微細藻類のリン酸輸送体を利用したリン、ヒ素回収の可能性

微 細 藻 類 の リ ン 酸 輸 送 体 を 利 用 し た リ ン 、 ヒ 素 回 収 の 可 能 性

そ こ で 、 そ の よ う な 化 学 的 、 物 理 的 手 法 に 加 え 、 生 物 を 利 用 し た 環 境 浄 化 、 bioremediation が 注 目 さ れ て い る 。一 般 的 に 、他 の 手 法 と 比 べ 、コ ス ト や 化 学 薬 品 を 使 用 し な い こ と に よ る 安 全 性 が 利 点 と い わ れ て い る 。 特 に 、 植 物 を 利 用 し た phytoremediation 技 術 に つ い て は 、 2011 年 に 発 生 し た 福 島 第 一 原 発 事 故 後 に 、 放 射 性 セ シ ウ ム の 吸 収 を 目 的 と し て ヒ マ ワ リ を 放 射 能 汚 染 地 域 に 植 え る 試 み も さ れ て お り 、 実 用 化 へ の 関 心 の 高 さ が 伺 え る 。 本 研 究 は 、 こ の phytoremediation 技 術 が 、 上 述 の ヒ 素 汚 染 の 浄 化 や リ ン の 回 収 に 非 常 に 有 益 で は な い か と 考 え 取 り 組 ん で き た 。 植 物 の 細 胞 は 、 外 界 か ら リ ン 資 源 を 確 保 す る 際 に 、 細 胞 膜 上 に 発 現 し た リ ン 酸 輸 送 体 を 経 由 し て リ ン 酸 を 取 り 込 ん で い る 。 し か し 、 リ ン 酸 と 化 学 的 性 質 や 構 造 が 類 似 し て い る ヒ 酸 が 共 存 す る と 、 ヒ 酸 も リ ン 酸 と 同 様 に リ ン 酸 輸 送 体 を 経 由 し て 細 胞 内 へ 取 り 込 ま れ る 。 こ の 性 質 を 利 用 し て 、 ヒ 素 も し く は リ ン を 特 異 的 に 取 り 込 む 輸 送 体 が 得 ら れ れ ば 、 ヒ 素 汚 染 地 域 の 浄 化 や リ ン 資 源 の 回 収 が 可 能 な の で は な い か と 考 え た 。

実 験 に は 、 単 細 胞 性 緑 藻 Chlamydomonas reinhardtii (以 下 、 Chlamydomonas)

お よ び 、高 等 植 物 の 葉 緑 体 の 祖 先 と い わ れ て い る 、シ ア ノ バ ク テ リ ア Synechocystis

sp. PCC6803(以 下 、Synechocystis)を 使 用 し た 。 ど ち ら の 種 も 、 ゲ ノ ム 解 読 が 完 了

し て お り(Merchant et al., 2007, Kaneko et al., 1996)、 モ デ ル 生 物 と し て よ く 利 用

さ れ て い る 。

リ ン 酸 輸 送 体 に つ い て は 、 こ れ ま で に E. coli や Saccharomyces cerevisiae を 筆

頭 に 研 究 が 進 め ら れ て き た 。E. coli は 、 high-affinity ABC transporter で あ る Pst

お よ び 、low-affinity で プ ロ ト ン 駆 動 力 に よ り Pi を 輸 送 す る Pit の 二 種 類 の リ ン 酸

輸 送 体 を も つ(Harris et al., 2001)。S. cerevisiae で は 、 high-affinity の リ ン 酸 輸

送 体 と し て H+_{/Pi symporter Pho84 と Na}+_{/Pi symporter Pho89 が 、 low-affinity}

H+_{/ P i s y m p o r t e r と し て P h o 8 7 と P h o 9 0 が 、細 胞 外 か ら の リ ン 酸 取 込 み を 担 っ}

て い る(Harris and Shinha, 2014)。E. coli の Pst system、Pit system、S. cerevisiae

の Pho84 、 Pho89 な ど の 輸 送 体 と の 相 同 性 か ら 、 バ ク テ リ ア や 藻 類 、 rice や

Arabidopsis な ど 高 等 植 物 に お い て 、 今 日 ま で に 次 々 と リ ン 酸 輸 送 体 が 同 定 さ れ て き た 。

C. reinhardtii に つ い て は 、 こ れ ま で に 十 数 個 の リ ン 酸 輸 送 体 の 存 在 が 示 唆 さ れ

て い る 。S. cerevisiae の Pho84 と 相 同 性 が 高 い PTA type と 、Pho89 と 相 同 性 が 高

い PTB type に 分 け ら れ る (Moseley et al., 2005)。PTA type で は PTA1〜 4 の 、PTB

type で は PTB1〜 12 の ア ミ ノ 酸 配 列 が 示 さ れ た (Moseley et al., 2005, Kobayashi et al., 2005)が 、 機 能 や 局 在 性 、 立 体 構 造 な ど は 未 だ 解 明 さ れ て い な い 。

Synechocystis sp. PCC6803 の リ ン 酸 輸 送 体 に つ い て は 、Pst1、Pst2 の 二 つ が 存

ル ギ ー を 利 用 し て 取 り 込 む ABC-transporter で あ る 。 ABC-transporter は 、 ATP

結 合 タ ン パ ク で あ る PstB、 2 つ の 膜 貫 通 タ ン パ ク の PstA、 PstC、 リ ン 酸 結 合 タ ン

パ ク の PstS を も つ (Chan and Torriani, 1996, Pitt et al., 2010)。 Pst1、 Pst2 も 、

そ れ ら の タ ン パ ク を コ ー ド す る 遺 伝 子 が オ ペ ロ ン 構 造 を な し て い る(Pitt et al.,

2010)。

本 研 究 で は 、こ の Pst1、Pst2 の 変 異 株 、Δ Pst1、Δ Pst2 (Burut-Archanai et al.,

＜ 第 1 章 ＞ シ ア ノ バ ク テ リ ア お よ び 藻 類 を 利 用 し た 排 水 中 リ ン 回 収 の 可 能 性 1-1 緒 言 序 論 で 述 べ た よ う に 、 リ ン 過 多 に よ る 富 栄 養 化 や 、 そ れ に 伴 う 水 環 境 の 悪 化 、 ア オ コ の 大 量 発 生 、 毒 素 の 問 題 が 後 を 絶 た な い 。 環 境 中 に 流 出 す る リ ン は 生 活 排 水 お よ び 産 業 排 水 に 起 因 す る も の が 大 半 で あ り 、我 が 国 の 閉 鎖 性 水 域 の リ ン も 74%が そ れ ら 排 水 が 発 生 源 と み ら れ る(Fig. 1)。現 在 の と こ ろ 、こ れ ら 排 水 の 処 理 方 法 と し て 主 に 用 い ら れ て い る の が 、 好 気 性 微 生 物 を 利 用 し た 活 性 汚 泥 法 や 、 嫌 気 性 微 生 物 を 利 用 し た 嫌 気 性 廃 水 処 理 法 で あ る 。 い ず れ の 方 法 も 、 微 生 物 に 排 水 中 の 有 機 物 を 分 解 さ せ 、 排 水 中 か ら リ ン や そ の 他 有 機 物 を 除 去 す る 技 術 で あ る 。 処 理 後 に は 、 微 生 物 や 微 生 物 が 含 ま れ る 汚 泥 か ら リ ン を 遊 離 さ せ 、 カ ル シ ウ ム イ オ ン 、 ヒ ド ロ キ シ イ オ ン や ア ン モ ニ ウ ム イ オ ン 、 マ グ ネ シ ウ ム イ オ ン と 反 応 さ せ る こ と で リ ン 酸 カ ル シ ウ ム(ヒ ド ロ キ シ ア パ タ イ ト ; HAP)や リ ン 酸 ア ン モ ニ ウ ム マ グ ネ シ ウ ム (ス ト ラ バ イ

ト ; MAP) の 形 で 回 収 が 可 能 で あ り 、 す で に 実 用 化 さ れ て い る (Tanaka and

Shimamura, 2005)。 し か し な が ら 、 余 剰 汚 泥 中 へ の リ ン の 残 留 な ど も あ る こ と か

ら 、実 際 の 処 理 に お い て は 流 入 し た リ ン 量 の 30%程 度 が 回 収 の 限 界 で は な い か と い

う 見 解 も あ る(Tanaka and Shimamura, 2005)。

本 章 で は 、 さ ら に 効 率 的 な 排 水 中 か ら の リ ン の 除 去 、 お よ び 回 収 に シ ア ノ バ ク テ

リ ア や 藻 類 が 使 用 で き な い か 試 み た 。実 験 に は 、シ ア ノ バ ク テ リ ア Synechocystis sp.

PCC 6803 お よ び 、Chlamydomonas reinhardtii の 野 生 株 CC125 と 、PTB1 の 欠 損

株 AR3 を 使 用 し た 。AR３ は 、先 の 研 究 で CC125 よ り も リ ン 酸 取 込 み 活 性 が 高 い こ

と が 明 ら か と な っ て お り(Kobayashi et al., 2003; Murota et al., 2012)、 よ り 多 く

1-2 実 験 操 作

1-2-1 前 培 養

緑 藻 Chlamydomonas reinhardtii (以 下 、 Chlamydomonas)CC125 株 、 AR3 株 、

シ ア ノ バ ク テ リ ア Synechocystis sp. PCC6803(以 下 、Synechocystis)と も に 、リ ン

酸 十 分 条 件 下 に て OD7 3 0=0.5 〜 1 ま で 振 と う 培 養 し た 細 胞 を 使 用 し た 。 な お 、

Chlamydomonas の 培 養 に は 1×TAP 培 地 (Harris et al., 2009)、 PCC6803 の 培 養

に は BG-11 培 地 (Allen, 1968)を 使 用 し た 。 培 地 組 成 は 以 下 の 通 り で あ る 。 ＜1×TAP 培 地 ＞ 100×TAP 10 mL 1M K・ Pi 1 mL dH2O up to 1 L 上 記 を 調 製 後 、 オ ー ト ク レ ー ブ 滅 菌 し た 。 100×TAP

Hutner’s trace element 10 mL

NH4Cl 4.0 g CaCl2・2H2O 0.5 g MgSO4・7H2O 1.0 g Tris 24.2 g acetate 10 mL dH2O up to 100 mL

