序 文
近年，各種腸管系病原菌においても，キノロン
剤の一種であるナリジクス酸（NA）に高度耐性 で，新キノロン剤と呼ばれるフルオロキノロン系 薬剤（以下 FQ と略）にも耐性，あるいは低感受性 を示す菌株の出現，増加が世界的規模で問題と なって来ている
1）〜6）．著者らは， 東京で分離された
海外旅行者下痢症例由来毒素原性大腸菌における フルオロキノロン系薬剤低感受性菌の出現状況
東京都立衛生研究所微生物部
松下 秀 河村 真保 高橋 正樹 横山 敬子 小西 典子 畠山 薫 甲斐 明美 諸角 聖
杏林大学保健学部
森田 耕司 渡辺 登 金森 政人 工藤 泰雄
（平成 13 年 5 月 7 日受付）
（平成 13 年 6 月 8 日受理）
1988〜1999 年に，海外旅行者下痢症患者から分離した毒素原性大腸菌（ETEC）における，フルオロ キノロン系薬剤（FQ）耐性菌，あるいは低感受性菌の出現状況を調べた．検出該菌については，その諸 性状，及び DNA ジャイレースサブユニット A 遺伝子上のキノロン耐性決定領域（QRDR）における，
変異の有無について検討した．
1,318 株の ETEC について検討した結果，NA 耐性の 21 株（1.6％）は，NFLX，OFLX，CPFX 等今回 検討した 6 種いずれの FQ に対しても，低感受性と判定された．FQ 高度耐性菌は認められなかった．年 次別に検出状況をみると，1996 年に初めて検出され，1998 年は 10 株（6.9％），1999 年は 6 株（15.8％）
と，最近急増してきていることが判明した．なお，21 株中 19 株は，インド亜大陸への旅行者から検出さ れたものであった．
これら 21 株の，他薬剤と合わせた耐性パターンは 6 種認められ，そのうち 12 株（57.1％）は多剤耐性 菌であった．毒素産生型は，易熱性エンテロトキシン（LT）単独が 4 株，耐熱性エンテロトキシン（ST）
単独が 10 株，LT 及び ST 両産生が 7 株であった．また，これらは 16 種の血清型に分類された．
QRDR の塩基配列解析の結果，83 位のコドンが TCG から TTG に変異し，それに伴いアミノ酸がセリ ンからロイシンに置換していたのが 19 株，87 位のコドンが GAC から TAC に変異，アミノ酸がアスパ ラギン酸からチロシンに置換していたのが 2 株であった．なお，全株とも単一部位だけの変異であった．
〔感染症誌 75：785〜791，2001〕
要 旨
別刷請求先：（〒169―0073）東京都新宿区百人町 3―24―1 東京都立衛生研究所微生物部
松下 秀
Key words： enterotoxigenicEscherichia coli, drug resistance, fluoroquinolone, DNA gyrase, traveler s diarrhea
Table 1 Drug resistance of enterotoxigenic E. coil isolated from overseas traveler's diarrheal cases in Tokyo, 1988―1999
No. of strains resistant to each drug（%）
No. of resistants
（%）
No. of
strains CP TC SM KM ABPC
303
（23.0）
13
（1.0）
339
（25.7）
434
（32.9）
135
（10.2）
608
（46.1）
1,318
NFLX FOM
NA ST
0 15
（1.1）
21
（1.6）
235
（17.8）
サルモネラにおける状況について検討し，1995 年以降の海外旅行者下痢症例由来菌株において，
このような FQ 低感受性菌の検出率が急増してい ることを明らかにし，本誌に報告した
7）．
今回は，我が国からの海外旅行者下痢症患者に おいて最も高頻度に分離される
8），毒素原性大腸 菌（Enterotoxigenic
Escherichia coli；ETEC）における薬剤耐性菌，特に FQ 耐性あるいは低感受性 菌の出現状況について検討した．検出された該菌 については，他の薬剤と合わせた耐性パターン，
毒素産生型及び血清型を調べた．また DNA ジャ イレースサブユニット A 遺伝子（gyrA）上のキノ ロ ン 耐 性 決 定 領 域（Quinolone resistance deter- mining regions；QRDR）における変異についても 検討を加えたので報告する．
