併する。実際，われわれの閉経後女性の検討でも，IIa 型高脂血症が最も多く， その BMI 平均は 22 であり，肥満はなかった。そこで，対象者を LDL コレステロール値と体脂肪率で 各 4 分割し検討した結果，LDL 最高値群かつ体脂肪率最低値群は LDL 最低値群かつ体脂肪率最高値 群に比し，骨密度が明らかに低値である結果を得た（図 4）。以上より，高 LDL 血症と低体脂肪の併 存は骨粗鬆症のリスクファクターとなる可能性があると考えられた。さらに高脂血症，高血圧などの 治療薬と骨粗鬆症治療薬がそれぞれ骨代謝と動脈硬化/脂質代謝にも影響を及ぼす可能性が明らかと なってきている。たとえば，スタチン製剤，β ブロッカーやサイアザイドなどの降圧薬が骨折防止効 果を有する可能性が注目されている。一方，骨粗鬆症治療薬として認可されているラロキシフェンの 脂質代謝改善作用や血管に対する作用の存在も示されている。さらにビスフォスフォネート製剤にお いてもその血管石灰化抑制効果や脂質代謝改善作用についての報告もある。このようにマルチタレン トな特徴を有する薬剤の登場により，治療薬の選択に際し，骨粗鬆症と併存しやすい生活習慣病，特 に高脂血症/動脈硬化症に対する配慮も要求される。 お わ り に 現在，骨折防止効果が証明された骨粗鬆症治療薬の登場により，骨粗鬆症診療においても evidence based medicineの実践が可能となった。これに加え，マルチタレントな特徴を有する薬剤による個別 的対応，すなわち tailor made medicine を実践していくことも可能になりつつある。このように骨粗鬆 症診療にあたっては，続発性骨粗鬆症をきたす疾患の的確な診断とその管理，そして併存する疾患の 腰椎骨密度 （g/cm2） 高 低 低 高 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85
％fat Q4 ％fat Q3 ％fat Q2 ％fat Q1
LDL-C Q4 LDL-C Q3 LDL-C Q2 LDL-C Q1 図 4 閉経後女性における LDL-コレステロール（LDL-C）と体脂肪率（％ fat）の Quartile による群間での腰椎骨密度の比較
予防や治療も含めた全身の健康管理をめざすことが，特に内科医にとって重要である。 文 献
1) Nakaoka D, Sugimoto T, Kobayashi T, Yamaguchi T, Kobayashi A, Chihara K. Prediction of bone mass change after parathyroidectomy in patients with primary hyperparathyroidism. J Clin Endocrinol Metab 2000;85(5):1901-7.
2) Nomura R, Sugimoto T, Tsukamoto T, Yamauchi M, Sowa H, Chen Q, Yamaguchi T, Kobayashi A, Chihara K. Marked and sustained increase in bone mineral density after parathyroidectomy in patients with primary hyperparathyroidism: A six-year longitudinal study with or without parathyroidectomy in Japanese population. Clin Endocrinol 2004;60(3):335-42.
3) Bilezikian JP, Potts Jr JT, Fuleihan G E-H, et al. Summary statement from a workshop on asymptomatic primary hyperparathyroidism: a perspective for the 21th century. J Bone Miner Res 2002;17:N2-11. 4) Kaji H, Yamauchi M, Chihara K, Sugimoto T. The threshold of bone mineral density for vertebral fracture in
female patients with glucocorticoid-induced osteoporosis. Endocr J 2006;53:27-34.
5) Nawata H, Soen S, Takayanagi R, et al. Guidelines on the management and treatment of glucocorticoid- induced osteoporosis of the Japanese Society for Bone and Mineral Research (2004). J Bone Miner Metab 2005;23:105-9.
6) Sugimoto T, Nishiyama K, Kurimoto F, Chihara K. Serum levels of insulin-like growth factor (IGF) I, IGF-binding proein (IGFBP)-2 and IGFBP-3 in osteoporotic patients with and without spinal fractures. J Bone Miner Res 1997;12(8):1272-9.
7) Yamaguchi T, Kanatani M, Yamauchi M, Kaji H, Sugishita T, Baylink DJ, Mohan S, Chihara K, Sugimoto T. Serum levels of insulin-like growth factor (IGF)I, IGF-binding proteins-3,-4 and-5: their relationships to bone mineral density and the risk of vertebral fractures in postmenopausal women. Calcif Tissue Int 2006; 78:18-24.