Hutner’s trace element

1M K・ Pi （ pH7.0） K2HPO4 10.62 g KH2PO4 5.31 g dH2O up to 100 mL 上 記 を 調 製 後 、 オ ー ト ク レ ー ブ 滅 菌 し た 。 ＜BG-11 培 地 ＞ Stock I 2 mL Stock Ⅱ 50 mL Stock Ⅲ 2 mL Stock Ⅳ 1 mL A6 1 mL 1M TES-KOH 20 mL dH2O up to 1 L 上 記 を 調 製 後 、 オ ー ト ク レ ー ブ 滅 菌 し た 。 ※Stock I の み オ ー ト ク レ ー ブ 後 に 加 え た 。 Stock I citric acid 0.3 g

ammonium Iron (Ⅲ ) citrate brown 0.3 g

マ ラ カ イ ト グ リ ー ン 試 薬 の 調 製

１ ．ammonium molybdate (Wako、 特 級 ) 2.86 g を 6M HCl (関 東 化 学 、 特 級 、 濃

度 35〜 37 %の も の を 超 純 水 で 2 倍 希 釈 し た 。 操 作 は ド ラ フ ト 内 で 実 施 し た 。 )

に 溶 解 し 、50 mL に メ ス ア ッ プ し た 。

２ ．polyvinyl alcohol (1n=1500〜 1800、 Wako、 特 級 )1.16 g に 超 純 水 約 40 mL を

加 え 、50 mL の 遠 心 チ ュ ー ブ に 移 し た 。 遠 心 チ ュ ー ブ を 湯 浴 で 温 め 、 時 折 チ ュ

ー ブ を 転 倒 さ せ な が ら 完 全 に 溶 媒 を 溶 解 さ せ た 。 溶 媒 が 溶 け 切 っ た ら 、 超 純 水

で 50 mL に メ ス ア ッ プ し た 。

３ ．Brilliant Green (Wako、 特 級 ) 0.61 g を 超 純 水 に 溶 解 し 、 50 mL に メ ス ア ッ プ

し た 。 完 成 後 の 溶 液 は 暗 所 で 保 管 し た 。 ４ ．1.〜 3.の 溶 液 を ５ ： ５ ： ２ （ v/v） の 割 合 で 混 合 し 、 室 温 、 暗 所 で 12 時 間 置 い た 。 1-2-4 リ ン 酸 過 多 条 件 下 に お け る Chlamydomonas と Synechocystis の 生 育 細 胞 培 養 プ レ ー ト(IWAKI, 12 ウ ェ ル )の 各 ウ ェ ル に 、 リ ン 酸 濃 度 0〜 200 mM に な る よ う 1×TAP(-P)培 地 、 BG-11(-P)培 地 で 調 製 し た 。 1-2-1 で 培 養 し た

C. reinhardtii CC125、 AR3、 Synechocystis の 細 胞 懸 濁 液 を 各 20 μ L ず つ 添 加 し

1-3 結 果

1-3-1 排 水 中 に お け る Clamydomonas、 Synechocystis の 生 育

各 排 水 中 で の 生 育 を 調 べ た と こ ろ (Fig. 2) 、 排 水 口 か ら の 採 取 水 で は 、

(0〜 9300 mg/L)リ ン 酸 存 在 下 で 振 と う 培 養 し た と こ ろ 、 150 mM (4650 mg/L)以 上

の リ ン 酸 存 在 下 で は 生 育 が 阻 害 さ れ て い た が 、100 mM (3100 mg/L)ま で 生 育 が 確

1-4 考 察

排 水 の 浄 化 を 生 物 学 的 に 行 う こ と は 、 先 述 の 通 り 好 気 性 ま た は 嫌 気 性 微 生 物 を 使 用 し た 技 術 と し て す で に 実 用 化 さ れ 広 く 利 用 さ れ て い る 。 ま た 、 排 水 の 浄 化 か つ そ こ か ら の 有 用 、 ま た は 有 害 物 質 の 回 収 メ カ ニ ズ ム に つ い て も 多 く 報 告 さ れ て い る 。

近 年 で は バ イ オ 燃 料 の 回 収 を 目 的 と し た 緑 藻 C. reinhardtii の 研 究 や (Toyoshima

and Sato, 2015)、 シ ア ノ バ ク テ リ ア の 一 種 で あ る Aulosira fertilissima を 用 い た 、

生 分 解 性 プ ラ ス テ ィ ッ ク と し て 有 益 な 利 用 が 見 込 め る ポ リ ヒ ド ロ キ シ 酪 酸(poly-β

-hydroxybutyrate; PHB)の 回 収 (Samantaray et al., 2011)、Chlorella を 使 っ た 繊

ム 、 六 価 ク ロ ム 、 ヒ 素 な ど の 重 金 属 、 半 金 属 が あ げ ら れ る が 、 重 金 属 、 半 金 属 の 場 合 に は pH 調 整 や キ レ ー ト 試 薬 と の 反 応 、 SS、 ダ イ オ キ シ ン 類 の 場 合 に は 凝 集 沈 殿 法 や 膜 を 使 っ た 方 法 を 適 応 す る な ど し て 、 こ れ ら の 物 質 を 除 去 し て い る(三 好 康 彦 , 2004)。 以 上 の よ う に 、 特 定 排 水 に つ い て は 各 施 設 に お い て 、 水 質 汚 濁 防 止 法 や 各 自 治 体 が 定 め る 基 準 値 を 超 え な い よ う 適 正 に 処 理 し た の ち 、 施 設 外 へ 排 出 さ れ て い る 。 今 回 使 用 し た 排 水 は 、 い ず れ も pH が 7 付 近 で あ っ た こ と か ら (Table 1)、 少 な く と も pH 調 整 後 に 採 水 し た も の で は な い か と 思 わ れ る 。 今 回 測 定 を 行 っ た リ ン 量 で あ る が 、 水 質 汚 濁 防 止 法 が 定 め る 排 水 基 準 で は 、 １ 日 あ た り の 許 容 限 度 が(リ ン 含 有 量 と し て )16 mg/L(日 間 平 均 8 mg/L)と さ れ て い る (※ 本 基 準 は 1 日 あ た り の 平 均 的 な 排 出 量 が 50m3以 上 で あ る 工 場 ま た は 事 業 場 に 係 る 排 出 水 に つ い て 適 用 さ れ る 。 ま た 、 リ ン が 湖 沼 植 物 プ ラ ン ク ト ン の 著 し い 増 殖 を も た ら す お そ れ が あ る 湖 沼 と し て 環 境 大 臣 が 定 め る 湖 沼 、 海 洋 植 物 プ ラ ン ク ト ン の 著 し い 増 殖 を も た ら す お そ れ が あ る 海 域 と し て 環 境 大 臣 が 定 め る 海 域 及 び こ れ ら に 流 入 す る 公 共 用 水 域 に 排 出 さ れ る 排 出 水 に 限 っ て 適 用 さ れ る)。実 際 に 実 験 に 用 い た 排 水 の リ ン(P)含 量 は 、実 験 で 得 ら れ た リ ン 酸 含 量 か ら 換 算 す る と 約 3.1〜 6.3 mg/L で あ っ た(Fig. 3)。し か し 、オ ー ト ク レ ー ブ 処 理 し た も の に つ い て は 、有 機 化 合 物 な ど の 形 で 存 在 し て い た リ ン 酸 が 高 温 、 高 圧 処 理 に よ り 遊 離 し た こ と で 、 無 機 リ ン 酸 量 に し て 数 mg/L 上 昇 し た と 考 え ら れ る (Fig. 3)。オ ー ト ク レ ー ブ 処 理 し た こ と に よ っ て 、排 水 中 の リ ン 酸 量 は や や 上 昇 し た も の の 、Chlamydomonas、Synechocystis の 生 育 に つ い て は オ ー ト ク レ ー ブ 未 処 理 の も の と 比 較 し て 変 化 が な か っ た 。 こ の こ と か ら 、 今 回 使 用 し た も の と 同 程 度 ま で 処 理 さ れ た 排 水 で あ れ ば 、 オ ー ト ク レ ー ブ に よ る 滅 菌 処 理 な し で 、 微 細 藻 類 の 生 育 に 利 用 で き る こ と が わ か っ た 。 し か し 、Chlamydomonas に 関 し て は 、 特 定 排 出 水 (希 釈 な し の も の )、 焼 却 炉 排 水(1/2 希 釈 、 希 釈 な し 両 方 )に お い て 生 育 し な か っ た (Fig. 2)。 2 倍 希 釈 し た 特 定 排 出 水 で は 生 育 し た こ と か ら 、 お そ ら く 特 定 排 出 水 お よ び 焼 却 炉 排 水 中 に 、 生 育 の 妨 げ と な る 物 質 が 一 定 量 以 上 存 在 し て い た と 考 え ら れ る 。 本 実 験 の 結 果 か ら 、緑 藻 Chlamydomonas お よ び Synechocystis が リ ン 含 量 3〜 6 mg/L 程 度 の 排 水 中 の リ ン を 吸 収 、 利 用 し 、 生 育 が で き る こ と が 示 さ れ た 。 特 に 、 Synechocystis に つ い て は 特 定 排 水 に お い て も 高 い 生 育 能 力 、 リ ン 取 込 み 能 力 を 示 し 、 排 水 処 理 に お い て よ り 有 用 と な る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 こ れ ま で も 、 微 細 藻 類 に よ る 排 水 か ら の リ ン 酸 取 込 み に 関 す る 報 告 は さ れ て い る 。 例 え ば 、 先 に 述 べ た Aulosira fertilissima を 用 い た 排 水 中 か ら の PHB の 回 収 実 験 の 際 に は 、 リ ン 酸 に つ い て は 12 日 間 で 実 験 前 の 3.9 mg/L か ら 0.10 mg/L ま で 排 水 中 濃 度 が 低 下 し 、約

(2014)の Chlorella の 報 告 に お い て も 、 排 水 中 の 0.44 mg /L の リ ン 酸 に つ い て 、 15

日 間 で そ の 62 %程 度 の 細 胞 内 吸 収 が 確 認 さ れ た 。

ま た 、海 洋 性 藻 類 Nannochloropsis oculata で は 、約 2.3 mg/L の リ ン 酸 を 含 む 排

水 中 か ら 14 日 間 で 約 90%の リ ン 酸 吸 収 が 報 告 さ れ て い る (Sema and Mika, 2015)。

Miguel ら の 2016 年 の 報 告 に よ る と 、 淡 水 性 緑 藻 で あ る イ カ ダ モ の 生 育 に よ っ て 、

排 水 中 の 13.23 mg/L の リ ン 酸 濃 度 が 15 日 間 で 0.02 mg/L 以 下 に ま で 低 下 し た 。こ

の 他 に も 、酸 性 高 温 域 に 生 息 す る 紅 藻 Galdieria sulphuraria や 、緑 藻 Halochlorella

rubescensi な ど 、 種 々 の 微 細 藻 類 で 排 水 か ら の リ ン 酸 取 込 み の 報 告 が あ る (Selvaratnam et al., 2014, Shi et al., 2016)。

