過 酸 化 水 素 と

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過 酸 化 水 素 と

405 nm LED

ヒ ド ロ キ シ ラ ジ カ ル に よ る

Candida albicans

日 本 大 学 松 戸 歯 学 部 口 腔 健 康 科 学 講 座

歯 科 臨 床 検 査 医 学 分 野

中 西 一 、 小 西 賀 美 、 小 峯 千 明

（ 指 導 ： 福 本 雅 彦 教 授 ）

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Abstract

In recent years, various methods have been applied to prevent aspiration pneumonia in elderly people, such as oral rinsing and denture cleaning.

Antimicrobial photodynamic therapy (a-PDT), which has fewer side effects, is attracting attention.

Many studies have demonstrated that using a-PDT for bactericidal effect requires many variables to be taken into account. So, when developing the a - PDT protocol, including light parameters, photosensitizers, and light delivery techniques. However, although a-PDT has been shown to induce bactericidal effects by reactive oxygen species (ROS), the details of the amount of generated ROS is unclear. Also, the degree of bactericidal effect s have not yet been clarified. Especially, little is known on the fungicidal effect on Candida albicans (C. albicans), which is one of the causative bacteria of aspiration

pneumonia, by using a-PDT. Therefore, the details of ROS's effect via a-PDT on C. albicans that propagate in oral devices, such as dentures, should be examined. Moreover, it is necessary to investigate whether a-PDT is effective

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in preventing aspiration pneumonia.

Thus, this study aimed to examine the amount of hydroxyl radical (・OH) generated from hydrogen peroxide (H2O2) via 405 nm LED irradiation by using an electron spin resonance (ESR). Then, to clarify the effect of ・OH on C.

albicans was studied using a fungicidal test.

The photocatalyst and the visible light were used with a 1M H2O2, and 405 nm LED light source (8.69 mW/cm²). The experimental groups were allocated into four groups; phosphate buffered saline (PBS) only (control group), 1M H2O2 only (H2O2 group), 405 nm irradiation only (405 nm group), and combined with 1M H2O2+405 nm irradiation (405 nm+ H2O2 group).

The amount of ・OH was measured by an ESR by a spin-trapping method using DMPO. The mixture of PBS or 1M H2O2 (510 M) with DMPO (90 M) was immediately left at room temperature or irradiated by 405 nm LED for 60, 120, 180, 240, and 300 seconds. C. albicans was grown on a brain heart infusion agar and was adjusted to 1 x 10⁶ cells/mL of PBS. The mixture of PBS or 1M H2O2 (510 M) with C. albicans suspension (90 L) was irradiated by

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405 nm LED for 60, 180, and 300 seconds. Then, C. albicans was incubated at 37℃ for 48 hours on the ager plate and counted the colony forming unit (CFU) per volume of C. albicans suspension (CFU/mL) to investigate the fungicidal effects of ・OH. The survival rate compared to the control was then evaluated.

In 405 nm+ H2O2 group, the amount of ・ OH-generated was increased significantly by irradiation in a time-dependent manner compared with the other groups (p<0.05). In brief, at least 59 M, 143 M, and 179 M of ・OH were detected after 60, 180 and 300 seconds, resp ectively. In the fungicidal test, control and 405 nm groups showed no fungicidal effect. The H2O2 group showed a significant fungicidal effect after 180 (60%) and 300 (56%) seconds compared to the control and 405 nm groups (p<0.05), however, no significant difference was observed in the 405 nm + H2O2 group (p>0.05). In 405 nm + H2O2 group, the survival rate decreased dependently on the LED irradiation time: 60 (34%), 180 (7%), and 300 (2%) seconds showing a significant decrease compared to all groups (p<0.05).

From the above, our findings suggest that at least 179 M generated ・OH

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are necessary to achieve the fungicidal effects (>95%) on C. albicans.

Additionally, it is considered that a-PDT using ・OH is an effective cleaning method.