8) Sugimoto T, Nakaoka D, Nasu M, Kanzawa M, Sugishita T, Chihara K. Effect of recombinant human growth hormone in elderly osteoporotic women. Clin Endocrinol 1999;51:715-24.
9) Sugimoto T, Kaji H, Nakaoka D, Yamauchi M, Yano S, Sugishita T, Baylink D, Mohan S, Chihara T. Effect of low-dose of recombinant human growth hormone on bone metabolism in elderly osteoporotic women. Eur J Endocrinol 2002;147(3):339-48.
10) Schwartz AV, Sellmeyer DE, Ensrud KE, et al. Older women with diabetes have an increased risk of fracture: a prospective study. J Clin Endocrinol Metab 2001;86:32-8.
11) Yamaguchi T, Sugimoto T, Yano S, Yamauchi M, Sowa H, Chen Q, Chihara K. Plasma lipid levels are associated with bone mineral density and the presence of vertebral fractures in postmenopausal women. Endocr J 2002;49(2):211-7.
第 46 回骨粗鬆症財団教育ゼミナール講演 II
骨質を考慮した骨疾患モデルの形態解析
新潟大学超域研究機構 教授 新潟大学超域研究機構 研究支援員網 塚 憲 生 李 敏 啓
は じ め に 2000 年の NIH コンセンサス会議で，骨粗鬆症は「骨強度の低下を特徴とし，骨折のリスクが増大 しやすくなる骨格疾患」と定義づけされている。さらに骨強度低下の要因として，骨密度と“骨質”の 関与が強調されている。骨質を規定する要因として Burr は①骨代謝回転，②骨基質であるコラーゲン やミネラルの性状，③マイクロダメージの蓄積，④海綿骨や皮質骨の三次元的な構築の 4 つをあげて いるが，このうち②は石灰化ミネラル，コラーゲン線維，非コラーゲン性蛋白が混在して相互に影響 を及ぼしあうため，最も解析・評価が難しい項目であると思われる。 本稿では，骨組織や細胞に関するこれまでの知見を紹介し，それらを踏まえて，病理モデルマウス で検討した骨基質の状態について紹介する。 1 骨基質の石灰化 皮質骨にはオステオンまたはハバース系と呼ばれる骨単位が多数存在しており，骨髄側には網目状 に発達した海綿骨をみることができる。ヒト皮質骨組織所見では，ハバース系の中央には血管を含む ハバース管が走行し，その周囲を骨細胞が取り巻いていることから，骨が生きた組織であることがわ かる。これを拡大したものが図 1 である。有機成分を除去し走査型電子顕微鏡で観察すると，ハバー ス管を中心に形成される同心円状の構造内に，骨細胞が存在した骨小腔が認められ，さらにハバース 管から放射状に走る細い骨細管が確認できる。皮質骨骨髄側の骨基質上には扁平な骨芽細胞が存在し ており，透過型電子顕微鏡では活性の低い bone lining cell として観察できる（図 2）。皮質骨内部を透 過型電子顕微鏡でみると，コラーゲン線維の流れに沿って紡錘形を示す骨細胞と，垂直に伸びる細胞 突起が観察され，細胞突起とコラーゲン線維が織物のように規則正しく織り込まれていることがわか 図 1 ヒト皮質骨組織におけるハバース管の走査型 電子顕微鏡像（文献 1 より） 図 2 皮質骨骨基質における骨芽細胞（bone lining cell）（文献 2 より） 骨 compact bone (cortical bone) compact bone (cortical bone)bone lining cell
bone lining cell
Haversian system (Osteon) Haversian system (Osteon) Haversian canal Haversiancanal Osteocytic laccunae Osteocytic laccunae
Osteon (lamella bone) Osteon (lamella bone)