上 記 の 報 告 か ら 、 排 水 の 種 類 に も よ る が 、 生 物 種 に よ っ て も リ ン 酸 取 込 み 能 力 は 様 々 で あ る こ と が わ か る 。 し か し な が ら 、 今 回 Synechocystis で 得 ら れ た 結 果 は 7 日 間 で リ ン 酸 濃 度 に し て 約 19 mg/L、約 95 %の 吸 収 で あ っ た こ と か ら 、こ れ ま で の 報 告 の 中 で も リ ン 酸 取 込 み 能 力 が 高 く 、 大 い に 実 用 化 に 向 け 検 討 の 価 値 が あ る 種 の 一 つ と 考 え る 。 な お 、 リ ン の 回 収 に つ い て は 生 物 学 的 手 法 は 勿 論 、 化 学 的 、 物 理 的 手 法 も 研 究 が 進 め ら れ て い る 。 す で に 実 用 化 さ れ て い る 方 法 の 一 つ に 、 炭 素 繊 維 と 鉄 材 を 組 み 合 わ せ て 使 用 す る こ と で 、 リ ン 酸 鉄 を 生 成 さ せ て 水 中 の リ ン 酸 濃 度 を 低 下 さ せ る 方 法 が あ る(小 島 , 2012)。こ の 技 術 に つ い て は 、炭 素 繊 維 に 微 生 物 を 繁 殖 さ せ る こ と で 、 リ ン 酸 や そ の 他 の 有 機 物 を 微 生 物 に 利 用 さ せ 、 日 本 国 内 の み な ら ず 中 国 な ど 海 外 の 汚 染 さ れ た 河 川 の 浄 化 に 効 果 を 示 し て い る 。 こ の 技 術 と 同 様 、 炭 素 を 利 用 し た 手 法 で 昨 今 報 告 さ れ た の が 、 黒 鉛 化 炭 素 の 表 層 に ナ ノ 構 造 の 水 酸 化 マ グ ネ シ ウ ム を 添 加

す る こ と で 、そ こ に 多 量 の リ ン 酸 を 結 合 さ せ る 手 法 で あ る(Yan et al., 2016) 。Yan

ら(2016)の 報 告 に よ る と 、 1 日 あ た り 、 炭 素 1 g あ た り 588.4mg/g の リ ン 酸 回 収 が 可 能 で あ り 、従 来 の 方 法 よ り も 炭 素 1 g あ た り 1 桁 以 上 高 い 回 収 効 率 で あ る と い う 。 こ の よ う に 、 今 後 は 、 生 物 学 的 手 法 に 加 え 化 学 的 、 物 理 的 手 法 も 交 え た よ り 効 率 の よ い 回 収 技 術 に つ い て も 検 討 し て い く 必 要 が あ る と 考 え る 。 ま た 、Synechocystis は 100 mM(3.1 g/L)リ ン 酸 存 在 下 で も 生 育 が 可 能 で あ っ た 。 上 述 の よ う に 、 近 年 は リ ン 資 源 の 回 収 に つ な が る 生 物 や メ カ ニ ズ ム の 報 告 が 多 い 。 ま た 、 リ ン 酸 欠 乏 条 件 と 比 較 し て 、 リ ン 酸 過 多 が 生 育 に 与 え る 影 響 に 関 す る 報 告 は 少 な い も の の 、2011 に Naddy ら が 淡 水 性 緑 藻 の 一 種 で あ る Pseudokirchneriella

subcapitata や 、 Ceriodaphnia dubia (ニ セ ネ コ ミ ジ ン コ )、 淡 水 魚 の 一 種 で あ る Pimephales promelas を 使 用 し て リ ン 酸 を 過 剰 に 添 加 し た 際 の 報 告 が あ る 。 彼 ら の

Fig. 1 日 本 の 閉 鎖 系 水 域 (東 京 湾 、伊 勢 湾 、大 阪 湾 、瀬 戸 内 海 )に お け る リ ン の 発 生 源 別 汚 濁 負 荷 量 の 割 合

Fig. 2 排 水 中 に お け る Chlamydomonas、 Synechocystis の 生 育 OD7 3 0=0.5〜 １ ま で 培 養 し た 細 胞 を リ ン 酸 を 含 ま な い 培 地 で 3 回 洗 っ た 後 、各 排 水 や 培 地 、 超 純 水 2.9 mL 中 に 0.1 mL 添 加 し 1 週 間 振 と う 培 養 し た 。「 1/2」 は 、排 水 や 培 地 を 超 純 水 で 2 倍 希 釈 し た こ と を 示 す 。a は 採 取 し た 排 水 を そ の ま ま 使 用 し た 結 果 、b は 排 水 を オ ー ト ク レ ー ブ 後 に 使 用 し た 結 果 、c は 培 地 (① 、② は 1×TAP 培 地 、 ③ は BG-11 培 地 )お よ び 超 純 水 で 実 施 し た 結 果 で あ る 。 ① ：C. reinhardtii CC125、 ② ： C. reinhardtii AR3、

＜ 第 2 章 ＞ 緑 藻 Chlamydomonas の リ ン 酸 輸 送 体 遺 伝 子 の 解 析 と そ の 利 用 2-1 緒 言 第 1 章 よ り 、 シ ア ノ バ ク テ リ ア や 緑 藻 に よ る 排 水 中 リ ン の 取 込 み が 示 さ れ 、 そ れ ら に よ る リ ン 回 収 の 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 そ こ で 、 よ り 効 率 的 に リ ン を 取 込 む こ と が で き な い か を 考 慮 し 、 リ ン の 細 胞 内 取 込 み を 担 う リ ン 酸 輸 送 体 に 着 目 し た 。 本 章 で は 、緑 藻 Chlamydomonas の リ ン 酸 輸 送 体 に つ い て 調 べ た 結 果 を 報 告 す る 。 Chlamydomonas の リ ン 酸 輸 送 体 に つ い て は 、先 述 の 通 り PTA1〜 4 お よ び PTB1〜 PTB12 の 存 在 が 示 唆 さ れ て い る が (Moseley et al., 2005; Kobayashi et al., 2005)、 そ れ ら の 局 在 性 や 機 能 に つ い て は 未 解 明 で あ る 。

複 数 の リ ン 酸 輸 送 体 を も つ 場 合 、例 え ば 、E. coli に お け る Pst と Pit(Harris et al.,

2001)、S. cerevisiae に お け る Pho84、Pho89 と P h o 8 7 、P h o 9 0 (Harris and Shinha,

2014)の よ う に 、high-affinity と low-affinity 両 方 の 輸 送 体 が 存 在 す る 場 合 が 多 い 。 親 和 性 や 性 質 が 異 な る 輸 送 体 を 複 数 持 つ こ と で 、 外 界 の pH や リ ン 酸 濃 度 の 変 化 に 応 じ て そ れ ら の 輸 送 体 を 使 い 分 け る た め で あ る 。Chlamydomonas に お い て も 、 存 在 が 示 唆 さ れ て い る 16 個 の 輸 送 体 の 中 に は 、 リ ン 酸 選 択 性 が 高 い 輸 送 体 や 、 低 い 輸 送 体 が 混 在 す る と 推 測 さ れ る 。 小 林 ら(2005)に よ っ て 、PTB1 の 欠 損 株 AR3 が 、 野 生 株 CC125 と 比 較 し て 高 い ヒ 酸 耐 性 能 を 持 つ こ と が 明 ら か と な っ た 。AR3 に つ い て リ ン 酸 十 分 条 件 下 に お け る 細 胞 内 リ ン 量 を 調 べ る と 、 野 生 株 の 2 倍 以 上 で あ っ た (Kobayashi et al., 2005)。 ま た 、 細 胞 内 へ の ヒ 酸 取 り 込 み に つ い て 調 べ る と 、 野 生 株 を 0.2 mM ヒ 酸 存 在 下 で 培 養 し た 際 に 60 nmol･mg- 1 _{Chl の ヒ 素 を 細 胞 内 に 含 有 し て い た の に 対 し 、 AR3 は 4} mM ヒ 酸 存 在 下 で 培 養 し て も 細 胞 内 ヒ 素 含 量 は 25 nmol･mg- 1 _{Chl に と ど ま っ て い} た(Kobayashi et al., 2005)。 以 上 の 結 果 か ら 、 リ ン 酸 輸 送 体 の 欠 損 が ヒ 酸 取 込 み 及 び ヒ 酸 耐 性 に 関 し て 何 ら か の 影 響 を 及 ぼ し て い る と 思 わ れ た 。

な お 、Arabidopsis thaliana や rice で は 複 数 あ る リ ン 酸 輸 送 体 の う ち 、ヒ 酸 を 多

く 取 り 込 む 性 質 の 輸 送 体 も 存 在 す る こ と が わ か っ て い る 。Arabidopsis thaliana の

場 合 、Phosphate transporter 1 (PHT1) family 輸 送 体 に 属 す る 、S. cerevisiae

Pho84 と 相 同 性 の 高 い H+_{/Pi symporter を も っ て い る が 、 こ の う ち の Pht1;1 変 異}

株 及 び Pht1;4 変 異 株 に お い て ヒ 酸 存 在 下 に お け る 側 根 の 伸 張 率 が 野 生 株 の 1.65 倍

と な っ た こ と か ら 、他 の 輸 送 体 と 比 較 し て Pht1;1 及 び Pht1;4 の ヒ 酸 輸 送 性 が 高 い

と 推 測 さ れ て い る(Shin et al., 2004; González et al., 2005)。rice に つ い て も 、PHT1

family で あ る OsPT1 を も つ が 、こ の OsPT1 を ノ ッ ク ダ ウ ン し た と こ ろ shoot で の

As 蓄 積 が 野 生 株 と 比 較 し て 60 %程 度 に 抑 え ら れ た (Kamiya et al., 2013)。 こ の こ と

2-2 実 験 操 作

2-2-1 Chlamydomonas に お け る リ ン 酸 輸 送 体 遺 伝 子 の 発 現 解 析

TAP プ レ ー ト に 保 存 し て い る 細 胞 を 白 金 耳 で 取 り 、TAP 液 体 培 地 に 植 え た 。細 胞

が 増 殖 し て き た ら 新 た な TAP 培 地 に 植 え 継 ぎ 、前 培 養 を 行 っ た 。前 培 養 が log phase

に 達 し た ら 、 新 し い TAP 培 地 に 植 え 継 ぎ 、log phase(OD7 3 0=0.3)に 達 し た も の を 実

RNA solution 1 M Tris-HCl (pH7.5) 0.5 mL (終 濃 度 10 mM)、10 % SDS 5 mL (終 濃 度 1 %)、 0.5 MEDTA (pH7.5) 0.5 mL (終 濃 度 5 mM)、 5 %中 性 フ ェ ノ ー ル 2.5 mL を 加 え 、dH2O で 50 mL に メ ス ア ッ プ し た 。 CsCl/EDTA 溶 液 CsCl 191.9304 g、 0.5M EDTA(pH7.5) 4 mL (終 濃 度 0.01 M)を 加 え 、 dH2O で 200 mL に メ ス ア ッ プ 後 、 121 ℃ で 20 分 間 オ ー ト ク レ ー ブ 滅 菌 し た 。 ＜RNA 抽 出 操 作 ＞ 乾 熱 滅 菌 し た 乳 鉢 に 液 体 窒 素 を 注 ぎ 、そ こ に 回 収 し た 細 胞 と 2 mL の solution D を 入 れ て 細 胞 を す り つ ぶ し た 。 細 胞 が 粉 末 状 に な っ て き た ら 4 mL の solution D を 加 え 液 状 に な る ま で す り 潰 し た 。 細 胞 液 を ホ モ ジ ナ イ ザ ー で ３ 回 ホ モ ジ ナ イ ズ し 、 完 全 に 液 状 に な っ て い る こ と を 確 認 し た 後 、13,000 g, 4 ℃ , 10 min 遠 心 し