Keywords:

405 nm LED，hydrogen peroxide，hydoxyl radical，electron spin resonance， Candida albicans

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緒 言

2017 年 よ り 厚 生 労 働 省 が 人 口 動 態 統 計 の 中 で「 肺 炎 」か ら「 誤 嚥 性 肺

炎 」 を 別 項 目 と し て 集 計 す る よ う に な っ た 。 誤 嚥 性 肺 炎 は 本 邦 死 因 の 第

7 位 で あ る 。肺 炎 は 今 後 、減 少 傾 向 を 辿 る と 予 測 さ れ て い る 。一 方 、誤 嚥

性 肺 炎 は 将 来 的 に 2030 年 ま で 増 加 が 予 想 さ れ る ^{1 - 3 )}。 超 高 齢 社 会 を 向 か

え て い る 我 が 国 に お い て は 、 歯 科 診 療 所 に お い て の み で は な く 在 宅 や 介

護 施 設 に お い て 高 齢 者 の 口 腔 環 境 を 良 好 に 保 つ こ と が 誤 嚥 性 肺 炎 対 策 と

し て 重 要 と さ れ て い る ^{4 )}。

高 齢 者 は 加 齢 や 何 ら か の 全 身 疾 患 に 対 す る 服 薬 な ど に よ る 唾 液 量 の 減

少 ^{5 )}や 歯 の 喪 失 ^{6 )}に 伴 い 義 歯 を 装 着 し た 場 合 、 義 歯 の 清 掃 不 良 な ど 口 腔

環 境 の 悪 化 を 引 き 起 こ す 因 子 を も つ こ と が 多 い 。 一 方 、 口 腔 環 境 の 悪 化

に 関 連 す る 菌 と し て Candida 属 が あ る 。 そ の 中 の Candida albicans（ 以

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下 C. albicans） は 通 常 は 病 原 性 や 増 殖 性 が 弱 い 日 和 見 菌 だ が 、 加 齢 や 服

薬 な ど に よ り 全 身 の 免 疫 力 が 低 下 す る と 増 殖 し て 病 原 性 を 示 し 日 和 見 感

染 を 発 症 さ せ る ^{7 )}。 ま た 高 齢 者 に 装 着 頻 度 が 高 い 有 床 義 歯 に お い て 義 歯

床 用 レ ジ ン は 特 に 義 歯 床 粘 膜 面 は 唾 液 に よ る 自 浄 作 用 が 少 な い た め 、 デ

ン チ ャ ー プ ラ ー ク が 付 着 し や す い こ と が 知 ら れ て い る ^{8 )}。 デ ン チ ャ ー プ

ラ ー ク は 口 腔 常 在 菌 か ら 構 成 さ れ る が そ の 中 で も 高 頻 度 で C. albicansが

検 出 さ れ る ^{9 , 1 0 )}。C. albicans の よ う に 菌 糸 型 あ る い は 仮 性 菌 糸 と 酵 母 型

の 二 形 性 を 示 す 菌 種 で は 、 菌 糸 が 粘 膜 へ 侵 入 し 強 固 に 固 着 す る こ と に よ

っ て 再 発 を 繰 り 返 し 難 治 性 口 腔 カ ン ジ ダ 症 に 進 行 す る こ と も 稀 で は な い 。

更 に 、 誤 嚥 に よ り 真 菌 性 肺 炎 を 惹 起 す る リ ス ク も 高 く な る 。 そ れ 故 、 義

歯 を は じ め と す る 口 腔 内 装 置 に お け る C. albicans生 息 の 温 床 と な り 得 る

デ ン タ ル プ ラ ー ク を コ ン ト ロ ー ル す る こ と は 極 め て 重 要 で あ る と 考 え る 。

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一 般 に 有 床 義 歯 の 清 掃 に は 、 義 歯 用 ブ ラ シ を 使 用 す る 機 械 的 清 掃 と 義