る（図 3）。すなわち皮質骨の緻密性は骨密度のみならず，このようなコラーゲン線維の配列によるも のとも考えられる。 マウスの二次骨梁に存在する骨芽細胞は皮質骨のそれとは異なり，細胞体の豊かな活性型骨芽細胞 であることが多い。電顕所見では細胞体中に多数の粗面小胞体やゴルジ野が形成されており，ゴルジ 体にはコラーゲン線維が重合化しつつある構造が認められる。このように活性型骨芽細胞は骨基質蛋 白を活発に合成・分泌する細胞である（図 4）。 活性型骨芽細胞の存在する類骨層，すなわちオステオイドには石灰化球（mineralized nodules）と呼 ばれる球状構造物が認められ，それらは周囲のコラーゲン線維を石灰化していくことが知られている。 石灰化球は骨芽細胞が分泌する基質小胞（matrix vesicle）中にアルカリホスファターゼ（ALP）や Ca- ATPaseをもち，リン酸や Ca イオンを内部に流入させる。基質小胞内で析出したリン酸カルシウムの 結晶は放射状に大きくなって単位膜を破って外に露出し，さらに増大して石灰化球を形成していく。 これが相互に融合し，周囲のコラーゲン線維を石灰化することによって骨基質を広く石灰化していく ことがわかっている（図 5）。一方，リン酸とカルシウムの物理化学的結合以外に，オステオポンチン をはじめとする非コラーゲン性骨基質蛋白は石灰化球表層に蓄積してその成長をコントロールしてい ると考えられている。 これら一連の骨基質石灰化の過程を図 6 にまとめた。活性型骨芽細胞は多量のコラーゲン，骨基質 蛋白，基質小胞を類骨層に向かって分泌していく。基質小胞内で析出したリン酸カルシウム結晶は成 長するに従って基質小胞の単位膜を突き抜けて外界に露出し，石灰化球へとなる。これら石灰化球は ある程度の大きさになると周囲のコラーゲン線維の石灰化を誘導して骨基質全体を石灰化すると考え 基質小胞 (matrix vesicle) 類骨層 osteoid 石灰化基質 コラーゲン CaP Ca P Ca・P 骨基質 タンパク 石灰化球 コラーゲン性 石灰化 基質小胞性 石灰化 osteoblast osteoblast ER ER Golgi Golgi mineralization mineralization matrix vesicle matrix vesicle mineralized nodule mineralized nodule compact bone (cortical bone) compact bone (cortical bone) 図 3 皮質骨組織におけるコラーゲン線維と骨細胞 （文献 3 より） 図 4 マウス骨梁における活性型骨芽細胞とゴルジ 体の集積（文献 4 より） 図 5 基質小胞体の石灰化球によるコラーゲン線維 の石灰化が骨基質を石灰化していく過程 図 6 骨基質の石灰化の概略 類骨層 osteoid 石灰化基質 基質小胞 (matrix vesicle) コラーゲン CaP Ca P Ca・P 骨基質 タンパク 石灰化球 コラーゲン性 石灰化 基質小胞性 石灰化
られる。このメカニズムのなかで，骨基質にリン酸や Ca イオンを供給するのは骨芽細胞の役割であ り，その分化マーカーに用いられる ALP は骨芽細胞の細胞膜に局在してリン酸イオンを供給すること で石灰化に関与していると考えられる。さらに電顕所見では ALP は細胞膜のみならず基質小胞や石灰 化球にもその局在が認められる（図 7）。具体的には，ALP は骨組織においてリン酸化合物からピロリ ン酸を切り離すだけでなく，さらにピロリン酸を単独のリン酸イオンに切断すると考えられる。これ らのリン酸が基質小胞中に入り込んで，Ca-ATPase によって取り込まれた Ca イオンと結合してリン 酸カルシウム結晶を析出し石灰化球になるものと考えられる。 一方，石灰化を受けるコラーゲン線維に注目すると，類骨層と比較して基質内部のコラーゲン線維 には細かい亀裂が認められることから，コラーゲン線維内部まで石灰化が浸透していることがわかる （図 8）。さて，コラーゲン線維を構成するコラーゲン細線維は，スーパーヘリックスで構成されるが， スーパーヘリックスの間には小さな間隙（hole zone）が存在する。骨芽細胞から分泌された直後のコ ラーゲン線維の間隙にはバイグリカンやデコリンが存在するが，石灰化を受ける時期になると除去さ れ，石灰化球由来のハイドロキシアパタイトの微小な結晶である mineralite が入り込んでくると考え られている。 以上，石灰化の微細構造学的なメカニズムをまとめると，次のようになる。骨芽細胞が類骨層に向 かって分泌する基質小胞には，Ca-ATPase や ALP が存在するために，その中のリン酸や Ca イオン濃 度が上昇して析出したリン酸カルシウム結晶が成長して石灰化球に変化していく。一方，骨芽細胞が 骨基質に向けて分泌するコラーゲン線維の間隙にあるデコリンやバイグリカンは石灰化に伴い除去さ れ，そこにハイドロキシアパタイト結晶が入り込んでコラーゲン線維を石灰化させてゆく。 一方，骨は代謝を受ける組織であり，破骨細胞が骨基質を吸収したところに骨芽細胞がきて新しい 図 7 骨芽細胞の細胞膜と基質小胞における ALP の 局在（文献 2 より） 図 8 基質内コラーゲン線維の石灰化所見 MV MV MV CN CN ALPase ALPase MV:基質小胞 MV:基質小胞 CN: 石灰化球CN: 石灰化球 osteoclast osteoclast ruffled border ruffled border ruffled border ruffled border 図 9 破骨細胞と ruffled border（波状縁） （文献 4 より）