材料と方法
1．供試菌株
1988〜1999 年の 12 年間に，東京において海外 旅行者下痢症患者（散発事例）より分離された 1,318 株の ETEC について検討した．
2．薬剤耐性試験
米国臨床検査標準委員会（NCCLS）の抗菌薬 ディスク感受性試験実施基準
9）に基づき， 市販の感 受性試験用ディスク（センシディスク；BBL）を 用いて実施した． 供試薬剤は， クロラムフェニコー ル（CP），テトラサイクリン（TC），ストレプトマ イシン（SM），カナマイシン（KM），アンピシリ ン（ABPC），スルファメトキサゾール・トリメト プリム合剤 （ST） ， NA， ホスホマイシン （FOM） ， 及びノルフロキサシン（NFLX）の 9 種薬剤であ る．また，NA 耐性 21 株と対照に用いた NA 感受
性 20 株 に つ い て は NA，NFLX 及 び 同 様 の FQ であるオフロキサシン（OFLX），シプロフロキサ シン（CPFX），レボフロキサシン（LVFX），トス フロキサシン（TFLX）及びスパルフロキサシン
（SPFX）に対する最小発育阻止濃度（Minimum in- hibitory concentration；MIC）を，NCCLS の標準 法
10）に準拠した微量液体希釈法で測定した．
3．血清型別試験
FQ 低感受性株については，市販（デンカ生研）
の大腸菌診断用 O 及び H 抗血清を用いて血清型 別を行った．
4．gyrA キノロン耐性決定領域の解析
FQ 低感受性株について，
gyrAの QRDR におけ る塩基配列を解析し，変異の有無を調べた．まず，
Ozeki ら
11）の報 告 し た 方 法 に 準 じ た Polymerase chain reaction（PCR）法により
gyrAの検出を行っ た．プライマーは，E. coli K-12 株の
gyrA塩基配 列
12）を基に設計された gyrA-s， a（gyrA-s：5 -CG CGTACTTTACGCCATGAACGTA-3 ，gyrA-a : 5 -ATATAACGCAGCGAGAATGGCTGCGCC TAGCGGAC-3 ） を用いた．これにより 164bp の DNA が増幅される．なお，変異のスクリーニング は，制限酵素
HinfI を用いた PCR-RFLP 分析11）で，
塩基配列決定は，PCR 増幅 DNA を直接使用した ダイターミネーター法
13）によった．
成 績
1．薬剤耐性菌出現状況
検討した 1,318 株の ETEC において，供試した
9 種薬剤に多剤あるいは単剤耐性を示したのは
608 株で，耐性率は 46.1％ であった．薬剤別耐性菌
出現状況は Table 1 にまとめた．最も耐性頻度が
Table 2 Minimum inhibitory concentrations of nalidixic-acid resistant and sensitive enterotoxigenic E. coli to fluoroquinolones
No. of strains with MIC（µg/ml）
Drug
4.0 2.0
1.0 0.5
0.25 0.125
0.063 0.032
0.016 0.008
NA resistant 21 strains
1 9
11 NFLX
7 11
3 OFLX
2 16
2 1
CPFX
1 18
2 LVFX
8 11
2 TFLX
15 6
SPFX
NA sensitive 20 strains
4 12 4
NFLX
9 10 1
OFLX
1 12
7 CPFX
14 6
LVFX
10 10
TFLX
5 9
6 SPFX
Table 3 Annual incidence of fluoroquinolone low- sensitive enterotoxigenic E. coli isolated from overseas traveler's diarrheal cases in Tokyo
FQ low-sensitive strains（%）
No. of strains Year of
isolation
0 198
1988
0 155
1989
0 134
1990
0 105
1991
0 79
1992
0 84
1993
0 87
1994
0 106
1995
3（ 3.4）
89 1996
2（ 2.0）
99 1997
10（ 6.9）
144 1998
6（15.8）
