佐道三郎

(1)

奈医誌. ( ] .

Nara Med. Ass.) 41

，

65‑75

，平

2

OK‑432

牌臓内投与における抗腫蕩効果の実験的研究

奈良県立医科大学第

1

外科学教室

佐道三郎

ANTI‑TUMOR EFFECT O N INTRASPLENIC IN)ECTION OF A STREPTOCOCCAL PREPARATION

，

OK‑432

SABURO SADO

The 1st Dψartment 01 Surgel

つ

J，Nara Medical University Received

J

anuary 31

，

1990

(65 )

Summary:

I t

is known that a streptococcal preparation

，

OK ‑432

，

is able to induce cytotoxic activity in vivo

，

and that the spleen has large amounts of immune response cells. thus the therapeutic efficacy of splenic administration of OK ‑432 was examined.

Intrasplenic injection of OK ‑432 inhibited tumor growth in tumor bearing mice and prolonged the survival rate in metastasis model compared with no injection or intramusclar injection.

I t

was attributed to the cytotoxic activity acquired by splenocyte directly injected with OK ‑432.

These results indicate the effectiveness of intrasplenic injection of OK ‑432. Intrasplenic injection is considered suitable for clinical app

1 i

cation allowing the operation in vitro

，

too

，

whereas it has so far been necessary to induce tumoricidal cells in vivo.

Index Terms BRM

，

immunotherapy

，

OK ‑432

，

intrasplenic injection

緒 ⁼

E

ヨ

Biological Response Modifier (BRM)

の一つである

OK‑432

は，臨床応用されてからの期間も長く，その効果も様々な方向から検討，報告されている.その中でも，

natulal killer(NK)

活性を中心とした細胞性免疫を介する効果は，癌治療における重要な要素とされ，今後もその癌治療の可能性は広く発展するものと考えられている.一方，

lymphokine activated killer cell (LAK)

療法を中心とした養子免疫療法は実験的，臨床的に強し、抗腫毒事効果が認められている. しかし，移入する細胞数の絶対数が少ないなどの問題が残されており今後の課題であろう。そこで

OK‑432

が生体内において細胞性免疫能を活性化することから，特に免疫応答細胞の豊富な牌臓に着目し，

OK‑432

牌臓内直接投与を中心に，投与経路別抗腫療効果について，実験的検討を行った。

1

材料および方法

1 ) 実験動物

日本チャーノレズ・リバー研究所より購入した雌性

7

週齢の

C3H/HeN

マウス

320

匹(平均体重

20g)

を用いた。

2)

牌細胞

C3H/H巴N

マウスの

1

専をホモジュナイズし

nylon mesh

を通し

singlecell

化した.さらに

Tris‑NH4Cl溶

液にて赤血球を浸透圧的に破壊し，

Hanks' balanced salt solution

(H

BSS)

にて

3

回洗浄することにより得た.

3)

実験腫湯

C3H/HeN

マウス由来，腹腔内で継代した

X‑5563

形質細胞腫と，フラスコ内で継代培養された

YAC‑l

，

lymphoma

を使用した.

4) OK‑432

投与経路の設定

(2)

(66 )

佐道

OK‑432

の投与経路は以下の

4

群に分けて検討した.

I

群:大腿筋肉内(以後筋肉内〉注入群

II

群:腹腔内注入群

III

群:牌臓内注入群

IV

群:無投与，コシトローノレ群

牌臓内注入を行うためにすべての群のマウスに前処置を加えた。つまり，エーテノレ麻酔下に左側腹部より開腹

し，牌臓を腹腔外に取り出した。この牌臓を皮下結合組/

織を剥離して作ったスベースに有茎に授動し開腹する。

約一週間経過し，牌臓が皮下に定着したマウスを使用した.

注入量は

0.05ml

とし，

26G

ツベノレクリン針にて，経皮的に牌内に

bolusinjection

で注入した.