図 10 TRAP 染色でみた cement line と破骨細胞の 局在（文献 4 より）
collagen collagen
osteoid
osteoid
deep portion of the mineralized matrix
deep portion of the mineralized matrix
TRAP osteoclast/cement line TRAP osteoclast/cement line oc oc cement line cement line ococ
骨を作るといった骨改造（bone remodeling）が認められる。ここで新しい骨と古い骨との間はセメン ト線（cement line）と呼ばれる構造で境界される。破骨細胞は多核巨細胞として観察されるが，骨基 質に面する細胞膜は複雑な陥凹構造を示し，ruffled border（波状縁）と呼ばれる構造を示す。この ruffled borderから分泌される酸やコラーゲン線維を分解するカテプシン K によって，骨基質が溶解され，分 解していくことが明らかになっている（図 9）。TRAP（酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ）の組織化 学染色では，破骨細胞中の TRAP 活性は顆粒状構造物や ruffled border 領域，さらに吸収窩の骨基質表 面にも認められる。さらに詳細に観察すると，TRAP 活性は破骨細胞や吸収窩表面の骨基質，cement lineに局在することから（図 10），破骨細胞は TRAP を分泌しながら骨を吸収しながら移動するため， cement lineは破骨細胞の軌跡といいかえることができる。
2 骨代謝が骨質に及ぼす影響の検討
1）骨代謝回転が高い場合－オステオプロテジェリン（OPG）欠損マウスの検討
OPG は破骨細胞の分化過程において重要な役割を果たす RANK-RANKL シグナルの decoy receptor として抑制的に働くことから，OPG 欠損マウスでは破骨細胞の分化形成が亢進してしまう。生後約 10週齢の OPG 欠損マウスを野生型マウスと比較した場合，骨量が著しく減少していることが認めら
wild type OPG
-/-TRAP
tibial epiphysis wild type OPG
-/-
ALP
osteopontin TB: trabecular bone
図 11 OPG 欠損マウス骨基質の TRAP 染色所見 OPG 欠損マウスでは多くの破骨細胞の局在が認め られる。（文献 5 より） 図 12 OPG 欠損マウス骨基質の ALP およびオステ オポンチン染色所見。OPG 欠損マウスでは 骨芽細胞の局在と複雑な網目状の cement lineが認められる。（文献 5 より） wild OPG-/-
図 13 OPG 欠損マウスの cement line
野 生 型 マ ウ ス で は コ ラ ー ゲ ン 線 維 が 密 で 薄 い cement lineで密接しているが，OPG 欠損マウスでは 有機質に富む骨基質を示し，cement line も広くなっ ている。（文献 5 より） 図 14 op/op マウスの二次骨梁の ALP 染色所見 野生型マウスと異なり活性型骨芽細胞は認められ ず，弱い ALP 活性を示す扁平な細胞がわずかに認め られるだけである。（文献 6 より） 2w op/op
femoral diaphysis 2w op/op femoral diaphysis ALP
れた。TRAP 染色によると多数の破骨細胞の局在が認められ（図 11），ALP 染色では強い ALP 陽性を 示す厚い骨芽細胞層が観察される他，オステオポンチン免疫陽性を示す複雑な網目状の cement line が認められる（図 12）。このように OPG 欠損によって破骨細胞の分化形成が亢進して骨吸収も上昇し ており，それと連動して骨芽細胞の増殖や骨形成も亢進するため，骨代謝回転が上昇していると思わ れる。 そこで野生型マウスの骨基質を観察すると，緻密なコラーゲン線維で構成される骨基質が薄い cement lineで密接しているのに対して，OPG 欠損マウスでは多量の有機成分を含み，さまざまな方向 を示すコラーゲン線維から構成される骨基質が，幅の広い cement line で境界されていた（図 13）。