38 1999
21（ 1.6）
1,318 Total
Table 4 Drug resistance-patterns of fluoroquino- lone low-sensitive enterotoxigenic E. coli isolated from overseas traveler's diarrheal cases in Tokyo
No. of strains（%）
Resistance-pattern ＊
2（ 9.5）
CP TC SM ABPC ST NA
1（ 4.8）
TC SM ABPC ST NA FOM
5（23.8）
TC SM ABPC ST NA
3（14.3）
SM ABPC ST NA
1（ 4.8）
SM NA
9（42.9）
NA
21（ 100）
Total
＊ Drugs tested: CP, TC, SM, KM, ABPC, ST, NA, FOM,
and NFLX
高かったのは TC（32.9％）で，次いで SM（25.7
％），ABPC（23.0％），ST（17.8％），CP（10.2
％），NA（1.6％），FOM（1.1％），KM（1.0％）で，
NFLX 耐性株は認められなかった．
2．ナリジクス酸耐性株のフルオロキノロン系 薬剤に対する MIC 分布
FQ 耐性あるいは低感受性菌は，旧キノロン剤 とも呼ばれる NA には高度耐性を示すことより，
NA 耐性菌について各種 FQ に対する MIC を測 定した．検出された NA 耐性菌 21 株の NA に対 する MIC は全株とも＞100
µg ml であった．これ らの FQ に対する MIC の分布を，対照に用いた NA 感受性菌 20 株（NA に対する MIC 1.56〜3.12
µg ml） と合わせて Table 2 に示した．NFLX では NA 感 受 性 菌 の MIC 分 布 が 0.032〜0.125
µg ml なのに対して NA 耐性菌では 1.0〜4.0
µg ml と，
全体的にみて 8〜128 倍高い範囲に分布していた．
同 様 に OFLX で は 0.032〜0.125
µg ml が 0.25〜
1.0µg ml，CPFX では 0.008〜0.032
µg ml が 0.125Table 5 Toxin producing type and serotype of fluoroquinolone low-sensitive enterotoxigenic E. coli isolated from overseas traveler's diarrheal cases in Tokyo
Serotype ＊ ＊ No. of strains
Toxin type ＊
O 25: H − （1）, O 167: H5（1）, O UT: H33（1）, O UT: H − （1）
4 LT
O 27: H20（1）, O 27: H − （1）, O 78: H12（1）, O 128: H1/12（1）, O 148: H28（1）, O 148: H − （1）, O153: H31（1）, O 169: H41（2）, O UT: H10（1）
10 ST
O 6: H16（3）, O 6: H − （1）, O 8: H9（2）, O 78: H12（1）
7 LT ＋ ST
＊ LT ＝ Heat labile enterotoxin, ST ＝ Heat stable enterotoxin
＊ ＊ H − ＝ None motility, O UT ＝ O untypable
Table 6 Country visited by travelers with fluoroquinolone low-sensitive enterotoxigenic E. coli
No. of cases Country visited
16 India
3 Nepal
1 Cambodia
1 Egypt
Table 7 Mutation in the quinolone resist- ance determining region of the gyrA gene of fluoroquinolone low-sensitive entero- toxigenic E. coli isolated from overseas traveler's diarrheal cases in Tokyo
No. of strains Mutation
19 Ser-83（TCG）→ Leu（TTG）