た 。 遠 心 中 に 、Beckman 50 ultra-clear centrifuge tube の 側 面 を solution D で

２ 回 洗 い 、キ ム タ オ ル 上 に 逆 さ ま に し て 乾 か し て お い た 。遠 心 後 、上 清 を 23G の シ リ ン ジ に 2〜 3 回 通 し て DNA を 断 片 化 し た 。 乾 か し て お い た 遠 心 チ ュ ー ブ に CsCl/EDTA 溶 液 4 mL を 入 れ 、 そ の 上 に RNA 粗 抽 出 液 を 重 層 し た 。 サ ン プ ル の 入 っ た 遠 心 チ ュ ー ブ を ス イ ン グ ロ ー タ ーSW40 で 超 遠 心 (Beckman, L-60)に か け た (33,000rpm, 20℃ , 14h)。 超 遠 心 後 、 ア ス ピ レ ー タ ー に つ な い だ パ ス ツ ー ル ピ ペ ッ ト で 上 層 の GTC 層 を 取 り 除 き 、 solution D を チ ュ ー ブ 口 か ら 伝 わ ら せ て 入 れ 、壁 面 に 残 っ た 粗 抽 出 液 を 洗 い 落 と し た 。DNA 層 ま で 取 り 除 き 、再 び solution D で 壁 面 を 洗 っ た 後 、 遠 心 チ ュ ー ブ の 下 か ら 3 cm く ら い の と こ ろ ま で 上 清 を 取 り 除 い た 。 ク リ ー ン ベ ン チ 内 で よ く 熱 し た カ ッ タ ー を 用 い 、 液 面 か ら 1〜 2 cm の と こ ろ を 切 断 し た 。 上 清 を 1.5 mL の 微 量 遠 心 チ ュ ー ブ に と り 、 沈 殿 が 入 っ た 超 遠 心 チ ュ ー ブ に 1 mL の エ タ ノ ー ル を 入 れ 沈 殿 を リ ン ス し た 後 、 エ タ ノ ー ル を 取 り 除 い た 。 上 清 が 入 っ た 微 量 遠 心 チ ュ ー ブ を 15,000 g, 4 ℃ , 10 min 遠 心 し 、 沈 殿 を 残 し て 上 清 を 完 全 に 取 り 除 い た 。 超 遠 心 チ ュ ー ブ の 方 に 450 μ L

の RNA solution を 加 え 軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ し 、 沈 殿 を 完 全 に 溶 か し た 。 RNA 溶

液 を 全 量 微 量 遠 心 チ ュ ー ブ に 移 し 、 ピ ペ ッ テ ィ ン グ し て 微 量 遠 心 チ ュ ー ブ 内 の 沈

殿 も 全 て 溶 か し た ら 、 ボ ル テ ッ ク ス を 用 い て よ く 懸 濁 し た 。RNA 溶 液 に 45 μ L

除 い た 後 、ア ス ピ レ ー タ ー で 5 min 乾 燥 さ せ た 。沈 殿 が 乾 い た ら 450 μ L の RNA

solution、45 μ L の 3 M CH3COONa(pH5.2)を 加 え 懸 濁 し た 後 遠 心 し た 。遠 心 後 、

フ ェ ノ ー ル ク ロ ロ ホ ル ム で 処 理 し 、エ タ ノ ー ル で 沈 殿 さ せ た 。30 分 以 上 置 い た ら 、

遠 心 し 、70 %エ タ ノ ー ル で 沈 殿 を 洗 っ た 後 ア ス ピ レ ー タ ー で 乾 か し た 。沈 殿 が 乾

い た ら diethyl pyrocarbonate (DEPC)水 に 懸 濁 し 、 こ れ を RNA 溶 液 と し た 。

2-2-1-2 RT-PCR

抽 出 し た RNA を 、 以 下 の よ う に DNase 処 理 し た 後 、 cDNA を 合 成 し 、 そ れ を 用

い て PCR を 行 い リ ン 酸 ト ラ ン ス ポ ー タ ー 遺 伝 子 の 発 現 量 を 調 べ た 。

＜DNase 処 理 ＞

下 記 の よ う に 調 製 し た RNA 溶 液 を 、 37 ℃ で 30min 処 理 し た 後 、 DEPC dH2O

を 300 μ L 加 え 、 フ ェ ノ ー ル ク ロ ロ ホ ル ム 処 理 、 ク ロ ロ ホ ル ム 処 理 を し た 。 3 M CH3COONa 45 μ L、 1 mL エ タ ノ ー ル を 加 え −30 ℃ の フ リ ー ザ ー で 30 分 以 上 置 き 沈 殿 さ せ た 。 エ タ ノ ー ル 沈 殿 後 遠 心 し 、 上 澄 を 取 り 除 い て DEPC dH2O に 懸 濁 し た 。 total RNA 171 μ L(10〜 50μ g) 10×DNaseⅠ buffer 20 μ L RNase inhibition(40U/μ L) 1 μ L DNaseⅠ 8 μ L total 200 μ L ＜1st strand cDNA 合 成 ＞ DNase 処 理 後 の サ ン プ ル に 下 記 の も の を 加 え 、70 ℃ 、10min 処 理 し た 後 、4 ℃ に 5 分 以 上 置 い た 。 13.5 μ L の 2×RT を 加 え た 後 、 50 ℃ 60min→ 99 ℃ 5min →4 ℃ に 5 分 以 上 置 き 、TE を 80 μ L 加 え て 加 え −30℃ の フ リ ー ザ ー で 保 存 し た 。 total RNA 5 μ g

primer (oligo (dT)) 0.5 μ L (2.5pmol)

DEPC dH2O

total 6.5 μ L

2×RT (6.5 本 分 )

2.5mM dNTPs 52 μ L

Rever Tra Ace (100U) 6.5 μ L

RNase inhibition (20U) 3.25 μ L

＜PCR＞

cDNA を template と し て 、 PCR で 増 幅 を 行 っ た 。

[95℃ 4min30sec、(95℃ 30sec、60℃ 30sec、72℃ 30sec)22〜 50cycles、72℃ 7min、 4℃ ∞ ]

(６ 本 分 )

10×KOD plus buffer (TOYOBO) 13.0 μ L

2 mM dNTPs 13.0 μ L

25 mM MgSO4 10.4 μ L

template 2.0 μ L

primer (F) 3.2 μ L

primer (R) 3.2 μ L

KOD plus DNA pol. (TOYOBO) 2.6 μ L

PTB5： (Moseley et al., 2005) 5’-CTCAACCCAGTTGGCAATTTACTTT-3’、 5’-GCCTTGTTCGAGTCCCAGT-3’ PTB6： (Moseley et al., 2005) 5’-TTCTTCCTGAACCGCATCTT-3’、 5’-GCTCTTCGCTCCCTTGTAGA-3’ PTA1： (Moseley et al., 2005)

5’-TGCCGTCCATGCCCTTAACAC-3’、 5’-GTGGACAACCGCACCAAGTTCT-3’ PTA2： (Moseley et al., 2005)

5’-CATGGGCTTCGCATGGATGTTTGTT-3’、 5’-ATTGGTGACGGGAATGATAGCGT-3’ PTA3： (Moseley et al., 2005)

5’-CATGGGCTTCGCATGGATGTTTGTT-3’、 5’-TGCCGTGGGCTGCTGCTTGT-3’

PTA4： (Moseley et al., 2005)

2-2-3 組 み 替 え 株 の 確 認 以 下 の 手 順 で Synechococcus 野 生 株 お よ び 、 PTB2 導 入 株 の DNA を 抽 出 し た 。 １ ． 光 独 立 栄 養 条 件 下 で 液 体 振 盪 培 養 を 行 っ た OD7 3 0＝1.0 の 細 胞 10 mL を 使 用 し た 。10 mL の 遠 心 チ ュ ー ブ に 分 注 し 、 4℃ 、 3500 rpm、 10 分 間 遠 心 し 、 デ カ ン テ ー シ ョ ン で 上 清 を 除 い た 。 ２ ．1×TE を 1 mL 加 え 細 胞 を 懸 濁 し 、 1.5 mL の 遠 心 チ ュ ー ブ に 移 し た 。 そ の 後 、 4℃ 、 15000 rpm、 5 分 間 遠 心 し 、 上 清 を 捨 て た 。 ３ ． 上 清 に 1×TE を 500 μ L 加 え 細 胞 を 懸 濁 し た 後 、 中 性 フ ェ ノ ー ル を 200 μ L 加 え た 。 細 胞 を 懸 濁 し 、4℃ 、 15000 rpm、 5 分 間 遠 心 し た 。 ４ ． 上 清 を 新 し い 遠 心 チ ュ ー ブ に 移 し 、 上 清 に 中 性 フ ェ ノ ー ル 、 ク ロ ロ ホ ル ム を 100 μ L ず つ 加 え 、 懸 濁 し 、 4℃ 、 15000 rpm、 5 分 間 遠 心 し た 。 ５ ．上 清 を 新 し い 遠 心 チ ュ ー ブ に 移 し 、ク ロ ロ ホ ル ム を 200 μ L 加 え 懸 濁 し 、4℃ 、 15000 rpm、 5 分 間 遠 心 し た 。 ６ ．上 清 を 新 し い 遠 心 チ ュ ー ブ に 移 し 、SolutionⅢ を 200 μ L、100%エ タ ノ ー ル を 1 mL 加 え −80℃ で 5 分 間 冷 凍 し た 。 ７ ． ６ ． の 懸 濁 液 を 室 温 で 溶 か し 、 グ リ コ ー ゲ ン 1 μ L 加 え 、 4℃ 、 15000 rpm、 5 分 間 遠 心 し た 。 ８ ． 沈 殿 に 70%エ タ ノ ー ル を 200 μ L 加 え 懸 濁 し 、 4℃ 、 15000 rpm、 5 分 間 遠 心 し た 。 ９ ． 沈 殿 を 20 μ L の 1×TE に 溶 か し 、 20℃ で 保 存 し た 。 1×TE 1 M Tris-HCl 5 mL 0.5 M EDTA 1 mL dH2O up to 500 mL SolutionⅢ

