Arbitrarily-primed
polymerase
chain
reaction
(AP-PCR)法
に よ るMethicillin-resistant
Staphylococcus
aureus
(MRSA)の
タ イ ピ ン グ
香 川 医 科大 学 第 一 内科1),同 総 合診 療 部2),同 検 査 部3) 北 条 聡 子1)藤 田 次 郎1)根 ケ 山 清3)大 西 隆 行1) 徐 光1)山 地 康 文1)岡 田 宏 基2)高 原 二 郎1) (平成6年12月9日 受付) (平成7年1月10日 受理)Key words:
arbitrarily-primed
polymerase
chain reaction
(AP-PCR),
methicillin-resistant
StaNtylococcus aureus (MRSA)
要 旨
MRSAに よ る 院 内 感 染 症 は現 在 社 会 問 題 に も な っ て お り,そ の 対 策 は 重 要 な課 題 で あ る.院 内 感 染 症 の 証 明 に はMRSAの 正 確 なtypingが 必 要 不 可 欠 で あ る.し か し な が ら,近 年 コ ア グ ラ ー ゼII型 の 占 め る 割 合 が 増 加 し,コ ア グ ラ ー ゼ 型 別 に よ るtypingは 困 難 とな っ て きて い る.今 回 我 々 は 当 科 入 院 中 の 患 者 よ り 分 離 さ れ たMRSA株 に 対 し,新 た なtyping法 と し てarbitrarily-primed polymerase chain reaction (AP-PCR)法 を 試 み,こ のPCRに 最 適 な条 件 を,i)DNAの 抽 出 法,ii)Bufferの 種 類, iii)PCRの 温 度 と 回 数,お よ び,iv)用 い たprimerの 種 類 ご と に検 討 した .ま た,AP-PCR法 に よ る MRSAのtypingの 結 果 は,現 在MRSAのtyping法 と して 確 立 して い るpulsed-field gel electrophor-esis法 の 結 果 と比 較 した.最 終 的 に,Insta Gene kitを 用 い てDNAを 抽 出 し,Mg濃 度3.5mM, pH8.5 のbufferを 用 い,2段 階PCR法 を選 択 し,primerはM13 reverseの み を用 い る 方 法 が 最 適 で あ る と結 論 した.ま た,AP-PCR法 に よ るtypingとpulsed-field gel electrophoresis法 に よ るtypingと は 近 似 の 結 果 が 得 られ た.AP-PCR法 を 用 い たtypingは, MRSA院 内 感 染 の 実 態 を よ り簡 便 か っ 正 確 に 解 析 し う る点 で 臨 床 的 に有 用 と考 え ら れ た.
序 文
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)1)2)に よ る 院 内 感 染 を 防 止 す る た め に は 感 染 源,感 染 経 路 を 正 確 に 把 握 す る 必 要 が あ る. そ の た め に はMRSAを 正 確typingす る こ と が 重 要 で あ る.MRSAのtyping法 と し て 従 来 コ ア グ ラ ー ゼ 型 別 に よ る 分 類 が 一 般 的 に 行 わ れ て き た.し か し な が ら 近 年 コ ア グ ラ ー ゼII型 の 占 め る 割 合 が 増 加 し3),コ ア グ ラ ー ゼ 型 別 に よ る typing は 困 難 と な っ て き て い る.一 方,近 年 の 分 子 生 物 学 の 進 歩 と と も に,pulsed-field gel electrophor-esis法 に よ り 染 色 体DNAをtypingす る 方 法 が 既 に 確 立 さ れ て い る4).こ の 方 法 は 菌 株 識 別 能 は 優 れ て い る も の の,手 技 が 煩 雑 で か つ 時 間 もか か
り,よ り簡 便 な 方 法 が 求 め ら れ て い る.