歯 用 洗 浄 剤 を 用 い る 化 学 的 清 掃 の 2 つ に 大 き く 分 け る こ と が で き る ^{1 1 )}。

特 に 後 者 の 方 法 で は 、 酵 素 系 洗 浄 剤 や 過 酸 化 物 を 加 え た 酵 素 系 洗 浄 剤 の

タ イ プ に 分 類 さ れ 高 い デ ン チ ャ ー プ ラ ー ク の 除 去 効 果 を 示 し て い る ^{9 , 1 1 )}。

し か し 、 佐 藤 ら ^{1 2）}は 肉 眼 で 確 認 で き る Storeptococcus mutans と C.

albicans の 混 合 培 養 の バ イ オ フ ィ ル ム 付 着 が 認 め ら れ る 義 歯 の 場 合 に お

い て 、 義 歯 洗 浄 剤 に 義 歯 を 5 分 浸 漬 し た 条 件 で 、 そ の バ イ オ フ ィ ル ム の

殺 菌 率 は 約 60％ 程 度 で そ の ま ま 24 時 間 放 置 す る と 元 の 菌 数 に 戻 っ て し

ま う こ と 、さ ら に 一 晩 浸 漬 し た 条 件 に お い て も そ の 殺 菌 率 は 約 85％ 程 度

の 除 菌 効 果 で あ る こ と か ら 完 全 な 除 菌 は 困 難 で あ り 、 そ の た め 義 歯 の 望

ま し い 清 掃 方 法 は 、 義 歯 用 ブ ラ シ で 徹 底 し た バ イ オ フ ィ ル ム を 除 去 し た

後 、 一 晩 浸 漬 す る 必 要 が あ る と 報 告 し て い る 。

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近 年 、 光 増 感 剤 に 特 定 の 励 起 光 を 照 射 し そ こ か ら 発 生 す る 活 性 酸 素 種

(reactive oxygen species: ROS)に よ っ て 殺 菌 す る 抗 菌 的 光 線 力 学 療 法

(antimicrobial Photodynamic Therapy; a -PDT)を は じ め と す る 様 々 な 光

線 力 学 反 応 を 用 い た 殺 菌 方 法 1 3 , 1 4 )が 着 目 さ れ て い る 。 特 に 光 線 力 学 反 応

を 使 用 し た 方 法 は 発 生 さ せ る ROS の 種 類 に よ っ て は 真 核 細 胞 に は 比 較

的 安 全 に 使 用 可 能 で あ る こ と が 報 告 ^{1 5 , 1 6）}さ れ て い る 。Tatsumi-Arai ら は

有 床 義 歯 上 に 培 養 し た C. albicans に 対 し て 405 nm LED 青 色 光 を 照 射

す る こ と で そ の 光 線 力 学 反 応 に よ っ て 照 射 時 間 依 存 的 に 殺 菌 効 果 を 示 し

た と 報 告 し て い る ^{1 7 )}。ま た Ikai ら の グ ル ー プ は 過 酸 化 水 素 (H2O2)を 光

触 媒 と し て 用 い 、青 色 光 を 照 射 す る こ と で 発 生 す る ROS の 中 で も 最 も 強

い 酸 化 力 を 有 す る ヒ ド ロ キ シ ラ ジ カ ル (・OH)で う 蝕 病 原 因 菌 、 歯 周 病

関 連 菌 お よ び 難 治 性 根 尖 性 歯 周 炎 関 連 菌 の 殺 菌 を す る シ ス テ ム の 先 駆 者

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と し て そ の 効 果 を 多 数 報 告 ^{1 8 - 2 3）}し て い る 。し か し な が ら 、 H2O2を 光 触