さ らに cement line は陥凹性に形成され，微小な亀裂にもつながっている部位も観察された。網目状に形 成された cement line は骨細胞や骨細管を横断することが多く，いびつな形状の骨細胞や，細胞死によ る骨小腔も多く観察された。すなわち，OPG 欠損によって骨吸収・骨形成が亢進する高代謝回転の状 況が生まれ，そこで形成される骨基質は不規則な走行性のコラーゲン線維と多くの有機質を有するだ けでなく，網目状で複雑な cement line で境界されていることが示された。言い換えれば，高代謝回転 で急激に作られた骨は，形態学的には質のよい骨でなく，脆い骨基質であると考えられた。 2）骨代謝回転がない場合－op/op マウスの検討－ M-CSF が欠損しマクロファージ/単球系および破骨細胞が形成されないために大理石骨病を呈する モデルが op/op マウスである。生後 2 週齢の op/op マウスの大腿骨における組織所見では，骨幹端部 から骨幹部にかけて網目状の骨梁が認められる。同部位の TRAP 染色では op/op マウスには破骨細胞 が認められない。また ALP 活性も野生型マウスに比較して低いことが示された。図 14 に示すように， 複雑な走行を示す骨梁は認められるが，活性型の骨芽細胞をみいだすことはできず，ALP 活性を示す 扁平な細胞がわずかに認められるだけである。von Kossa 染色で骨基質の石灰化をみると，コントロ ール群では活性型の骨芽細胞直下の骨基質には良好な石灰化が認められるが，op/op マウスでは広範囲 に石灰化していない骨基質が認められた（図 15）。このように op/op マウスでは，本来であれば骨改 造を受ける部位である二次骨梁における骨芽細胞数が減少している。そのために骨基質を石灰化する 能力が著しく低下している。すなわち，骨芽細胞には破骨細胞とのカップリングが必要であると考え られる。 op/op マウスに M-CSF を投与すると破骨細胞の形成が認められることが知られている。さらに TRAP 陽性破骨細胞の周囲には ALP 強陽性を示す活性型骨芽細胞を見出すことができる。電顕観察により， 破骨細胞の ruffled border と cement line の形成が認められ，骨改造が行われていることが示されてい る（図 16）。このように，骨芽細胞の活性化には破骨細胞とのカップリングが必要であり，その結果
2w control femoral diaphysis von Kossa (mineralization)
2w op/op femoral diaphysis von Kossa (mineralization)
ob
osteoclast
osteoblast
ruffled border
cement line
図 15 op/op マウスの von Kossa 染色所見 コントロールに比べて op/op マウスでは灰色の間隙 を多く認め，石灰化していない骨基質が広範にある ことが示された。（文献 6 より）
図 16 M-CSF 投与時の op/op マウスにおける破骨 細胞の形成
ruffled borderを有する破骨細胞と高電子密度の cement lineの形成が認められる。（文献 7 より）
として良質な骨基質が形成される。逆にいえば，op/op マウスのように破骨細胞がない状態では，骨芽 細胞が長期間にわたり質のよい骨を形成し続けることは困難であると考えられる。 3）骨芽細胞活性化に及ぼす破骨細胞の意義－c-src 欠損マウスの検討－ カップリングにおける骨芽細胞活性化には①破骨細胞の存在そのものが必須なのか，あるいは②破 骨細胞による骨吸収が必須なのだろうか。そこで，破骨細胞は存在するが骨吸収ができない c-src 欠 損マウスを用いて検討した。 c-src 欠損マウスの破骨細胞には ruffled border は形成されず，それ以外の方法でも石灰化骨基質を 取り込む像を観察できないことから，この破骨細胞は骨吸収ができないと考えられる。しかし，ALP 染色では c-src 欠損マウスの骨芽細胞は野生型マウスに比較して強い活性をもつことが示され，電顕 でも細胞内小器官の豊かな活性型骨芽細胞を認めた。von Kossa 染色では，野生型マウスおよび c-src 欠損マウスともに活性型骨芽細胞が存在し，直下の骨基質は良好に石灰化していたことから，カップ リングにおいて骨芽細胞の活性にとって重要なのは，破骨細胞による骨吸収ではなく，破骨細胞の存 在そのものであると考えられた。そこでそのメカニズムを詳細に検討するため，c-src 欠損マウスの TRAP 染色とオステオポンチンの分布をみると，いずれも骨基質内で平行線状の局在パターンを取る ことがわかる。これは c-src 欠損マウスの破骨細胞が骨吸収はできないが，TRAP やオステオポンチン を骨基質に分泌しながら移動し，その後に骨芽細胞が骨基質を添加するという現象が繰り返し起こる ためと考えられる。