今 回 我 々 は 当 科 入 院 中 の 患 者 よ り 得 ら れ た MRSA株 をarbitrarily-primed polymerase chain reaction (AP-PCR)法5)∼8)を 用 い て typing し う る か 否 か を 検 討 し た の で こ こ に 報 告 す る. 材 料 と方 法 MRSA菌 株 は 保 存 株 を 一 晩 血 液 寒 天 培 地 で 増 別 刷 請 求 先:(〒761-07)香 川 県 木 田 郡 三 木 町 池 戸 1750-1 香 川 医 科 大学 第 一 内 科 北条 聡 子
感染症学雑誌
第69巻 第5号
殖 さ せ,コ ロ ニ ー を 白 金 耳 に て 掻 き 取 り生 理 食 塩 水1mlに 浮 遊 さ せ,上 清 を 取 り除 い た も の を 用 い た.MRSA菌 株 か ら のDNA抽 出 法 と し て9)∼11)標 準 的 で あ るlysostaphin (SIGMA, L4402) 1mg/ mlに て 溶 菌 し,10% sodium dodecyl sulphate (SDS)とproteinase K(最 終 濃 度 は0.5% SDSな ら び に100μg/mi proteinase K)処 理 の 後, phe-nolとchloroformに てDNAを 抽 出 し ethanol
で 沈 澱 さ せ る と い う 方 法 を 用 い た.さ ら に In-staGene Purification Matrix (BIO RAD, 732-6030)を 用 い た 簡 便 なDNA抽 出 法 を 併 せ て 行 い 比 較 し た.AP-PCRはd-NTP mixture各 2.5 mM, Taq-polymerase 5U/μl (TaKaRa Taq, R001 A),お よ びtemplate DNAを 加 え,そ れ ぞ れbufferをPCR Optimizer (Invitrogen, KA0893057)を 用 い 次 の よ う な 条 件 で 行 っ た.す な わ ちpH8.5に し て お い てMgC12を 1.5mmol/l ∼3 .5mmol/lに 変 化 さ せ た も の と,MgCl,を 3.5 mmol/lに し て お い てpHを8.5∼10.0に 変 化 さ せ た も の を 比 較 し た.primerはM13 sequencing primer (TTATG TAAAAC GACGGCC AGT), M13 reverse primer (GGA AAC AGCTA TGAC-CATG),お よ びFerricら が デ ザ イ ン し たKZ primer (CCCATGTG TACGCGT GTGGG)の 3 種 類 を 用 い た5).PCRの 温 度 設 定 と し て,最 初 に denaturation 92℃5分,annealing 40℃5分,お よ びelongation 72℃5分 に て2サ イ ク ル 増 幅 し た 後,denaturation 92℃1分, annealing 60℃ 1 分,お よ びelongation 72℃ 2分 に て40サ イ ク ル 増 幅 し た5).こ こ で 最 初 の2サ イ ク ル 増 幅 を 省 い た 際 の 反 応 結 果 に つ い て,2サ イ ク ル 増 幅 を 加 え た も の の 結 果 と 比 較 し た.電 気 泳 動 は polya-crylamide 10/20% gradient gelを 用 い40mAで 75分 泳 動 し た 後,ethidium bromideで 染 色 し た. AP-PCRに よ るtypingの 結 果 は 既 にMRSAの typing法 と し て 確 立 し て い るpulsed-field gel electrophoresis法 に よ るtypingの 結 果 と比 較 検 討 し た.
成 績
Fig.1にDNAの 抽 出 法 に よ るAP-PCR泳 動
パ タ ー ン を 示 す .標 準 的 にphenol/chloroform法
Fig. 1 Comparison of amplified products by
AP-PCR according to the methods of DNA
extrac-tion (MRSA with coagulase type IV, M13 reverse
primer was used).
Lanes 1 and 5 are same strains. Lanes 2 and 6, 3
and 7, 4 and 8 are also same strains severally .
Lanes 1 to 4: DNA was extracted by the phenol
chloroform
method Lanes 5 to 8: DNA was
extracted
by the Insta Gene method. All lanes
show same patterns.