媒 と し て 用 い た・OH の 発 生 量 と C. albicans の 殺 菌 効 果 を 検 討 し た 報 告

は な い 。

そ こ で 本 研 究 で は 、 科 学 的 根 拠 に 基 づ い た 義 歯 を は じ め と す る 口 腔 内

装 置 洗 浄 方 法 の 構 築 の た め 、H2O2に 対 し て 405 nm LED 青 色 光 を 照 射 す

る 事 で 発 生 し た ・OH 量 を 測 定 し C. albicans の 殺 菌 効 果 を 検 討 し た 。

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方 法 お よ び 材 料

１ ．H2O2お よ び 光 源

H2O2 の 光 分 解 に よ る ・OH 発 生 系 は Ikai ら の 報 告 ^{1 8 )}よ り 、1M H2O2

(富 士 フ イ ル ム 和 光 純 薬 、大 阪)を 使 用 し た 。ま た 、光 源 に は 405 nm LED

照 射 器(8.69 mW/cm²、モ リ タ 製 作 所 、京 都)を 用 い て 最 大 5分 間 照 射 ( 2.6

J/ cm²)を 行 っ た 。

２ ．C. albicans の 培 養

C. albicans （ATCC18804 株 ）は 、brain heart infusion （BHI、 Becton、

Dickinson and Co.、 NJ、 USA） 培 地 を 用 い て 37℃ 、24 時 間 好 気 培 養 を

行 っ た 。そ の 後 、増 殖 し た 菌 体 を 遠 心 分 離 （10,000 rpm x 10 min）行 い 、

phosphate buffered saline (PBS, pH7.4)で 2 回 洗 浄 後 、1 x 10⁶個/mL と な る

よ う に 調 整 し た 。

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３ ．H2O2に 光 照 射 す る こ と で 得 ら れ た ・OH の 測 定 お よ び 定 量

実 験 群 は 1M H2O2に 対 し て 405 nm LED 照 射 し た 群 （405 nm + H2O2

群 ）、PBS に 対 し て 405 nm LED 照 射 し た 群 （405 nm 群 ）、1M H2O2を

室 温 放 置 し た 群 （H2O2 群 ） お よ び コ ン ト ロ ー ル と し て PBS を 室 温 放 置

し た 群 （control 群 ） の ４ 群 と し た 。

・OH の 測 定 に は 2,2-Dimethyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole N-oxide （DMPO、

890 mM/L、Labotec、東 京 ）を 捕 捉 剤 と し て 用 い 、そ の 酸 化 に よ っ て 生 じ

た 安 定 ラ ジ カ ル 生 成 物 で あ る DMPO 付 加 物 (DMPO-OH、 図 1a)を 電 子 ス

ピ ン 共 鳴 （ESR、JES JFA-200、JEOL、 東 京 ） に お い て 捕 捉 し 測 定 を 行 っ

た 。 つ ま り 24 well plate の 1 well 内 に PBS も し く は 1M H2O2 (510 L)

と DMPO (90 L)を 混 和 し 、 そ こ へ 室 内 放 置 あ る い は 照 射 を 60、120、

180、240 お よ び 300 秒 間 の 経 時 的 な ・OH spin adduct の 測 定 を 行 っ た

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(n=5)。

得 ら れ た spin adduct は 、標 準 マ ー カ ー で あ る マ ン ガ ン （MnO）マ ー カ

ー と の 高 さ の 比 か ら そ れ ぞ れ signal intensity （SI 値 ） を 求 め 、 予 め 測 定

し て お い た 安 定 な 標 準 物 質 で あ る 4-hydroxy2,2,6,6-tetramethyl piperidine-

1-oxyl (TEMPOL、Sigma-Aldrich、St. Louis、MO)の 各 濃 度 か ら 得 た SI 値

(図 1b)と 比 較 す る こ と で 、 発 生 し た ・OH 量 を 定 量 し た 。

・OHを 検 出 し た 際 に 使 用 し た ESR 測 定 条 件 を 以 下 に 示 す 。す な わ ち 、

microwave power 4 ± 0.05 mW、magnetic field 335 ± 5 mT、modulation width

0.1mT、time constant 0.03 seconds、sweep width 5 mT、sweep time 1 minutes、

amplitude 80 で 測 定 を 行 っ た 。

４ ．C.albicans の 殺 菌 試 験

実 験 群 は 上 記 と 同 様 に control 群 、H2O2群 、405 nm 群 お よ び 405 nm

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+ H2O2群 と し 行 っ た 。 つ ま り 、1M H2O2 (510 L)に 対 し て DMPO (90