CH3COOK 60 mL（ Stock conc. 5M）

CH3COOH 11.5 mL（ Stock conc. 18N）

dH2O up to 100 mL

DNA 抽 出 後 、 PTB2 プ ラ イ マ ー を 用 い て 以 下 の 条 件 で PCR を 行 い 、 反 応 後 の サ

4℃ ∞ ] (６ 本 分 )

10×KOD plus buffer (TOYOBO) 13.0 μ L

2 mM dNTPs 13.0 μ L

25 mM MgSO4 10.4 μ L

template 2.0 μ L

primer (F) 3.2 μ L

primer (R) 3.2 μ L

KOD plus DNA pol. (TOYOBO) 2.6 μ L

ヒ 酸 の 調 製

Na2AsHO4・7H2O(和 光 純 薬 特 級 )を dH2O、ま た は 、実 験 に よ っ て は BG-11(+P,-P)

培 地 、1×TAP(+P,-P)培 地 で 1 M に 調 製 し 、0.2μ M フ ィ ル タ ー を 用 い 濾 過 滅 菌 し 室

温 で 保 存 し た 。な お 、リ ン 酸 欠 乏 条 件 下 の 実 験 に お い て は 、Sodium arsenate dibasic

heptahydrate (SIGMA-ALDRICH, 純 度 99.998 %)を 使 用 し た 。 2-2-6 細 胞 内 リ ン 、 ヒ 素 蓄 積 量 の 測 定 対 数 増 殖 期(OD7 3 0=0.3)ま で 培 養 し た 細 胞 を 、25℃ 、3500 rpm、15 分 間 遠 心 し た 。 遠 心 後 の 細 胞 を 新 し い BG-11(+P)培 地 に 移 し 、1 時 間 通 気 培 養 し て 細 胞 を 慣 ら し た 。 1 時 間 後 の 細 胞 を ヒ 酸 添 加 前 (0 時 間 )の サ ン プ ル と し て 回 収 し た 。終 濃 度 150 mM に な る よ う ヒ 酸 を 添 加 し 、ヒ 酸 添 加 後 15 分 、 30 分 、 1 時 間 、 8 時 間 、 24 時 間 、 36 時 間 の 細 胞 を 回 収 し た 。 細 胞 回 収 時 は 次 の よ う に 操 作 し た 。1/100 tween20 を 5μ L 入 れ た 遠 心 チ ュ ー ブ にculture 1mL を 採 取 し た 。採 取 し た culture は す ぐ に 4℃ 、15000 rpm で 1 分 遠 心 し た 。 上 清 を 取 り 除 い た ら 、 BG-11(-P)培 地 1 mL を 入 れ て 細 胞 を 懸 濁 し 、1/100 tween20 を 5μ L 入 れ て 再 度 1 分 遠 心 し た 。 こ の 操 作 を 2 回 繰 り 返 し た 後 、 上 清 を 完 全 に 取 り 除 い た 。

採 取 し た 細 胞 を 湿 式 灰 化 し た 。 採 取 し た 細 胞 に 硝 酸(Nitric Acid 1.42, Ultrapur,

Cat. No. 28163-5B, 関 東 化 学 , 500mL)を 500 μ L 加 え 、 細 胞 を 可 溶 化 し た 後 、 ヒ

ー ト ブ ロ ッ ク に て 80℃ で 10 分 間 、110℃ で 30 分 間 反 応 さ せ た 。反 応 後 の サ ン プ ル

を 室 温 ま で も ど し 、 過 酸 化 水 素(Hydrogen Peroxide, Ultrapur, Cat. No. 8084-2B,

250mL, 関 東 化 学 )2mL を 加 え て ゆ っ く り 混 合 し て か ら 、 110℃ で 30 分 間 反 応 さ せ

た 。 サ ン プ ル に 100 ppb に 調 製 し た Te 溶 液 を 1 mL 加 え 内 標 準 と し た 後 、 超 純 水

に よ り 10 mL に 定 容 し 、 ICP-MS 測 定 用 サ ン プ ル と し た 。

作 製 し た サ ン プ ル を 、 同 心 円 状 の ネ ブ ラ イ ザ ー と サ イ ク ロ ン ス プ レ ー チ ャ ン バ ー (Glass Expansion, West Melbourne, Australia)と 接 続 し た ICP-MS(ELAN DRC-e; PerkinElmer SCIEX, Concord, Canada)に て 測 定 し た 。 な お 、 塩 化 ア ル ゴ ン に よ る

干 渉 を 防 ぐ た め 、 酸 素 を 流 入 し 酸 化 ヒ 素 と し て 測 定 を 行 っ た(a dynamic reaction

cell(DRC)法 )。 ICP-MS 分 析 の 条 件 を Table 2 に 示 す 。

Table 2 ICP-MS 測 定 条 件

プ ラ ズ マ 出 力

1550 W

ネ ブ ラ イ ザ ー ガ ス 流 量

Ar 1.04 L min

リ ア ク シ ョ ン ガ ス

O

(純 度 ： 99.999%)

セ ル ガ ス 流 量

He 0.8 mL min

RPq

0.5

軸 方 向 電 界 電 圧

325-350 V

対 数 増 殖 期(OD7 3 0=0.3) ま で 培 養 し た 細 胞 を 、 50 mL polypropylene conical

tube(FALCON)に 採 取 、 H-30R (KOKUSAN)に て 25 ℃ 、 3500 rpm、 15 min 遠 心

2-3 結 果

2-3-1 Chlamydomonas 野 生 株 及 び ヒ 酸 耐 性 株 の リ ン 酸 輸 送 体 遺 伝 子 の 発 現

Chlamydomonasに お い て は 、 光 合 成 系 の 変 異 株 に お い て ヒ 酸 耐 性 能 が 報 告 さ れ

て き た(Hudock et al., 1979; Spreitzer and Mets, 1981, 1982)。こ う い っ た 株 で は 、

光 合 成 系 の 損 傷 に よ り 、 光 リ ン 酸 化 が 低 下 し 細 胞 内 の リ ン 酸 プ ー ル が 保 た れ る こ と に よ り 、ADP-Asの 生 成 が 抑 制 さ れ る た め ヒ 酸 耐 性 能 を も つ の で は な い か と 考 え ら れ て い た 。 そ こ で 、野 生 株 及 びphosphoribrokinaseを 欠 損 し た光 合 成 系 損 傷 株 で あ るCC981 を 含 め た ヒ 酸 耐 性 株 に つ い て 、 リ ン 酸 十 分 条 件 下 に お け る リ ン 酸 輸 送 体 遺 伝 子 の 発 現 を 調 べ た 。 結 果 、 野 生 株 と 変 異 株 の 間 で 、 発 現 レ ベ ル が 異 な る 遺 伝 子 が 存 在 す る

こ と が 明 ら か と な っ た(Fig. 6)。 CC981で はPTA2、 PTA4、 AR3で は PTA2、 PTB2

2-3-4 Synechococcus 野 生 株 及 び PTB2 導 入 株 の ヒ 酸 耐 性 リ ン 酸 十 分 条 件 下 で 対 数 増 殖 期 ま で 培 養 し た 細 胞 20 μ L を 、 2.98 mL の BG-11(+P)培 地 、 も し く は 種 々 の 濃 度 の ヒ 酸 溶 液 に 添 加 し そ の 後 の 生 育 を 調 べ た と こ ろ 、 野 生 株 、PTB2 導 入 株 と も に ヒ 酸 170 mM 存 在 下 ま で は っ き り と 生 育 が 確 認 さ れ た(Fig. 9)。 2-3-5 Synechococcus 野 生 株 及 び PTB2 導 入 株 の リ ン 酸 十 分 条 件 下 に お け る 細 胞 内 リ ン 、 ヒ 素 蓄 積 量 リ ン 酸 十 分 条 件 下 に て 対 数 増 殖 期 ま で 培 養 し た 細 胞 に ヒ 酸 を 終 濃 度 150 mM に な る よ う 添 加 し 、 そ の 後 の 細 胞 内 蓄 積 量 を 調 べ た と こ ろ 、 リ ン 、 ヒ 素 と も に 野 生 株 と 変 異 株 で あ ま り 大 き な 差 は み ら れ な か っ た(Fig. 10)。 2-3-6 Synechococcus 野 生 株 及 び PTB2 導 入 株 の リ ン 酸 欠 乏 条 件 下 に お い た 細 胞 内 リ ン 酸 、 ヒ 酸 取 込 み 速 度 リ ン 酸 十 分 条 件 に て 対 数 増 殖 期(OD7 3 0=0.3)ま で 培 養 し た 細 胞 で 、リ ン 酸 及 び ヒ 酸 の 取 込 み 初 速 度 を 上 清 中 の 成 分 の 減 少 か ら 求 め よ う と 試 み た が 、 リ ン 酸 十 分 細 胞 で

は 、 取 込 み 活 性 が 低 く 、 測 定 す る こ と が で き な か っ た(data not shown)。 そ こ で 、

リ ン 酸 、 ヒ 酸 取 込 み 活 性 を 調 べ る 際 に は 、 リ ン 酸 欠 乏 条 件 に お い た 細 胞 を 用 い た 。 リ ン 酸 欠 乏 条 件 下 に て 培 養 し た 細 胞 に 、 終 濃 度 10 μ M に な る よ う リ ン 酸 、 ま た は ヒ 酸 を 添 加 し 、 細 胞 内 取 込 み 速 度 を 調 べ た(Fig. 11)。 一 定 時 間 経 過 後 の 培 地 中 の リ ン 酸 ま た は ヒ 酸 濃 度 を マ ラ カ イ ト グ リ ー ン に て 測 定 し 、 ク ロ ロ フ ィ ル 量 あ た り の 取 込 み 速 度 を 求 め た 。 リ ン 酸 取 込 み 速 度 に つ い て は 、 野 生 株 と PTB2 導 入 株 に 差 は み ら れ な か っ た(Fig. 11 a)。 ま た 、 ヒ 酸 取 込 み 速 度 に つ い て は 、PTB2 導 入 株 に お い て 取 込 み 速 度 が 低 い 傾 向 で 、 ヒ 酸 に 対 す る リ ン 酸 取 込 み 速 度 の 値 が 大 き い よ う に み え た が(Fig. 11 b, c)、 t 検 定 を 実 施 し た と こ ろ 野 生 株 の 結 果 と の 間 に 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 し か し な が ら 、Synechococcus 野 生 株 が 、リ ン 酸 取 込 み 速 度 約 4 μ mol･mg- 1 _Chl・

min- 1_{に 対 し 、 ヒ 酸 取 込 み 速 度 が 約 0.14μ mol･mg}- 1 _Chl•min- 1_{と 、 約 28 倍 も の 差}