を 用 い た も の とInstaGene Purification Matrix を 用 い た 方 法(以 下Insta Gene法)と を 比 較 し た と こ ろInsta Gene法 で もphenol/chloroform法 と 同 様 の 結 果 が 得 ら れ た(Fig.1).こ の た め 以 下 の 実 験 に お い てInsta Gene法 に よ りDNAを 抽 出 し た. Fig.2にMg濃 度 とpHの 差 異 に よ る AP-PCR泳 動 パ タ ー ン の 差 異 を 示 す.Mg濃 度 とpH の 差 異 に よ りAP-PCR泳 動 パ タ ー ン は 大 き く 異 な る こ と が 明 ら か に な っ た(Fig.2):よ り識 別 能 の 高 いbuffer条 件 と し て 以 下 の 実 験 で はpH 8.5, MgCl23:5mmol/lを 用 い た. AP-PCR反 応 の 温 度 と 回 数 の 選 択 に よ るAP-PCR泳 動 パ タ ー ン の 差 異 をFig.3に 示 す. 92℃ 5分 (denaturation), 40℃5分 (low-stringency annealing),72℃5分 (extension)を2サ イ ク ル 反 応 さ せ た 後,92℃1分 (denaturation),60℃ 1 分(high-stringencyannealing), 72℃2分 (exten-sion)を40サ イ ク ル 反 応 さ せ た2段 階PCRに よ る 泳 動 パ タ ー ン と,後 半 の40サ イ ク ル の み 行 っ た 泳 動 パ タ ー ン と を 比 較 し た.2段 階AP-PCRの 方 が
Fig. 2 Comparison of amplified products by
AP-PCR according to the buffer conditions (MRSA
with coagulase type II, M13 reverse primer was
used).
Lane 1: pH 8.5 MgCl2 1.5mmol/l,
2: pH 8.5
MgCl2 2.0mmol/1, 3: pH 8.5 MgCl2 2.5mmol/l,
4: pH 8.5 MgCl2 3.5mmol/l,
5: pH 9.0 MgCl2
3.5mmol/l,
6: pH 9.5 MgCl2 3.5mmol/l,
7: pH
10.0MgCl2 3.5mmol/l.
Lane 4 shows the most
clear pattern.
Fig. 3 Comparison of amplified products by AP-PCR between the two step AP-PCR and one step AP-PCR (MI3 reverse primer was used). Lanes 1 to 4: one step AP-PCR, Lanes 5 to 8: two step AP-PCR, Lanes 1, 2, 5, and 6: strains with coagulase IV, Lanes 3, 4, 7, and 8: strains with coagulase II, Lanes 5 to 8 are better than Lanes 1 to 4.
バ ン ドが 鮮 明 か つminor bandも 消 失 し て お り, よ り正 確 なtypingが 可 能 と 考 え ら れ た.以 下 の 実
Fig. 4 Comparison of amplified products by AP-PCR according to the primers.
Lanes 1, 2 in each gel: strains with coagulase IV, Lanes 3, 4 in each gel: strains with coagulase II, a): M13 reverse primer, b): KZ primer, c): M13 sequencing primer, d): M13 reverse primer & KZ primer, e) M13 sequencing primer & KZ primer, f): M13 reverse primer & M13 sequencing primer
a) b) c) 験 に お い て は2段 階AP-PCRを 選 択 し た. Fig.4にprimerの 種 類 に よ るAP-PCR泳 動 パ タ ー ン の 差 異 を 示 す.M13の み の も の と, M13 とKZの2本 を 使 っ た も の と,M13と M13 reverse2本 を 使 っ た も の は 泳 動 パ タ ー ン 識 別 能 が 不 良 で,か つ 増 幅 さ れ な い 株 が 目 立 つ た め に typingに は 適 さ な い と考 え ら れ た.KZの み の も の は 本 来 同 じ で あ る べ き 菌 株 間 に お い て も パ タ ー ン が 異 な っ て お り,同 じ くtypingに は 適 さ な い と 考 え ら れ た-M13 reverseの み の も の と, M13 reverseとKZの2本 を 使 っ た も の は 泳 動 パ タ ー ン 識 別 能 が 適 切 で あ っ た.