5) in vivo

抗腫蕩効果の検討

a)

腫湯増大抑制能

腫蕩増大抑制能は

X‑5563 2 x 10'

をマウスの背部皮内に接種し，これにより生じる背部腫疹の長径と短径の平均径を求め，この腫蕩平均径の

X‑5563

接種目からの経時的変化により判定した.

b) Winn type

腫場中和能の検討

X‑5563

担癌マウスにおける牌細胞の

OK‑432

投与経路別抗腫蕩効果を

Winntype

中和

assay

にて検討した.

つまりマウスに

X‑5563

，

1 x 10.

を背部皮内に接種し，接種翌日より先に示した

4

群の投与方法にて

OK‑432

，

0.005KE/0ρ5ml

を接種

13

日目まで隔日に注入する。接種

14

日目に稗臓を取り出し，得られた牌細胞

2X10'

を効果細胞とし，

OK‑432

投与方法別に

X‑5563 2 x 10'

とで

O.lml

の

HBSS

に混和し

(E/Tratio 100 :

1)')背部皮肉に接種する.接種後の背部腫癌の経時的変化を測定した

c)

転移抑制能モデノレにおける延命効果

X ‑5563 1 x 10.

をマウスの背部皮内に接種し，

10

日自に背部に生じた腰痛を切除する.マウスはこの時点で，

肺，肝などに微小転移が生じており，約

25

日後に全例死亡する。転移抑制能は，このマウスの腫癌切除後の生存率にて検討した。

6) in vitro

抗腫蕩効果の検討

a)

細胞培養完全培地

(CompleteMedium: CM) CM

は

10%fetal calf serum(FCS)

，

1mM 4‑[2 hydroxy ‑ethy J]一1‑piperazine ‑ethanesulfonic acid

(HEPES)

，

p

巴

nicilinG100U/ml

，

streptomycin 50pg/ml

を

RPMI1640

溶液に溶解することにより作成した.

b)

標的細胞

標的細胞として腫蕩細胞

2.5x 10.

個を

0.5ml

の培養液に浮遊し，これに

100μCi

の

Na251Cr204(New Eng.

良

E

land N u

c 1

ear Corporation

製〉を加え

3

ア

C

，

5%CO

，の培養器に静置し，

15

分ごとに静かな撹枠をくわえ，

60

分間反応させた後

3

回洗浄したものを使用した.

c)

効果細胞

C3H/HeN

マウスの牌より得られた牌細胞を

OK‑432 O.OlKE/ml

，

O.lKE/ml

，

1KE/ml

の濃度で添加した

CM

にて

5%C02

，

3

1 '

C

の条件下で

18

時間培養し効果細胞として使用した.

d)

効果判定

標的細胞

2.5X 10⁴

に対し効果細胞と標的細胞の比

(E/ T ratio)

が

50: 1

，

25 : 1

，

12.5 : 1

となるように効果細胞を

96

穴丸底マイクロプレート(コーニング社製〉に総量が

0.2ml

となるように

3

検体ずつ

(triplicate)

注入し，

3

1 '

C

，

5%C02

の条件下にて

4

時間培養した.さらにマイク

口プレートを

1300rpm/min

にて

20

分間遠沈し上清

0.1 ml

に含まれる5l

Cr

放射活性を

y

シンチレーションカウ

ンターにてカウントした.

%cytotoxicity

は次式により算出された.

%cytotoxicity

=

100 x

実験遊離群

(c.p.m

目〉一自然遊離群

(c.p.m.)

最大遊離群

(c.p.m.)

自然遊離群

(c.p.m.)

なお自然遊離群は腫疹細胞液

0.1mll

こ

O.lml

の

CM

を加えたものとし，最大遊離群は腫療細胞液

0.1ml

に

0.1 ml

の

5%sodiumdodecyl sulfate

を加えたものとした.

実験は

triplicate

とした.

川結

果

1 )

OK‑432 1

回投与量の決定

投与経路別抗腰湯効果を検討するに先立って，

OK‑

432

の

l

回投与量を腫蕩増大抑制能力、ら決定した.まず

OK‑432

の筋肉内投与によって検討した.