2-4 考 察 野 生 株 、CC981、 AR3 の 細 胞 内 リ ン 酸 、 ヒ 酸 取 り 込 み を 調 べ た と こ ろ 、 ヒ 酸 耐 性 を 示 す CC981 及 び AR3 は 、 野 生 株 と 比 較 し て ヒ 酸 取 り 込 み 量 は 低 く 、 リ ン 酸 取 り 込 み 量 は 高 か っ た(Murota et al., 2012)。 リ ン 酸 十 分 条 件 下 に お け る リ ン 酸 輸 送 体 遺 伝 子 発 現 を 調 べ た と こ ろ 、AR3 株 で は PTB2 の mRNA レ ベ ル が 野 生 株 よ り も 高 か っ た 点(Fig. 6)、 ま た 、 AR3 の リ ン 酸 取 り 込 み 能 が 他 株 よ り も 優 れ て い た 点 か ら

(Kobayashi et al., 2005, Murota et al., 2012)、Chlamydomonas の リ ン 酸 輸 送 体 の

う ち 、PTB2 が リ ン 酸 選 択 性 が 高 い 輸 送 体 の 一 つ で あ る 可 能 性 が 推 測 さ れ た 。

な お 、CC981 に つ い て は 、先 述 の 通 り 光 合 成 系 の 損 傷 に よ る 光 リ ン 酸 化 の 低 下 が

ヒ 素 耐 性 の 原 因 と 考 え ら れ て い た が 、 本 実 験 結 果 か ら 細 胞 内 へ の ヒ 素 取 込 み の 抑 制 が ヒ 素 耐 性 に つ な が る こ と が 明 ら か と な っ た 。

な お 、野 生 株 と 比 較 し てCC981 ま た は AR3 に て mRNA レ ベ ル が 高 か っ た PTA2、

PTA4、 PTB2 の う ち 、 PTA4 と PTB2 に つ い て は 、 リ ン 酸 欠 乏 条 件 下 に て 他 の 遺 伝 子 よ り も 顕 著 に 転 写 レ ベ ル が 上 昇 す る こ と が わ か っ て お り(Moseley et al., 2006)、 高 親 和 性 リ ン 酸 輸 送 体 で あ る こ と が 推 測 さ れ て い る 。 そ こ で 、PTB2 を シ ア ノ バ ク テ リ ア に て 発 現 さ せ る こ と で 、 よ り リ ン 酸 取 込 み 活 性 が 高 い 細 胞 を 得 ら れ な い か と 考 え た 。 実 験 に は 、Synechocystis と 同 様 、 形 質 転 換 が 可 能 で ゲ ノ ム 解 読 が 完 了 し て い て(Holtman et al., 2005)、遺 伝 子 解 析 が 容 易 な シ ア ノ バ ク テ リ ア Synechococcus sp. PCC 7942(以 下 、Synechococcus)を 使 用 し た 。

PTB2 を 組 み 込 ん だ ベ ク タ ー (Fig. 5a)を 用 い て Synechococcus の 形 質 転 換 を 行 っ た 。

Synechococcus の リ ン 酸 輸 送 体 に つ い て は 、 明 条 件 下 で Na+_{依 存 的 に 取 込 み を 行}

う low-affinity の Pit system と 、 ABC-transporter で あ る high-affinity の Pst

system の 存 在 が 明 ら か と な っ て い る (Ritchie et al., 1997)。 後 者 の Pst system に

つ い て は 、1 つ の リ ン 酸 分 子 の 輸 送 に 1 ATP を 消 費 す る こ と が 予 測 さ れ て い る

(Ritchie et al., 1997)。 ま た 、 そ の リ ン 酸 輸 送 の 活 性 は 、 ペ リ プ ラ ズ ム に 存 在 す る

リ ン 酸 結 合 タ ン パ ク SphX に よ っ て 制 御 さ れ て い る こ と が 分 か っ て い る (Falkner et

al., 1998; Archanai et al., 2011)。

al., 2011)。以 上 の こ と か ら 、本 研 究 に お い て も 実 験 開 始 時 の 野 生 株 と 導 入 株 の 細 胞 内 リ ン 量 や 細 胞 外 に 吸 着 し た リ ン 量 に 違 い が あ っ た 場 合 、 ヒ 酸 存 在 下 に お け る 生 育 速 度 に 影 響 し た 可 能 性 が あ る 。 ま た 、 ヒ 素 蓄 積 量 に つ い て は 、 や や 高 い 値 が 得 ら れ た 株 も あ っ た が(Fig. 10)、 細 胞 回 収 時 の 洗 い 操 作 な ど も 影 響 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。 PTB2 を 含 め た Chlamydomonas の リ ン 酸 輸 送 体 に つ い て は 、 先 述 の 通 り 実 験 的 に 局 在 性 が 証 明 さ れ て は い な い が 、 遺 伝 子 配 列 に 基 づ き Target P v.1.01 を 用 い た 局 在 性 の 予 測 は 行 わ れ て い る(Moseley et al., 2006)。 ク ロ ロ プ ラ ス ト 、 ミ ト コ ン ド リ ア 、 分 泌 経 路 、 そ の 他 に お け る 局 在 性 に つ い て 予 測 し 、 信 頼 度 を ス コ ア 別 に 比 較 し た と こ ろ 、PTB2 を 含 む PTB type の 輸 送 体 は 分 泌 経 路 に 局 在 し て い る 可 能 性 が 高 い こ と が 示 さ れ た 。Moseley ら は 、 細 胞 外 リ ン 酸 濃 度 低 下 時 に 、 PTB type の 輸 送 体 遺 伝 子 の 発 現 が 上 昇 す る こ と か ら も 、PTB type の 輸 送 体 が 分 泌 系 、 特 に 細 胞 膜 又 は 液 胞 膜 上 に 発 現 し て い る 可 能 性 が 高 い と 予 測 し て い る 。 以 上 の こ と か ら Chlamydomonas に お い て は 、 PTB2 は 細 胞 外 か ら の リ ン 酸 取 込 み に 関 与 し て い る 可 能 性 が 高 い と 思 わ れ る 。 本 章 で は 、Chlamydomonas の PTB2 を 導 入 し て も Synechococcus の リ ン 酸 、 ヒ 酸 取 込 み に つ い て 明 確 な 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 過 去 に も 、 本 研 究 室 に お い て Chlamydomonas PTB2 を Saccharomyces cerevisiae に お い て 発 現 さ せ よ う と 試 み

た が 、G、C 含 有 率 が 多 い Chlamydomonas の codon usage と 合 わ な か っ た た め か 、

う ま く 発 現 さ れ な か っ た(小 林 功 、 博 士 論 文 、 2003)。 今 後 、Synechococcus の 細

胞 膜 に タ ー ゲ ッ テ ィ ン グ す る シ グ ナ ル 配 列 を 用 い 、 細 胞 膜 上 で の 発 現 を 確 認 し た の ち 、 リ ン 酸 や ヒ 酸 の 取 込 み に つ い て 調 べ る 必 要 が あ る と 考 え る 。

PTB2 の 機 能 に 関 し て は 、E. coli に よ り 大 量 発 現 さ せ る 、も し く は Xenopus oocyte

Fig. 6 Chlamydomonas 野 生 株 お よ び ヒ 酸 耐 性 株 の リ ン 酸 輸 送 体 遺 伝 子 発 現 リ ン 酸 十 分 条 件 下 に お け る Chlamydomonas の リ ン 酸 輸 送 体 遺 伝 子 の 発 現 を 比 較 し た(Murota et al., 2012)。

＜ 第 3 章 ＞Synechocystis の ヒ 素 耐 性 能 と リ ン 酸 輸 送 体 の 関 係 3-1 緒 言 第 2 章 に お い て 、Synechococcus の 野 生 株 及 び C. reinhardtii PTB2 導 入 株 に お い て 、 細 胞 内 へ ヒ 酸 よ り も リ ン 酸 が 選 択 的 に 取 り 込 ま れ る こ と が 確 認 さ れ た 。 そ こ で 本 章 で は 、Synechocystis に お い て も そ の よ う な 選 択 性 が あ る の か 、ま た 、 選 択 性 が あ る な ら そ の メ カ ニ ズ ム は ど の よ う な も の か 、 調 べ る こ と と し た 。 第 2 章 で も 示 さ れ た と お り 、 シ ア ノ バ ク テ リ ア の 特 徴 の 一 つ と し て 、 非 常 に 高 い ヒ 酸 耐 性 能 を も つ と い う こ と が 挙 げ ら れ る 。 緑 藻 Chlamydomonas や Chlorella が 、 通 常 培 養 条 件 下 に て 約 1mM〜 2.5mM ヒ 酸 存 在 下 で の 生 育 が 限 界 で あ る の に 対 し 、 シ ア ノ バ ク テ リ ア は 150mM ヒ 酸 存 在 下 で も 生 育 が 可 能 で あ る (Table 3)。 こ の 高 い ヒ 酸 耐 性 能 へ の リ ン 酸 輸 送 体 の 関 与 か ら 調 べ る こ と と し た 。 Synechocystis sp. PCC6803 の リ ン 酸 輸 送 体 に つ い て は 、 先 述 の 通 り 、 ABC-transporter で あ る Pst1 と Pst2 の 存 在 が 明 ら か と な っ て い る 。 Burut-Archanai ら (2011)に よ り 、 リ ン 酸 欠 乏 時 に は Pst2、 Pst1 両 方 の 取 込 み 活 性 が 上 昇 す る が 、 と り わ け Pst1 の 活 性 が 高 く な り 、 リ ン 酸 取 込 み の 主 体 と な る こ と が 示 唆 さ れ た 。

Table 3 緑 藻 Chlamydomonas、 Chlorella、 高 等 植 物 等 の ヒ 酸 耐 性 の 比 較

分 類

種

生 育 限 界 ヒ 酸 濃 度

淡 水 性 緑 藻

Chlamydomonas

reinhardtii

〜

1 mM (Murota et al., 2012)