AP-PCRに よ るtypingの 結 果 とpulsed-field gelelectrophoresis法 のtypingの 結 果 と は 今 回 検 討 し た 菌 株 に お い て は 一 致 し た(デ ー タ 省 略).
考 察
近 年AP-PCRに よ るgenomic DNA finger-printing法 は 各 種 細 菌 のtypingに 広 く 用 い ら れ
る よ う に な っ て き た5)∼8).一 般 的 なPCRが 特 異 的 なoligonucleotideのprimerを 用 い てtemplate DNAを 増 幅 す る の に 対 し,任 意 のprimerを 用 い る た めAP-PCR法 に お い て はDNAの ど の 部 分 が 増 幅 さ れ る の か は 明 ら か で は な い.し か し な が ら 同 一 菌 株 に お い て は,そ のDNA生 成 物 に は 再 現 性 お よ び 特 異 性 が あ り,株 ご と の 相 違 点 は 泳 動 パ タ ー ン の 違 い と な っ て 現 れ て く る.AP-PCR法 に よ り正 確 にtypingす る た め に は,い か に 分 断 さ れ て い な いDNAを 抽 出 す る か が 重 要 な 因 子 で あ る.phenol/chlorofornl法 に よ る 標 準 的 なDNA 抽 出 方 法 はgenomic DNAを で き る だ け 切 断 し な い で 取 り 出 す 方 法 と し て 汎 用 さ れ て い る.し か しphenolな ど 有 毒 な 薬 剤 を 用 い な け れ ば な ら な い の と,時 間 の か か る 点 が 問 題 で あ る.一 方Insta Gene法 はVortexを 使 用 す る た めDNAの 安 定 性 と い う 面 で 問 題 が あ る も の のphenolを 使 う こ と も な く,1時 間 程 度 でDNAの 抽 出 が 可 能 で あ る.今 回 我 々 はphenol/chloroform及 びlnsta Gene法 の 両 者 を 用 い 比 較 し た が 泳 動 パ タ ー ン に 差 は な か っ た.こ の た め よ り簡 便 なInsta Gene法 が 手 技 時 間 を 節 約 す る 上 で 有 用 で あ る と考 え ら れ た.Bufferの 選 択 に つ い て は,Mg濃 度3.5mM, pH8.5の 条 件 が 至 適 で あ っ た.こ の よ う にMg濃 度 とpHの 違 い で 泳 動 パ タ ー ン に 差 異 が あ る こ と は 同 様 の 結 果 が 既 に 報 告 さ れ て い る12).次 に 増 幅 方 法 と し て2段 階AP-PCR5)の 有 用 性 に つ い て 考 察 し た い.こ の 場 合 最 初 の2サ イ ク ル で 任 意 の primerがtarget DNAと の 相 互 関 係 で 緩 徐 に 反 応 す る.そ の 後AP-PCR生 成 物 は 後 の40サ イ ク ル で 増 幅 さ れ る こ と に な る.我 々 の 成 績 で 示 さ れ る よ う に2段 階AP-PCRの 方 がminor bandも 消 失 し,40サ イ ク ル の み の 時 に 増 幅 さ れ な か っ た 株 も増 幅 さ れ 比 較 が 容 易 で あ り,ま た 再 現 性 に お い て も優 れ て い た.2段 階AP-PCRはAP-PCRの 不 安 定 さ を カ バ ー す る 方 法 と し て 有 用 で あ る と考 え ら れ た.Primerの 違 い に つ い て の 検 討 で あ る が,AP-PCRは 任 意 のprimerに よ っ て 任 意 の 部 分 が 増 幅 さ れ る た め,primerの 種 類 に よ りAP-PCRに よ る 泳 動 パ タ ー ン が 大 き く 異 な る も の と 考 え ら れ た.Belkumら6)はarbitraryな primer