L)を C. albicans 混 濁 液 (90 L)に 置 換 し 混 合 後 、そ れ ぞ れ の 群 の 60 秒 、

180 秒 お よ び 300 秒 作 用 後 の 試 料 液 を 100 L 分 取 し 連 続 段 階 希 釈 法 を 行

い 、 サ ブ ロ ー 寒 天 平 板 培 地 （Difco, MI, USA） 上 に お い て 37℃で 48 時 間

好 気 培 養 を 行 っ た 。 さ ら に 培 養 終 了 後 、 コ ロ ニ ー 数 か ら 生 菌 数 （CFU/ｍ

L） を 測 定 し 、 そ の 後 control 群 の CFU と 比 較 し た 生 存 率 を 評 価 し た 。

５ ． 統 計 処 理

得 ら れ た 結 果 は 、分 散 分 析 後 、Scheffe の 多 重 比 較 検 定 を 行 っ た 。な お 、

解 析 は 統 計 解 析 ソ フ ト IBM SPSS Statistics ver.22 （IBM, Tokyo, Japan）

を 用 い 、 い ず れ の 検 定 手 法 も 有 意 確 率 は 5%と し た 。

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結 果

１ ．H2O2に 光 照 射 す る こ と で 得 ら れ た ・OH 量 の 測 定 お よ び 定 量

405 nm + H2O2群 で は 、DMPO-OH の spin adduct を 示 す 1:2:2:1 (超

微 細 結 合 定 数 aN=1.49 mT)を 示 し (図 2)、LED 照 射 時 間 依 存 的 に

DMPO-OH 生 成 量 は 増 加 し た 。 ま た 、 照 射 60 秒 後 か ら す べ て の 群 間 と

の 比 較 に お い て DMPO-OH 生 成 量 は 有 意 に 増 加 し た (p <0.05)。

さ ら に 、H2O2群 で は 時 間 依 存 的 に ・OH 発 生 量 は 増 加 し た が 、control

群 と 比 較 し DMPO-OH 生 成 量 に 有 意 な 差 は 認 め な か っ た (p >0.05)。一

方 、control 群 お よ び 405 nm 群 に お い て は ほ と ん ど ・OH の 発 生 は 認 め

な か っ た (図 3)。

２ ．C.albicans の 殺 菌 試 験

control 群 お よ び 405 nm 群 で は 、300 秒 作 用 し た 際 の 生 存 率 に 変 化 は

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認 め ら れ な か っ た 。 ま た H2O2群 で は 、 作 用 180 秒 後 か ら 生 存 率 60％ 程