淡 水 性 緑 藻

Chlorella vulgaris

〜

2.66 mM (Jiang et al., 2011)

海 水 性 緑 藻

Tetraselmis chuii

〜

0.67 mM (Irgolic, 1977)

海 水 性 緑 藻

Ostreococcus tauri

〜

0.1 mM (Zhang et al., 2013)

高 等 植 物

Arabidopsis

_〜

_{1 mM (Lee et al., 2003)}

高 等 植 物

Rice

_〜

_{30 μ M (Chen et al., 2011)}

3-2 実 験 操 作 3-2-1 Synechocystis 野 生 株 、 Δ pst1、 Δ pst2 の ヒ 酸 耐 性 の 比 較 リ ン 酸 十 分 条 件 下 に お け る ヒ 酸 耐 性 の 比 較 に つ い て は 、2-2-4 同 様 に 操 作 し た 。 リ ン 酸 欠 乏 条 件 下 の 実 験 に つ い て は 、 対 数 増 殖 期(OD7 3 0=0.3)ま で 培 養 し た 細 胞 を 2-2-6 同 様 に 処 理 し 、 リ ン 酸 欠 乏 状 態 に し た 細 胞 を 使 用 し た 。 ま た 、 リ ン 酸 欠 乏 条 件 で の viability に つ い て は 、 ヒ 酸 添 加 後 2 時 間 〜 36 時 間 に 定 期 的 に 細 胞 10 µL を 回 収 し 、BG-11 で 作 製 し た プ レ ー ト 上 に 2 μ L ず つ ス ポ ッ ト し た 。プ レ ー ト は 弱 光 下 に 置 き 、 コ ロ ニ ー 形 成 率 を 調 べ た 。 3-2-2 ヒ 酸 (150 mM)存 在 下 に お け る 生 育 の 比 較 対 数 増 殖 期(OD7 3 0=0.3)ま で 培 養 し た 細 胞 に 、 終 濃 度 150 mM に な る よ う ヒ 酸 を 添 加 し 、0、 8、 24、 36 時 間 後 の 濁 度 (OD7 3 0)を 測 定 し た 。 3-2-3 光 合 成 活 性 の 測 定 対 数 増 殖 期(OD7 3 0=0.3)ま で 培 養 し た 細 胞 に 、 終 濃 度 150 mM に な る よ う ヒ 酸 を 添 加 し 、0、 15、 120、 240 分 後 の 光 合 成 活 性 を 測 定 し た 。 光 合 成 活 性 の 測 定 は 下 記

の よ う に 行 っ た 。 酸 素 電 極 は Rank Brothers Model 300 を 使 用 し た 。

ン 1 μ L を 加 え 、 ボ ル テ ッ ク ス に て よ く 混 合 し た 。 混 合 後 、 -80 ℃ で 10 分 間 も し く は-30 ℃ で over night で イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。そ の 後 、15,000rpm、4℃ 、 10 分 間 遠 心 し 、 上 澄 み を 完 全 に 捨 て た 。 ７ ．70 %エ タ ノ ー ル を 1 mL 入 れ 、 エ ッ ペ ン を 何 回 か 転 倒 さ せ て 沈 殿 を 洗 っ た 。 そ の 後 、 ４ ℃ 、3,500rpm、 10 分 間 遠 心 し た 。 ８ ． 上 清 を 完 全 に 除 き 、 沈 殿 を 減 圧 下 で 5 分 間 乾 燥 さ せ た 。 ９ ． 沈 殿 を DEPC 水 30 μ L で 溶 解 し 、 試 料 溶 液 と し た 。 Lysis buffer 2％ SDS、 10 mM 酢 酸 ナ ト リ ウ ム ＜ 試 料 溶 液 の 核 酸 濃 度 の 算 出 ＞ RNA 試 料 溶 液 を 2 μ L を と り 、こ の 溶 液 の OD2 6 0、OD2 8 0を 測 定 し た 。測 定 に は

SHIMADZU BIOTECH BioSpec-nano を 用 い た 。

＜DNase 処 理 ＞

１ ． 得 ら れ た RNA 試 料 溶 液 か ら RNA 10〜 50 μ g の 試 料 を 取 り 出 し 、 DEPC 水 で

43 μ L に メ ス ア ッ プ し た 。

２ ．10×DNase buffer 5 μ L、 Rnase inhibitor 0.5 μ L、 DNaseⅠ 1μ L を 各 サ

5×RT buffer 16 µL 2.5mM dNTPs 16 µL DEPC 水 3.5 μ L

Ribonuclease Inhibitor 0.5 µL

を 加 え 、25 ℃ で 5 分 間 反 応 さ せ た 。

４ ．Rever Tra Ace 4 μ L を 加 え 、 以 下 の 温 度 、 時 間 で 逆 転 写 反 応 を 行 い 、 cDNA

を 合 成 し た 。 25℃ 10 分 間 42℃ 50 分 間 70℃ 15 分 間 4℃ ∞ ＜ 定 量 PCR＞

試 薬 は Rotor-Gene SYBR Green (QIAGEN)を 使 用 し 、 下 記 の 割 合 で 混 合 し た 。

PCR は Rotor-Gene Q(QIAGEN)を 使 用 し た 。 (サ ン プ ル 1 本 あ た り )

2×Rotor-Gene SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL

Primer (F) 2.5 μL

Primer (R) 2.5 μL

Template 2 μL

RNase-free water 5.5 μL

Cycling condition

pstS2： (Pitt et al., 2010) 5’-AGCGGCAACGGTTAAGCA-3’、 5’-GTTACGGCGGGCAAAGGT-3’ pstC2： (Pitt et al., 2010) 5’-CTGGTGGCGGGATTGGT-3’、 5’-ATGTCCCGGCTGATGGAA-3’ phoA： (Pitt et al., 2010)

3-3 結 果 3-3-1 Synechocystis 野 生 株 と リ ン 酸 輸 送 体 シ ス テ ム 欠 損 株 Δ pst1、Δ pst2 の 比 較 3-3-1-1 ヒ 酸 耐 性 能 ヒ 酸 濃 度 0〜 200 mM に 調 整 し た BG-11(+P)培 地 に 細 胞 懸 濁 液 を 添 加 し 、 そ の 後 約 1 週 間 後 の growth を 調 べ た と こ ろ 、野 生 株 と Δpst2 株 は 150 mM ヒ 酸 存 在 下 で 生 育 が み ら れ た(Fig. 12 a)。 一 方 、 Δpst1 は ヒ 酸 濃 度 100 mM ま で 生 育 が 確 認 さ れ た が 、 そ れ 以 上 の 濃 度 で は ほ と ん ど 生 育 し な か っ た 。 そ こ で 、ヒ 酸 耐 性 に 差 が み ら れ た 150 mM ヒ 酸 存 在 下 に お け る 生 育 を 経 時 的 に 調 べ た(Fig. 13)。通 常 培 養 条 件 に て 、対 数 増 殖 期 (OD7 3 0=0.3)ま で 培 養 し た 細 胞 に 終 濃 度 150 mM に な る よ う ヒ 酸 を 添 加 し た 。添 加 後 か ら 24 時 間 ま で は 、Δpst2 の growth が 他 の 2 株 よ り も や や 早 い 傾 向 に も み え る が 、添 加 後 36 時 間 ま で は 3 株 の growth に あ ま り 大 き な 差 は み ら れ な か っ た 。 ま た 、150 mM ヒ 酸 存 在 下 に お い て 、 光 合 成 へ の 影 響 は あ る の か 調 べ る た め 、 通 常 培 養 条 件 下 に て 培 養 し た 細 胞 に 150 mM の ヒ 酸 を 添 加 後 、光 合 成 活 性 を 経 時 的 に 測 定 し た(Fig. 14)。ヒ 酸 添 加 30 分 で 、3 株 と も に 光 合 成 活 性 が 添 加 前 の 50%程 度 ま で 低 下 し た が 、 添 加 2 時 間 後 に は 添 加 前 と ほ ぼ 同 程 度 ま で 活 性 が 回 復 し 、 そ の 後 も 活 性 の 低 下 は み ら れ な か っ た 。 リ ン 酸 欠 乏 条 件 下 で リ ン 酸/ヒ 酸 取 り 込 み を 誘 導 し た 場 合 に つ い て も 、ヒ 酸 耐 性 の 比 較 を 検 討 し た 。リ ン 酸 欠 乏 条 件 下 に 24 時 間 お い た 細 胞 を 、ヒ 酸 を 含 む BG-11(-P) 培 地 に 加 え 同 様 に growth を 調 べ た と こ ろ 、 ヒ 酸 を 全 く 含 ま な い コ ン ト ロ ー ル で も 生 育 が み ら れ な か っ た(Fig. 12 b)。 そ こ で 、 こ れ ら の 細 胞 の バ イ ア ビ リ テ ィ を 検 討 し た 。 リ ン 酸 欠 乏 条 件 で 培 養 し た 細 胞 に 、 終 濃 度 200 mM に な る よ う ヒ 酸 を 添 加 し て 振 と う 培 養 し 、 一 定 時 間 経 過 後 の 細 胞 の リ ン 酸 存 在 下 で の バ イ ア ビ リ テ ィ を 寒 天 培 地 上 で 調 べ た と こ ろ 、野 生 株 と Δpst2 株 は ヒ 酸 添 加 後 6 時 間 ま で コ ロ ニ ー 形 成 が 確 認 さ れ た(Fig. 12 c)。 Δpst1 株 に お い て は 、 ヒ 酸 添 加 24 時 間 後 ま で 生 存 が 確 認 で き 、 他 の 2 株 よ り も 高 い バ イ ア ビ リ テ ィ が 示 さ れ た 。 3-3-1-2 リ ン 酸 十 分 条 件 下 、 ヒ 酸 添 加 後 の 細 胞 内 リ ン 、 ヒ 素 含 量 の 推 移 長 期 の growth に 影 響 が み ら れ た 150 mM の ヒ 酸 を 添 加 し た 際 、 細 胞 内 に は ど の 程 度 の ヒ 素 が 蓄 積 さ れ る の か 、ま た 、同 時 に リ ン の 蓄 積 は ど の よ う に な っ て い る か 、