やmecA geneを 含 ん だ13のprimerに つ い て の 検 討 を 行 っ て い る.我 々 の 成 績 で もM13 sequenc-ingの み,M13 sequencingとM13 reverse,お よ びM13 sequencingとKZの 両 者 を 用 い た も の と は 株 間 で 差 異 が 少 な く,か つ 増 幅 さ れ な い 株 が 目 立 ち,反 対 にKZの み の も の は 検 出 バ ン ド 数 が 多 す ぎ て 結 果 の 解 釈 が 困 難 で あ っ た.結 果 的 にM13 reverseの み を 用 い た も の がtypingに 適 切 で あ る と 考 え た.し か し,菌 株 に よ っ て はM13 reverse とKZの 併 用 が 必 要 と な っ た.今 回,増 幅 さ れ な い 株 が 存 在 し た も の の,そ れ は 無 意 味 で は な く増 幅 さ れ る 株 と さ れ な い 株 は 異 な る も の で あ る こ と を 示 す と考 え ら れ る.し か し,増 幅 さ れ な い 株 ど う し で のtypingは 不 可 能 で あ る た め,こ う い っ た 際 に も別 の 種 類 のprimerを 用 い て 確 認 す る 必 要 が あ る も の と 考 え られ た.
Ichiyamaら が 確 立 し たpulsed-field gel electrophoresis法4)に よ るtyping法 で は コ ア グ
ラ ー ゼIV型 は 全 て 同 じパ タ ー ン で あ り,AP.PCR の 結 果 と一 致 し た.一 方,コ ア グ ラ ー ゼII型 に っ い て はpulsed-field gel electrophroresis法 の 泳 動 パ タ ー ン は 様 々 で あ っ た.し か し な が らAP-PCR 法 で はM13 reverse primerの み を 用 い た 場 合, 同 じ 泳 動 パ タ ー ン と な っ た も の も 存 在 し た.そ れ に 対 し,M13 reverse primerとKZ primerの 併 用 で は 異 な る 泳 動 パ タ ー ン を 呈 し た.こ の よ う に 菌 株 に よ っ て はprimerを 選 択 す る 必 要 は あ る も の の,AP-PCR法 を 用 い たtypingは, pulsed-field gel electrophoresisに 比 べ は る か に 簡 便 で あ り, コ ア グ ラ ー ゼ 型,薬 剤 感 受 性 よ り も 詳 細 な 分 類 が 可 能 で あ る 点 で 臨 床 的 に 有 用 と考 え られ た.今 後 こ のAP-PCR法 を 用 い たMRSAのtypingの 臨 床 的 有 用 性 に つ い て 検 討 し て い く予 定 で あ る. 文 献 1) 岡 本 了 一, 大 久 保 豊 司, 井 上 松 久: MRSAの 起 源. 医 薬 ジ ャ ー ナ ル, 27: 25-29, 1991.
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12) Kohel, R. J.: Effect of concentration of MgCl2 on rondom-amplified DNA polymorphism. Biol. Techniques, 16; 652-655, 1994.
DNA Fingerprinting
by Arbitrarily
Primed Polymerase
Chain Reaction
(AP-PCR) for Methicillin-resistant
Staphylococcus aureus
Satoko HOJO1), Jiro FUJITA1), Kiyoshi NEGAYAMA3), Takayuki
OHNISHI1),
Guang XU1), Yasufumi YAMAJI1), Hiroki OKADA2) & Jiro TAKAHARA1)
1) First Department of Internal Medicine ,2) Primary Care Medicine, 3) Clinical Laboratory , Kagawa Medical School