OK‑432

の

l

回投与量は

0.05KE

，

0.01 KE

，

0.005 KE

とし

0.05ml

の生食水に溶解したものを

X‑5563

接種後

2

日目，

4

日目，

6

日目に大腿筋肉内に注入した.さらに牌臓内注入群も作成し筋肉内投与群と同様に

OK‑432

の注入を行った.

a)

筋肉内投与群における投与量別抗腫疹効果

Fig.1

に示すように，

OK‑432

筋肉内投与において，

X

‑5563

接種後

22

日目の平均腫悪事径は，

OK ‑432

，

0.05 KE

投与群で

12.4:t9.0m m

，

0.01 KE

投与群で

16.4:t10.4 m m

，

0.005KE

投与群で

17.4士9.6mm

また無投与群で

20.1:t6.2 m m

と有意差は認められなかったが，

0.05 KE

投与群は，無投与群，

0.01 KE

，

0.005 KE

投与群に比べ，

強

L

、抗腫湯効果が認められた。また，

0.005KE

投与群は，

無投与群と比較し，ほほとんど抗腫療効呆が認められな

かった.

(3)

OK‑432

牌臓内投与における抗腫疹効果の実験的研究

mml ー

企ー ‑:

̲:0.005KE/mouse ⁰^.⁰¹^KE/mouse

c，‑̲

ム :

0.05 KE/mouse

0

一一『吋コ :

control 20寸 mean土SE

10

。

4 6 8 11 13 15 17

(67 )

20 22 day Fig1. Inhibitory effect on X‑5563 tumor bearing mice following therapy of OK‑432 intramusclar

injection.

b)

牌臓内投与群における投与量別抗腫疹効果ベ，有意に腫疹増大抑制能が認められゆく

0.05)

，

II

群は

OK‑432

牌臓内投与では，

Fig.2

に示すように

X‑5563 1

1 . 7 : t

5.9mm

と，

lV

群に比べ，有意に抑制能が認められ接種後

22

日目の腫疹径は

OK‑432

，

0.05 KE

投与群でた

(p

く

0.05). 1

群にはほとんど腫湯増大抑制能が認めら

14.6

: t

10.3 m m

，

0.01 KE

投与群で

20.3

: t

4.2m m

，

0.005

れなかった.

KE

投与群で

l1.5

: t

3.2m m

，無投与群

20

. 1 : t

6.2m m

と以上より，腹腔内投与，牌臓内投与に強し、抗腫療効果

OK ‑432

，

0.005KE

投与群は，無投与群と比較して，有意が認められ，なかでも牌臓内投与は，より強い効果が得に腫軍事増大抑制能が認められた

(p<0.05).

なお，

0.05KE

られる可能性が示唆された.

投与群は，無投与群に比較して増大抑制能が認められた

b) Winn type

腫蕩中和能の検討

が，有意差はなかった

X‑5563

担癌マウスにおける牌細胞の

OK‑432

投与経この二つの実験結果から，

OK‑432

の

1

回投与量を，路別抗腫湯効果を

Winntype

中和

assay

にて検討した.

0.005 KE/0.05 ml

~こ設定し，投与経路別抗腫蕩効果を比その結果，接種後の背部腫療の増大は

Fig

.4に示すよう較検討した. に接種後

28

日目で

III

群が

4^目3

: t

6

. 1

m m

，

1

群が

12.7

士

2) OK‑432

投与経路別抗腫蕩効果の検討

7.9mm

，

II

群が

9.7

士

9.7mm

，

lV

群 ' / 1 '

10.5

: t

10.8 m m

で

a)

腫蕩増大抑制能による検討有意差は認めなかったが

III

群が他の群に比較して高い抗 1)の実験結果から，

OK ‑432

の

l

回投与量を

0.005

腫療活性を獲得していると想像された.また

X‑5563

の

KE/0.05 ml

(o

K ‑432

溶液の濃度は

0.1KE/ml

となる〉背部皮内への生着率では，注入した

X‑5563

の細胞数がとし，投与経路を先に示した

I

群(筋肉内投与)，

II

群(腹

2X 10'

とほぼ全例生着する数であるにもかかわらず，

III

腔内投与)，

III

群

α

早臓内投与)，

lV

群〔無投与〉の

4

群群

33.3%

，

II

群

57

. 1 % ，

1

群

77.7%

，

IV

群

57

.1%，であ

ⁱ

(n=6)

に対し，

OK ‑432

，

0.005 KE/0.05 ml

を

X‑5563

接った.