2 Asp-87（GAC）→ Tyr（TAC）
〜1.0
µg ml，LVFX では 0.016〜0.032
µg ml が 0.125〜0.5
µg ml，TFLX では 0.016〜0.032
µg ml が 0.25〜1.0µg ml，SPFX では 0.008〜0.032
µg mlが 0.125〜0.25
µg ml であった．いずれの FQ に対 しても，NA 耐性菌は NA 感受性菌に比較してか なり高い範囲の MIC 分布を示しており， 低感受性 であることが判明した．なお FQ 高度耐性菌は認 められなかった．
次に，この FQ 低感受性菌の年次別検出状況を Table 3 に示す．検討を始めた 1988 年から 1995 年までは全く検出されなかったが，1996 年 3 株
（3.4％），1997 年 2 株（2.0％），1998 年 10 株（6.9
％），1999 年 6 株（15.8％）と，近年急増してきて いる．
3．フルオロキノロン低感受性菌の耐性パター ン
FQ 低感受性菌 21 株における，他薬剤と合わせ た耐性パターンを Table 4 に示した．全体で 6 パ ターン認められているが，NA 単剤耐性菌が 9 株
（42.9％）と最も多かった．多剤耐性菌のパターン は，TC・SM・ABPC・ST・NA が 5 株，SM・
ABPC・ST・NA が 3 株，CP・TC・SM・ABPC
・ST・NA が 2 株，TC・SM・ABPC・ST・NA
・FOM，SM・NA がそれぞれ 1 株であった．
4．フルオロキノロン低感受性菌の毒素産生型 と血清型
FQ 低感受性菌における，毒素産生型及び血清 型を Table 5 に示した．毒素産生型は，易熱性エン テロトキシン（LT）単独産生が 4 株，耐熱性エン テロトキシン （ST） 単独産生が 10 株，LT 及び ST
両毒素産生が 7 株であった．血清型は，O 血清群 だけを見ても 11 種（O 群不明を除く） ，H 血清群 を加えると 16 種の血清型に型別された．
これらの FQ 低感受性菌が分離された旅行者の 旅行先を Table 6 に示した．その訪問国は 16 件が インド，3 件がネパール，及びカンボジア，エジプ トがそれぞれ 1 件であった．
5．フルオロキノロン低感受性菌の
gyrAキノ ロン耐性決定領域における変異
検 出 さ れ た FQ 低 感 受 性 菌 21 株 に つ い て，
gyrA
の QRDR における塩基配列を解析し，変異
の有無を調べた成績を Table 7 に示した．21 株中
83 位のコドンが TCG から TTG に変異し，それ に伴いアミノ酸がセリンからロイシンに置換して いたのが 19 株，87 位のコドンが GAC から TAC に変異し，アミノ酸がアスパラギン酸からチロシ ンに置換されていたのが 2 株であった．全株とも 単一部位だけの変異で，両部位とも変異している 株は無かった．なお，両置換群の耐性傾向に，有 意な差は認められなかった．
考 察
ETEC は，熱帯・亜熱帯地域の開発途上国にお いては，下痢起因菌として最も検出頻度が高く，
我が国等の開発国から，それらの地域を訪問した 旅行者が下痢症に罹患する，いわゆる旅行者下痢 症の重要な原因菌となっている
8）．また国内にお いても，本菌による集団・散発食中毒事例が，毎 年かなりの数報告されている
14）．ETEC による下 痢症でも，症状の激しい場合は，通常抗菌剤によ る化学療法がなされる．現在本菌を含めた細菌性 下痢症の治療には FQ が汎用されているが，近年 FQ に耐性あるいは低感受性を示す，各種腸管系 病原菌の出現が問題となっている
1）〜6）．
本報では，東京において，1988〜1999 年の 12 年 間 に，海 外 旅 行 者 下 痢 症 例 よ り 分 離 さ れ た ETEC における，FQ 低感受性菌の出現状況，更 に，検出された FQ 低感受性菌については，他薬剤 と合わせた耐性パターン，それらの毒素産生型と 血清型，及び QRDR における変異について検討し た成績について述べた．
NA 耐性菌 21 株の 6 種 FQ に対する MIC の分 布を見ると，対照として用いた NA 感受性菌に比 較して，いずれの薬剤に対してもかなり高い範囲 に分布しており， 低感受性であることが判明した．
英 国 の Central Public Health Laboratory の Thr- elfall
et al.