ICP-MS に よ り 調 べ た (Fig. 15)。 対 数 増 殖 期 (OD7 3 0=0.3)ま で 培 養 し た 細 胞 に 、 終 濃

度 150mM に な る よ う ヒ 酸 を 添 加 し 、一 定 時 間 経 過 後 の 細 胞 を 回 収 し 、細 胞 内 リ ン 、

に あ ま り 大 き な 差 は み ら れ な か っ た 。 一 方 、 ヒ 素 に つ い て は 、 添 加 1 時 間 後 に 野 生

株 、 Δpst2 株 が 細 胞 あ た り 3〜 4×10- 9_{μg 程 度 の 蓄 積 量 で あ っ た の に 対 し 、 Δpst1}

株 は 約 1×10- 8_{μg の ヒ 素 を 蓄 積 し て い た 。}

3-3-1-3 リ ン 酸 欠 乏 条 件 に お い た 細 胞 の リ ン 酸 、 ヒ 酸 取 込 み 速 度

第 2 章 同 様 、 リ ン 酸 十 分 条 件 に お い て は 取 り 込 み 活 性 が 低 く 、 測 定 す る こ と が で

き な か っ た た め(data not shown)、 リ ン 酸 欠 乏 条 件 下 に て 実 験 を 行 っ た 。 細 胞 を リ

ン 酸 欠 乏 条 件 に 24 時 間 お い た 細 胞 に 、終 濃 度 10μ M に な る よ う リ ン 酸 ま た は ヒ 酸 を 添 加 し て 、 一 定 時 間 経 過 後 の 培 地 中 の リ ン 酸 ま た は ヒ 酸 濃 度 を 調 べ た(Fig. 16)。 濃 度 の 測 定 に は 、 マ ラ カ イ ト グ リ ー ン に よ る 呈 色 法 を 使 用 し た 。 リ ン 酸 の 取 込 み に 関 し て は 、野 生 株 と Δpst2 株 に お い て リ ン 酸 添 加 直 後 か ら 急 速 な 取 込 み が み ら れ た 。 添 加 2 分 後 に は 培 地 中 濃 度 約 3μ M に な る ま で 取 込 み が 起 こ り 、添 加 3 分 後 に は 取 込 み を ほ ぼ 終 え て い た 。一 方 、Δpst1 株 は 添 加 直 後 か ら 急 速 な 取 込 み は み ら れ ず 、 培 地 中 濃 度 5μ M に な る ま で 添 加 後 15 分 か け て ゆ っ く り と 取 り 込 ん だ 。 ヒ 酸 の 取 込 み に つ い て は 、野 生 株 と Δpst2 株 に お い て ヒ 酸 添 加 直 後 〜 約 2 分 後 ま で 最 も 急 速 な 取 込 み が み ら れ 、15 分 後 の 培 地 中 ヒ 酸 濃 度 は そ れ ぞ れ 、6.6 μ M、8.8 μM と な っ た 。 Δpst1 株 は 、 他 の 2 株 と 比 較 す る と 添 加 直 後 か ら 15 分 後 ま で や や ゆ っ く り と し た 取 込 み が み ら れ た 。添 加 15 分 後 の 培 地 中 ヒ 酸 濃 度 は 10.6 μ M で あ っ た 。 同 様 に し て 、細 胞 の 濃 度 を 1/2、2 倍 と 変 え て 正 確 な 傾 き (初 速 度 )を 求 め た (Fig. 17)。 そ の 結 果 、リ ン 酸 の 取 込 み に つ い て は 、野 生 株 と Δpst2 株 で は 3.5 μ mol•mg- 1 _Chl

•min- 1以 上 で あ っ た の に 対 し 、 Δpst1 株 で は 0.3 μ mol•mg- 1 _Chl•min- 1程 度 で あ

21 a)。

ヒ 素 の 蓄 積 量 に つ い て は 、ヒ 酸 添 加 後 1 時 間 の 時 点 で Δpst1 と Δ pstS1 に 差 が み

ら れ た 。Δpst1 株 が ヒ 酸 添 加 1 時 間 後 で 約 1.4 μ mol As (101 0 _cells)- 1_{(culture あ た}

り 100 μ g・mL- 1_{)ま で 蓄 積 量 が 上 昇 し た の に 対 し 、ΔpstS1 は 添 加 1 時 間 後 で も 約}

0.2μ mol As (101 0 _cells)- 1_{(culture あ た り 30 μ g・mL}- 1_{)の 蓄 積 に と ど ま っ た (Fig. 21}

c,g)。そ し て 、添 加 36 時 間 経 過 後 も 、野 生 株 、Δpst1 株 は 約 2.5〜 3.5 μ mol As (101 0

cells)- 1_{(culture あ た り 1000 μ g・mL}- 1_{)と 、同 程 度 の ヒ 素 蓄 積 量 で あ っ た の に 対 し 、}

ΔpstS1 株 は 0.5〜 1 μ mol As (101 0 _cells)- 1_{(culture あ た り 500 μ g・ mL}- 1_{)と 、 低}

い 蓄 積 量 を 維 持 し て い た(Fig. 21 d, h)。

3-3-2-3 リ ン 酸 欠 乏 条 件 下 で の 細 胞 内 リ ン 酸 、 ヒ 酸 取 込 み 速 度

3-3-1-4 と 同 様 の 実 験 を 行 い 、 リ ン 酸 結 合 タ ン パ ク 質 が リ ン 酸 、 ヒ 酸 取 込 み 速 度

に 及 ぼ す 影 響 を 調 べ た(Fig. 22)。 野 生 株 と 比 較 す る と 、 ΔpstS1 株 の リ ン 酸 の 取 込

3-4 考 察 Δpst1、 Δ pst2 株 は 、 独 立 栄 養 条 件 下 (リ ン 酸 十 分 条 件 下 )に お い て 野 生 株 と 同 様 の 生 育 を 示 す こ と 、 及 び リ ン 酸 欠 乏 条 件 で 48 時 間 経 過 し て も 、 野 生 株 と Δpst1、 Δpst2 の 細 胞 内 リ ン 量 に あ ま り 差 が な い こ と が わ か っ て い る (Burut-Archanai et al., 2011)。 本 研 究 で は 、 リ ン 酸 輸 送 体 欠 損 株 を 使 っ て 野 生 株 と ヒ 酸 耐 性 を 比 較 し た と こ ろ 、 リ ン 酸(0.2 mM)存 在 下 で は 、 野 生 株 、 Δpst2 と 比 較 し て Δ pst1 の ヒ 酸 感 受 性 が 高

か っ た(Fig. 12 a)。 し か し 、 リ ン 酸 欠 乏 条 件 下 、 ヒ 酸 濃 度 200 mM で は 、 viability

で み た 場 合 、 Δpst１ が 他 の 2 株 よ り も 高 い ヒ 酸 耐 性 能 を 示 し た (Fig. 12 c)。 リ ン 酸

欠 乏 時 に つ い て は 、Pst1 が 高 い 取 込 み 活 性 を 示 す メ イ ン の リ ン 酸 輸 送 体 で あ り

(Frances et al., 2010, Burut-Archanai et al., 2011)、 Fig. 12 c の リ ン 酸 欠 乏 条 件

ヒ 酸 添 加 時 の リ ン 欠 応 答 遺 伝 子 の 発 現 量 を 調 べ る と 、 Δpst1 に お い て は Pst2 関

連 遺 伝 子(pstS2、pstC2、phoA)の 発 現 量 が リ ン 十 分 条 件 下 で も 高 く な っ て い た (Fig.

18)。Archanai ら (2009)は 、リ ン 欠 乏 時 に 発 現 誘 導 さ れ る alkaline phosphatase が 、 Δpst1 に お い て は リ ン 十 分 条 件 下 で も 発 現 し て い た こ と か ら 、Pst1 が リ ン 欠 応 答 遺 伝 子 の リ ン 酸 十 分 条 件 下 で の 発 現 抑 制 に も 関 与 す る こ と を 示 唆 し て い る 。 こ の こ と か ら 、Δpst1 に お い て pstS2、pstC2、phoA の 発 現 量 が 増 加 す る の も 、Pst1 に よ る 発 現 抑 制 が な い こ と に よ る と 推 測 さ れ る 。 ヒ 酸 添 加 後 の 発 現 量 を み る と 、 野 生 株 、 Δpst2 に つ い て は pstS1、 pstC1、 sphX の 発 現 量 が 、Δpst1 に つ い て は pstS2、pstC2、phoA の 発 現 量 が 増 加 し て い た (Fig. 18)。こ の こ と か ら 、リ ン 十 分 条 件 で あ っ て も 、ヒ 酸 の 影 響 に よ り リ ン 欠 応 答 遺 伝 子 の 発 現 誘 導 が お こ る こ と が 本 実 験 に よ り 明 ら か と な っ た 。 な お 、Δpst1 と Δ pstS1 に お い て 取 込 み 速 度 、蓄 積 量 と も に 傾 向 が 異 な っ て い た 。 pst1 オ ペ ロ ン 全 体 の 発 現 が 抑 制 さ れ て い る 株 と 、リ ン 酸 結 合 タ ン パ ク の み の 発 現 が 抑 制 さ れ て い る 株 を 比 較 す る と 、 細 胞 内 蓄 積 量 に つ い て は リ ン 酸 結 合 タ ン パ ク の み の 発 現 抑 制 株 の 方 が 、ヒ 酸 蓄 積 量 が 抑 制 さ れ て い た(Fig. 21 c,d,g,h)。ヒ 酸 の 取 込 み 速 度 に つ い て は 、 ΔpstS1 株 と 野 生 株 の 間 で あ ま り 大 き な 差 が な か っ た の に 対 し (Fig. 22)、 Δpst1 株 は 野 生 株 の 1/2 程 度 と な っ て い た (Fig. 17)。 こ の 結 果 か ら 、 リ ン 酸 結 合 タ ン パ ク だ け で な く 、 輸 送 体 の 膜 貫 通 タ ン パ ク で あ る PstC1 や PstA1 の 働 き が 関 与 し て い る こ と が 推 測 さ れ る 。ΔpstS1 株 に お い て 発 現 し て い る PstC1 及 び PstA1 が 、取 込 み 速 度 は あ ま り 高 く な い も の の リ ン 酸 選 択 性 が 高 い 輸 送 性 を 持 つ 場 合 に 、 本 結 果 の よ う な 傾 向 を 示 す 一 つ の 要 因 と な る と 思 わ れ る 。 リ ン 酸 結 合 タ ン パ ク に よ る ヒ 酸 結 合 性 は 、 こ れ ま で に も 報 告 さ れ て い る 。Elias

ら は 、2012 年 に 、E. coli、グ ラ ム 陰 性 桿 菌 Pseudomonas fluorescens、グ ラ ム 陰 性

真 正 細 菌 Klebsiella variicola 、 同 じ く グ ラ ム 陰 性 真 正 細 菌 で あ る Halomonas

GFJA-1 に お い て 、 リ ン 酸 結 合 タ ン パ ク の リ ン 酸 、 ヒ 酸 選 択 性 に つ い て 調 べ た 。 い

ず れ も 、 ヒ 酸 と 比 較 し て 500 〜 850 倍 の リ ン 酸 選 択 性 を も ち 、 特 に Halomonas