種後

2

日目，

4

日目，

6

日目にそれぞれの経路から注入し

c)

転移抑制能による検討

腫疹増大抑制能にて検討した。結果は，

Fig.3

に示すよう前処置として牌臓授動を行ったマウスから先に述べた

に，

X ‑5563

接種後，

21

日目の腫蕩径は，

III

群で

9

. 1: t 転移モデ、ノレを作成する. この転移モデノレに対し，腫癌切

7.7mm

と

lV

群

20.0

: t

3.7m m

，

1

群

18.1

土

6.2mm

に比除後

2

日目，

4

日目，

6

日自に

OK‑432

，

0.005KE/0.05 ml

(4)

(68 )

m打

1

20

10

。

a

一一 ‑ . 0 .:

0.005KE/mouse

̲ ̲ : 0.01 KE/mouse

A

一一 ‑ ":

0.05 KE/mouse

0 ‑ 一一

0:control mean+SE

4 6 8

佐道良

R

11 13 15 17 20 22 day Fig. 2. Inhibitory effect on X‑5563 tumor bearing mice following therapy of OK‑432 intrasplenic

injection.

m m， {:，‑‑{:， : 1 (i.m.) 20 i‑

1 0 . . ー ‑ ‑ . . 0 . :

II (i.p.)

令一一・:

III (i

ふ)

10

。

守一一ο:

N (control) OK‑432 : 0.005KEjmouse

mean

土

SE

申

P<O.05 (v^ふ 0

，ム )

※

P<O.05 (v

^ふ

0)

7 9 11 13 16 18 21 day Fig.3. Inhibitory effect on X‑5563 tumor bearing mice following therapy with various routes of

OK ‑432 administration^目 i

.m.: intramusclar injection i.p.: intraperitoneal injection i^ふ intrasplenicinjection control: no injection

(5)

OK‑432

牌臓内投与における抗腫蕩効果の実験的研究

m m

14

12

‑l一一..".・

¹

( i . m . )

』ー→:

I I ( i .

p.)

←‑‑・

I I I ( i

^田5.)

10 ‑1

由一一

o: W (control)

mean 士

SE 8

4

。

(69 )

10 12 14 15 17

1 9

21 22 24 26 28 day Fig. 4. Augment巴dcytotoxic activity of splenocytes in tumor bearing mice after OK ‑432 administra^句

tion.

( 羽 T i

nntype neutralization assay)

(%) 100

90 80 70

+

。^伺^LJ•

60

偲

〉

〉 L幽

50

u) コ

40 30 20 10

。

20 40

ムー‑‑‑L>:

1

( i .

m.)

企一一 . . .:

^I^I (i

ゃ)

・一一・ :

III (i

ふ)

。 ‑ ‑ < : J :

N (co

川

rol)

*P<O.05 (v

^ふ

0)

60 day

Fig. 5. Survival rate of mice bearing X‑5563 metastasis following therapy with various routes of OK ‑432 administration.

(6)

(70 )

佐道日良

を先に示した

4

群の経路から投与し，腫癌切除後の生存うに

E/Tratio 50: ，1 OK ‑432

濃度が

O.OlKE/ml

で % 日数を求めた.

Fig.5

は腫癌切除後の投与経路別生存率

cytotoxicity38

. 4 : t

2.0%

，

O.lKE/ml

で

26.8

: t

3.2%

，を

KaplanMeier

法にてに示したものである.