度 、300 秒 後 で 56％ 程 度 で あ り 、 作 用 180 秒 後 か ら C. albicans の 生 存

率 は control 群 お よ び 405 nm 群 と 比 較 し て 有 意 な 低 下 を 示 し た 。 一 方 、

405 nm + H2O2 群 に お い て は 作 用 60 秒 後 か ら 生 存 率 が 34％ 程 度 、180

秒 後 で は 7％ 、300 秒 後 で は 2％ と LED 照 射 時 間 依 存 的 に 生 存 率 の 低 下

を 認 め た 。さ ら に 、60 秒 後 以 降 の C. albicans の 生 存 率 に お い て は control

群 、405 nm 群 お よ び H2O2群 間 と 比 較 し て 有 意 な 生 存 率 の 低 下 を 認 め た

(図 4)。

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考 察

義 歯 を 使 用 し て い る 高 齢 者 に お い て 、 義 歯 を 適 切 に 清 掃 で き る 人 の 割

合 は 16.7％ し か い な い と い う 報 告 が あ る ^{2 4）}。こ の 原 因 と し て 、義 歯 の 形

態 が 複 雑 で あ る こ と ^{2 5 )}や 、 義 歯 の 正 し い 清 掃 方 法 を 理 解 し て い な い ^{2 6）}

と い う こ と が 挙 げ ら れ る 。 そ の よ う な 背 景 か ら よ り 簡 易 で 効 率 の 良 い 義

歯 清 掃 方 法 の 開 発 が 求 め ら れ 、 様 々 な 方 法 が 試 み ら れ て い る ^{2 7 - 2 9）}。 し か

し な が ら 、 選 択 肢 の 幅 こ そ 増 加 し て い る も の の 、 劇 的 な 効 果 を 得 る ま で

に は 至 ら な い の が 現 状 で あ る 。

そ こ で 本 研 究 で は 、a-PDT を 義 歯 洗 浄 に 応 用 す べ く 日 常 に お い て も 外

用 殺 菌 消 毒 剤 と し て 頻 用 さ れ る 2.5～3.5 w/v% オ キ シ ド ー ル (約 1 M

H2O2 に 相 当)を 光 触 媒 と し て 用 い て 、 そ こ へ 人 体 に も 使 用 可 能 な 可 視 光

線 で あ る 405 nm LED を 照 射 す る こ と で H2O2の 光 分 解 反 応 よ り 発 生 し

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た ・OH の C. albicans に 対 す る 殺 菌 効 果 を 評 価 し た 。結 果 、1 M H2O2に

405 nm LED を 照 射 す る こ と で 照 射 時 間 依 存 的 に・OH 発 生 量 が 増 加 し 、

そ れ に 伴 っ て C. albicans の 生 存 率 は 低 下 し た 。 つ ま り 、C. albicans を

60%、90％ お よ び 95％ 以 上 殺 菌 す る た め に は 少 な く と も ・OH 発 生 量 が

そ れ ぞ れ 約 59 M、143 M お よ び 179 M が 必 要 で あ っ た こ と が 示 唆 で

き る 。 す な わ ち 光 分 解 反 応 を 用 い た C. albicans の 殺 菌 は 、60 秒 照 射 と

い う 短 時 間 で 一 定 の 効 果 を 示 す こ と が 可 能 で あ る 。

一 方 、・OH が 発 生 し な か っ た control 群 お よ び 405 nm 群 で は C.

albicans の 殺 菌 効 果 を 認 め な か っ た た め 、 本 方 法 に お け る C. albicans の

殺 菌 効 果 に は・OH が そ の 殺 菌 メ カ ニ ズ ム に 関 与 し て い る と 推 察 で き た 。

し か し な が ら 、H2O2 群 に お い て も ま た C. albicans に 対 し て 若 干 な が ら

殺 菌 効 果 を 認 め た 。こ の 効 果 に つ い て は 、発 生 し て い た 微 量 の・OH が 少

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な か ら ず 影 響 し て い る も の と 考 え ら れ る が 、 そ れ 以 外 に も H2O2 自 身 が