15）は，CPFX における MIC が 2.0
µg ml 以上 を 高 度 耐 性，0.125〜1.0
µg ml を Low-level- resistance（低度耐性）としているが，その基準で みると， この 21 株はいずれも低度耐性菌というこ とになる．
欧米諸国においても，各種腸管系病原菌におけ る FQ 耐性菌，あるいはここに述べたような低感 受性菌（低度耐性菌）の出現頻度の増加が報告さ
れており
2）15）16），その原因として畜産，養鶏等の現 場における本剤の使用があげられている
17）．ヒト から分離される ETEC は，本来ウシやブタ等の家 畜が保有しており，当然ながら動物における各種 薬剤使用の影響を受けている．これらの環境で生 じた薬剤耐性菌は，飲食物等を介してヒトに伝播 していくものと考えられている．なお，今回の FQ 低感受性菌は，21 株中 19 株がインド亜大陸への 旅行者から検出されたものであった．また，スペ インからインドへの旅行者下痢症患者における調 査でも，他の地域への旅行者に比較して，高頻度 にキノロン耐性 ETEC が検出されると報告され ている
18）．近年インドでは，赤痢様疾患やチフス 症の治療にキノロン剤が積極的に用いられるよう になっている
18）19）とのことで， その影響も受けてい るものと推察される．
次に，これら FQ 低感受性菌の年次別検出状況 についてみると，1988 年から検討してきている が，1996 年に初めて検出され，1998 年は全分離株 の 6.9％，1999 年は 15.8％ と，最近その検出頻度が 急増してきている．著者らがサルモネラについて 同様な調査をした成績
7）でも，ほぼ同時期より FQ 低感受性菌の検出が急増しており，ETEC におい ても同じ状況にあることが判明した．
旧キノロン剤とも呼ばれる NA 耐性株は，今回 検討した 6 種類の FQ いずれに対しても低感受性 であり，交差耐性を示した．また，NA 単剤耐性の 9 株を除く 12 株においては，5 種類の多剤耐性パ ターンが認められている．ある種のキノロン耐性 は，すべてのキノロン剤に対する耐性をもたらす が，分子構造の異なる他の抗菌薬に対する感受性 には，影響を与えないとされている
20）ことを裏づ けるものである．毒素産生型では，ST 単独産生が 10 株，LT 単独産生が 4 株，両毒素産生が 7 株で あった．また，これらは 16 種の血清型に型別され た．即ち FQ 低感受性 ETEC は，特定の毒素産生 型や，血清型に集約するものではなかった．
大腸菌，赤痢菌，サルモネラ等のキノロン耐性
機序における主要機作は，DNA ジャイレースサ
ブユニット A 遺伝子
gyrAの QRDR と呼ばれる
部所における 83 位，あるいは 87 位のコドンの変
異と考えられている
3）11）12）21）22）．今回の FQ 低感受 性 ETEC 21 株の成績では，83 位に変異が認めら れたものが 19 株，87 位に変異が認められたもの が 2 株で，これらはいずれも単一部位における変 異であった．片方の部位だけの変異では低感受性 化，両部位ともに変異が起これば高度耐性化する ことが知られている．今回 FQ 高度耐性菌は認め られなかったが，FQ 低感受性菌の増加は，高度耐 性菌の出現頻度が高くなる素地が膨らんだことを 示すものと考えられ，今後の動向には引き続き監 視していく必要がある．
文 献
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Shigeru MATSUSHITA , Maho KAWAMURA , Masaki TAKAHASHI , Keiko YOKOYAMA , Noriko KONISHI, Kaoru HATAKEYAMA, Akemi KAI & Satoshi MOROZUMI
Department of Microbiology, Tokyo Metropolitan Research Laboratory of Public Health