IV

群は

lKE/ml

で

20

. 1 士

3.4%

であり

OK‑432

無添加の

6.8

: t

30

日以内に全例死亡したが，II1群は，

30

日目の生存率が 1.1%に比較して，

cytotoxicity

の上昇がみられた。この

60.0%

と有意に生存率の上昇が認められた

(p

く

0.05).

まことからどちらの腫蕩に対しても抗腫蕩活性は獲得してた群は

28.5%

，

11

群においても

33.3%

と生存率の上いるが，

X‑5563

を標的細胞にした場合で、は

O.OlKE/ml

，昇が認められた

YMC‑l

を標的細胞にした場合では

O.OlKE/ml

と最も

3) in vitro

での抗腫蕩活性強い活性を得るための

OK‑432

至適濃度に違いがみら

a)

抗

X‑5563

活性れた.

X ‑5563

を標的細胞として行った

invitro cytotoxic assay

で、は

Fig.6

に示すように

OK‑432

，

O.OlKE/ml

の濃度で培養した牌細胞は

E/Tratio 50:1

において

4.6

士

0.6%

と

OK‑432

無添加の1.

9

: t

0.3%

に比べてわずかの %

cytotoxicity

の上昇がみられるのみであった.しか

し

，

O.lKE/ml

の濃度では，

E/T ratio 50: 1

で

13.8

: t

2.0%

と上昇しており，また

OK‑432

の濃度を

lKE/ml

にしたときも

E/Tratio 50: 1

，

6.6

: t

0^目9%

，

25:1

で

9.8

: t

0.6%

と %

cytotoxicity

の上昇がみられた.つまり，マウス牌細胞は

OK‑432

と共に培養することにより，

X‑5563

に対する

cytotoxicactivity

を獲得し，

OK‑432

の濃度依存性に活性が上昇するのではなく，

OK‑432

濃度が

O.lKE/ml

付近のときに最も強い活性を得られると考え

られた

b) NK

活性

YAC‑l

を標的細胞にした

assay

では，

Fig.7

に示すよ

ぢ

〉、 14

.

H

s 12

0

¥510

。

。 "

8

6

4 2 0

nHvnmuβnu n4

・ _l

' l

E/T 50: 1 25

・

1 12.5

・

l

Control 0.01 KE/ml

IV

考察

悪性腫湯の治療には外科的療法，化学療法，放射線療法，免疫療法，ホノレモン療法などあるが，外科的療法はもっとも確実で効果的な方法である.しかし，切除不能進行例や再発例など手術療法が不可能な症例もあり，これらの治療には外科的療法以外の治療法にたよるしかない.なかでも免疫療法はこのような症例に対する補助療法として期待され，

LAK

細胞や特異的

Kill

巴

rT

細胞の応用は，養子免疫療法

(adoptive immunotherapy: AIT)

として研究され注目を集めている1).

Rosenberg

らは

LAK

細胞投与と同時に

IL‑2

を補充投与することで効果を高める工夫を行ってきた

2)

また，腫蕩局所に浸潤してきたリンパ球である

TIL (tumor infi1trating lymphocyte)

は

LAK

細胞より強い効果が誘導される前駆細胞として注目されてきた

³⁾⁴⁾

しかし養子免疫療法で

Target : X‑5563

0.1 KE/ml 1 KE/ml Fig. 6. Killer activity of murine splenocyte incubated with OK ‑432 for 18 hours.

(51Cr release assay， Target: X‑5563)

佐 道 三 郎

奈医誌. ( ] .