すなわち，このことは破骨細胞が骨基質上に分泌した何らかの物質が骨芽細胞の 活性化とその後の骨形成を誘導している可能性を示唆すると考えられる。一方，これら破骨細胞と骨 芽細胞とには細胞膜による直接接触が認められたことから，破骨細胞の膜上に骨芽細胞を活性化させ る因子があるのかもしれない。 これまでの c-src 欠損マウスでの検討から骨芽細胞の活性化には必ずしも破骨細胞の骨吸収が必要 ではないことが明らかになった。それに代わる要因として現段階で考えられるのは，①破骨細胞との cell-cell contact，あるいは②破骨細胞が骨基質上に沈着させた因子ではないかと考えられる。 4）カップリングとリモデリングが連動しない場合の骨基質－c-src 欠損マウスの検討－ 正常な場合に骨改造はカップリングに連動して起こるが，c-src 欠損マウスでは骨吸収ができないた めにリモデリングは行われないが，カップリングが成立することで骨芽細胞は活性化する。したがっ て骨芽細胞は骨吸収なしに古い骨の上に新しい骨基質を添加していくことになる。この場合の骨細胞 の配列を検討した。 正常マウスのリモデリングを受けていない一次骨梁における骨細胞は局在性が不規則で，骨細胞か ら伸びる細管の方向にも規則性はない。ところが十分にリモデリングを受けた皮質骨では，骨細胞に も細管にも規則性が認められ，二次骨梁でも同様の傾向が認められる。具体的には，骨の長軸方向， 言い換えれば骨梁の長軸方向に骨基質に一致して骨細胞は長楕円形を示し，骨細管は必ずそれに垂直 に交わるように伸びている。このことから，一次骨梁で適当に埋め込まれた骨細胞はリモデリングを 受けて再配置されると考えられる。ところが，c-src 欠損マウスではいずれにおいても骨細胞の配列性 や骨細管の走行性に規則性が認められない。また c-src 欠損マウスの骨基質を von Kossa 染色で観察す ると，多くの小さい白く抜けた亀裂が認められた。さらに，この骨基質は成熟した基質でなく，線維 性骨のような幼弱な基質であると考えられた。すなわち，正常では骨細胞はリモデリングによって骨 基質内に規則正しく再配列され，秩序をもった骨細胞性ネットワークを三次元的に構築することがで きる。このネットワークは内部応力の感知やカルシウムなどのミネラル代謝に関与していると想像さ れる。これに対して c-src 欠損マウスではリモデリングがないためネットワークは無秩序なままで機 能も果たさず，骨基質が維持されていないものと考えられる。 c-src 欠損マウスの検討をまとめると，①破骨細胞が存在すれば必ずしも骨吸収は必要なく，破骨細 胞の存在だけでカップリングにより骨芽細胞の活性が維持される。しかし，②カップリングはあくま でも骨表面の破骨細胞と骨芽細胞のやりとりに過ぎず，骨基質のリモデリングは新旧の骨の置換だけ でなく，骨基質に埋め込まれ，その維持に重要な役割を果たしている骨細胞の規則的な再配列を可能
にするものであると考えられる。 3 つのモデルマウスを例に挙げて骨基質の面から骨質を検討した。その結果として，良好な骨基質 を保つためには，破骨細胞と骨芽細胞による生理的なカップリングが必要であり，それによって骨リ モデリングが適正に行われることが重要であると考えられた。 文 献 1) 網塚憲生ほか. 口腔組織発生学. 東京, 医歯薬出版, 2006, p.387-92. 2) 下村淳子, 網塚憲生. 骨の細胞の形態と機能. 新しい透析骨症. 東京, 日本メディカルセンター, 2003, p.107-15. 3) 網塚憲生. 組織学から見た骨基質タンパクと骨質. 日骨形態計測会誌 2003;13(1):5-9. 4) 網塚憲生ほか. 骨のリモデリング（骨形成と骨吸収のメカニズム）, 歯の移動の臨床バイオメカニクス. 東京, 医歯薬出版, 2006, p.60-73.
5) Amizuka K, et al. Defective bone remodeling in osteoprotegerin deficient mice. J Electron Micro 2003; 52(6):503-13.
6) Sakagami N, Amizuka K, et al. Reduced osteoblastic population and the defective mineralization in osteo- petrotic (op/po) mice. Micron 2005;36(7-8):688-95.
7) Nishino I, Amizuka K, et al. Histochemical examination of osteoblastic activity in op/op mice with or without injection of recombinant M-CSF. J Bone Miner Metab 2001;19(5):267-76.
財団法人 骨粗鬆症財団主催