持 つ 性 質 が 大 き く 関 わ っ て い る と 考 え る 。す な わ ち 、H2O2は 不 対 電 子 を

持 た ず 、ROS で は あ る が フ リ ー ラ ジ カ ル で は な い 物 質 で あ る た め 、 不 安

定 で 酸 素 を 放 出 し や す い 性 質 を 有 す る 。 す な わ ち 、 光 分 解 さ れ な い 環 境

下 に お い て も Fe^{2 +}な ど の 金 属 イ オ ン 存 在 下 で ・ Ｏ Ｈ を 産 生 し や す い 性 質

(Fenton 反 応 も し く は Fenton 様 反 応)を 有 し て い る 。ま た 、H2O2自 身 が

細 胞 膜 を 自 由 に 通 過 で き る た め 細 胞 内 の Fe^{2 +}と Fenton 反 応 す る こ と で・

OH に 変 換 可 能 な こ と が し ら れ て い る ^{3 0）}。 C. albicans は 真 核 細 胞 で あ

り 、細 胞 内 の 維 持 恒 常 の た め Fe 代 謝 機 構 を 有 し て お り 、細 胞 膜 を 通 過 し

た H2O2に よ っ て Fenton 反 応 が 惹 起 さ れ ・OH が 細 胞 内 か ら 発 生 し た こ

と も 考 え ら れ る 。C. albicans の 細 胞 内 で 発 生 し た ・OH は DNA 損 傷 ^{3 1 )}

や 蛋 白 質 あ る い は 細 胞 膜 の 脂 質 分 子 を 攻 撃 を 与 え る ^{3 2 )}。さ ら に そ こ か ら

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二 次 的 な よ り 寿 命 の 長 い ラ ジ カ ル を 発 生 さ せ る 可 能 性 も あ り 、 脂 質 過 酸

化 連 鎖 反 応 等 を 起 こ す こ と ^{3 3 )}か ら 、微 量 に 発 生 し た ・OH で あ っ て も C.

albicans の 殺 菌 効 果 を 認 め た こ と が 推 察 で き る 。

同 時 に H2O2 自 身 も ま た 一 般 細 菌 や ウ イ ル ス を 5～20 分 で 、 芽 胞 を 3

時 間 で 殺 菌 で き 、広 範 囲 抗 微 生 物 ス ペ ク ト ル を 示 す こ と が 報 告 ^{3 4 )}あ る た

め 、 こ の よ う な こ と か ら H2O2単 独 作 用 で あ っ て も C. albicans に 対 し て

殺 菌 効 果 が 認 め た も の と 考 え た 。

一 般 に ・OH を は じ め と す る 生 体 内 で 産 生 さ れ た ROS の 場 合 、体 内 に

侵 入 す る 微 生 物 に 対 し て は 殺 菌 作 用 を 示 し 感 染 か ら 宿 主 を 感 染 か ら 守 っ

て い る 。 一 方 で 、ROS は ラ ジ カ ル 連 鎖 反 応 に よ り 生 体 機 能 を 障 害 し う る

有 毒 反 応 産 物 を 増 加 さ せ 、 様 々 な 病 態 を 増 悪 さ せ る 危 険 性 を 有 す る と い

わ れ て い る ^{3 5）}。 今 回 の 結 果 か ら 光 分 解 反 応 を 用 い た C. albicans の 殺 菌

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方 法 は 完 全 な 殺 菌 効 果 は 得 ら れ な か っ た も の の 、 機 械 的 清 掃 と 併 用 す る

こ と に よ っ て 有 意 義 な 方 法 で あ る と 考 え ら れ た 。 さ ら に 、 我 々 は メ チ レ

ン ブ ル ー を 光 増 感 剤 と し て 、 お よ び 励 起 光 に 660 nm レ ー ザ ー 光 を 用 い

て a-PDT か ら 発 生 し た ROS の 一 種 で あ る 一 重 項 酸 素 を 発 生 さ せ C.

albicans に 作 用 し 殺 菌 メ カ ニ ズ ム の 検 討 し た 研 究 ^{1 3 )}で は 、 そ の 有 効 な 殺

菌 効 果 に は 照 射 20 分 以 上 を 要 し た こ と か ら ・ Ｏ Ｈ を 用 い た a-PDT は 短

時 間 で 有 効 な 殺 菌 効 果 を 得 ら れ る も の と 期 待 で き る 。・Ｏ Ｈ を 応 用 す る に

あ た り 留 意 し な く て は い け な い 点 は 、C. albicans に 対 し て 高 い 殺 菌 効 果

を 示 し た 約 179 M の・OH 量 は 非 常 に 強 い 酸 化 力 を 有 し 、生 体 に 対 し て

は 強 い 為 害 性 が あ る こ と で あ る 。 そ の 点 に 関 し て は 、 本 研 究 は 本 法 を 口

腔 外 で 使 用 す る こ と で 応 用 し よ う と 考 え て い る た め 生 体 為 害 性 に つ い て

は 除 外 で き る 。し か し 、多 量 な・OH が レ ジ ン 床 な ど の 口 腔 内 装 置 に 対 し

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て 表 面 を 粗 造 に さ せ る 可 能 性 も 否 定 で き な い 。 粗 造 に な っ て し ま う と デ