，

，平

牌臓内投与における抗腫蕩効果の実験的研究

奈良県立医科大学第

外科学教室

佐 道 三 郎

，

つ

J

，

I t

，

，

，

I t

1 i

，

，

，

，

，

緒 =

ヨ

の一つである

は，臨床応用されてからの期間も長く，その効果 も様々な方向から検討，報告されている.その中でも，

活性を中心とした細胞性免疫を介す る効果は，癌治療における重要な要素とされ，今後もそ の癌治療の可能性は広く発展するものと考えられてい る.一方，

療 法を中心とした養子免疫療法は実験的，臨床的に強し、抗 腫毒事効果が認められている. しかし，移入する細胞数の 絶対数が少ないなどの問題が残されており今後の課題で あろう。そこで

が生体内において細胞性免疫能 を活性化することから，特に免疫応答細胞の豊富な牌臓 に着目し，

牌臓内直接投与を中心に，投与経路別 抗腫療効果について，実験的検討を行った。

材料および方法

1 ) 実験動物

日本チャーノレズ・リバー研究所より購入した雌性

週 齢の

マウス

匹(平均体重

を用いた。

牌細胞

マウスの

専 を ホ モ ジ ュ ナ イ ズ し

を通し

化した.さらに

液にて赤血球を浸透圧的に破壊し，

(H

にて

回洗浄することにより得 た.

実験腫湯

マウス由来，腹腔内で継代した

形 質細胞腫と，フラスコ内で継代培養された

，

を使用した.

投与経路の設定

佐 道

の投与経路は以下の

群に分けて検討した.

群:大腿筋肉内(以後筋肉内〉注入群

群:腹腔内注入群

群:牌臓内注入群

群:無投与， コシトローノレ群

牌臓内注入を行うためにすべての群のマウスに前処置 を加えた。つまり，エーテノレ麻酔下に左側腹部より開腹

し，牌臓を腹腔外に取り出した。この牌臓を皮下結合組/

織を剥離して作ったスベースに有茎に授動し開腹する。

約一週間経過し，牌臓が皮下に定着したマウスを使用し た.

注入量は

とし，

ツベノレクリン針にて，経皮 的に牌内に

で注入した.

抗腫蕩効果の検討

腫湯増大抑制能

腫蕩増大抑制能は

をマウスの背部皮 内に接種し，これにより生じる背部腫疹の長径と短径の 平均径を求め， この腫蕩平均径の

接種目からの 経時的変化により判定した.

腫場中和能の検討

担癌マウスにおける牌細胞の

投与経 路別抗腫蕩効果を

中和

にて検討した.

つまりマウスに

，

佐道三郎

佐道三郎

緒 ⁼

は，臨床応用されてからの期間も長く，その効果も様々な方向から検討，報告されている.その中でも，

活性を中心とした細胞性免疫を介する効果は，癌治療における重要な要素とされ，今後もその癌治療の可能性は広く発展するものと考えられている.一方，

療法を中心とした養子免疫療法は実験的，臨床的に強し、抗腫毒事効果が認められている. しかし，移入する細胞数の絶対数が少ないなどの問題が残されており今後の課題であろう。そこで

が生体内において細胞性免疫能を活性化することから，特に免疫応答細胞の豊富な牌臓に着目し，

牌臓内直接投与を中心に，投与経路別抗腫療効果について，実験的検討を行った。

週齢の

専をホモジュナイズし

回洗浄することにより得た.

形質細胞腫と，フラスコ内で継代培養された

佐道

群:無投与，コシトローノレ群

牌臓内注入を行うためにすべての群のマウスに前処置を加えた。つまり，エーテノレ麻酔下に左側腹部より開腹

約一週間経過し，牌臓が皮下に定着したマウスを使用した.

ツベノレクリン針にて，経皮的に牌内に

をマウスの背部皮内に接種し，これにより生じる背部腫疹の長径と短径の平均径を求め，この腫蕩平均径の

接種目からの経時的変化により判定した.

投与経路別抗腫蕩効果を

を背部皮内に接種し，接種翌日より先に示した

日目まで隔日に注入する。接種

を効果細胞とし，

とで

1)')背部皮肉に接種する.接種後の背部腫癌の経時的変化を測定した

日自に背部に生じた腰痛を切除する.マウスはこの時点で，

日後に全例死亡する。転移抑制能は，このマウスの腫癌切除後の生存率にて検討した。

の培養液に浮遊し，これに

，の培養器に静置し，

分間反応させた後

時間培養し効果細胞として使用した.

注入し，