ン チ ャ ー プ ラ ー ク の 容 易 に 再 付 着 し や す く な る こ と も 考 え ら れ る た め 、

今 後 ・OH を 暴 露 さ せ た 際 の レ ジ ン 床 表 面 の 形 態 変 化 に つ い て も 検 討 し

て い く 必 要 が あ る と 考 え る 。

結 論

本 研 究 で は H2O2を 光 触 媒 と し て 405 nm LED を 照 射 し 、 光 分 解 反 応

か ら 発 生 し た ・OH を ESR spin trapping 法 を 用 い て 測 定 し 、C. albicans

に 対 す る 殺 菌 効 果 を 評 価 し た 。そ の 結 果 、405 nm LED を H2O2に 対 し て

照 射 す る こ と で 照 射 時 間 依 存 的 に ・OH 発 生 量 が 増 加 し 、C. albicans を

60%、90％ お よ び 95％ 以 上 殺 菌 す る た め に は 少 な く と も ・OH 発 生 量 が

約 59 M、143 M お よ び 179 M が そ れ ぞ れ 必 要 で あ っ た 。以 上 の こ と

か ら 、 可 視 光 線 領 域 の 光 源 を 用 い た 光 分 解 反 応 を 用 い た 洗 浄 方 法 は 、C.

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albicans が 繁 殖 し う る 義 歯 な ど の 口 腔 内 装 置 に 対 し て 、照 射 60 秒 と い う

短 時 間 で 効 率 よ く 殺 菌 可 能 で あ り 、 さ ら に 光 源 出 力 や H2O2 濃 度 の 条 件

設 定 を 変 え る こ と で 口 腔 カ ン ジ ダ 症 や 誤 嚥 性 肺 炎 の 予 防 に 有 効 な 方 法 と

し て 期 待 で き る 。

謝 辞

本 研 究 は JSPS 科 研 費 JP19K19076 の 助 成 を 受 け た も の で あ る 。

利 益 相 反

著 者 全 員 に 一 切 の 利 益 相 反 は な い 。

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参 考 文 献

1. 厚 生 労 働 省 ： 平 成 30 年 人 口 動 態 統 計 年 報 、2018.

（https://www.mhlw.go.jp/toukei/saikin/hw/jinkou/suii09/deth2.html）

2. 木 田 厚 瑞 ： 嚥 下 性 肺 炎 、Geriatr Med、19: 1251-1254、1981.

3. 桂 秀 樹 、山 田 浩 一 、木 田 厚 瑞： 高 齢 者 に お け る 反 復 し た 顕 性 誤 嚥 症 例

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4. 米 山 武 義 ： 誤 嚥 性 肺 炎 予 防 に お け る 口 腔 ケ ア の 効 果 、 日 老 医 誌 、

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図 の 説 明

図 1a ： ・ Ｏ Ｈ 補 促 剤 DMPO と adduct 形 成 反 応

図 1b： 各 濃 度 TEMPOL か ら 得 た ス タ ン ダ ー ド 曲 線

図 2：405 nm+ H2O2群 か ら 生 じ た 照 射 時 間 経 時 的 な DMPO-OHの ESR

ス ペ ク ト ル

(a) 0 秒 (b) 60 秒 照 射 (c) 120 秒 照 射 （d）180 秒 照 射 (e) 240

秒 照 射 (f) 300 秒 照 射

● は Mn マ ー カ ー 、 〇 は DMPO-OH の spin adduct を 示 す

図 3： 照 射 時 間 の 条 件 下 に お け る 4 群 間 の ・OH 発 生 量

図 4： 照 射 時 間 の 条 件 下 に お け る 4 群 間 の C. albicans 生 存 率

34

図

図 1a

図 1b

35

図 2

図 3

36

図 4