イ ンス リン受 容体 に関す る研 究
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(2) 80. 久 保. 2.63μgを30秒. 間 反 応 させ た 後, Sodium. bisulfite 1,000ngを ル ブ ミンBovine. Serum. 酸 緩 衝 液pH7.4, 止 させ た.そ. 加 え,さ. Meta. ら に2.5%牛. の 後5×50mmのCellulose. Colum 用する. 記 の方 法 で作 製. ℃ 3,000rpm. Precipitation. sulinをRRAに d)ヒ. 加 え,. Acid(TCA) の 後4. 30分 間 遠 心 し,沈 澱 物 の 放 射 能 活 性. を オ ー トウ ェ ル で 測 定 した.最 TCA. 終 濃 度5%. Testで90%以. そ の 後Assay. Volume. 1mlに. X‑100と0.24%ヒ. 酸. 間 孵 置 し た, 氷 冷 し た0.02%. トγ‑グ ロ プ リ ン 加0.1. 酸 ナ ト リウ ム 緩 衝 液0.5mlを. 加 え,さ. 加 え,氷. 静 置 さ せ た 後4℃3,000rpm30分. らに氷. 上 に10分. 間. 間 遠 心 し た.. 生 じた 沈 澱 物 の 放 射 能 活 性 を オ ー トウ エ ル で 測 定 し た. (ii)Immunoprecipitation法. に よ るRRA. 方 法 な ら び に 結 果 は 後 述 す る.. 上 の125I‑in‑. 2.結. 使 用 した.. 果. 1)Crude. ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン 受 容 体 の 蛋 白 定 量 は,. Membrane. Particulateを. 用. い たRRA a)温. 法. e)特. X‑100加0.1M燐. ナ ト リ ウ ム 緩 衝 液pH7.4で4℃18時. ト胎 盤 膜 イ ン ス リン 受 容 体 の 蛋 白 定 量. Lowry法22)に. 可溶 化 イン ス. Triton. 冷 し た25%PEGを1.5mlを. 7.4に125I‑insu1inを. 上 に10分 間 放 置 し た.そ. に よ るRRA. リ ン 受 容 体 を0.02%. M燐. さ らに 氷 冷 した10%Trichloracetic. Study. 0.1ngの125I‑insulinと150μgの. Triton. Activityは150〜. 識 イ ンス リンの活性 の 検討 法 酸 緩 衝 液pH. 準 じ て 測 定 し た.. c)Binding (i)PEG法. 200μCi/μgで あ っ た.. を等 量 加 え,氷. 法23)に. 血清ア. 分 画 に わ け,使. し た125I‑insulinのSpecific. c)標. 幸. 100μ1を 加 え 完 全 に 反 応 を 停. で 凍 結 保 存 した.上. 0.1M燐. 正. Albumin(BSA)加0.3M燐. で 精 製 分 離 し,各1mlの ま で‑20℃. 田. 度 お よび時 間経 過. Fig.. 1に. 示 す よ う に4℃. で孵 置 した時総 結合. 準 じて 測 定 し た.. 異 的 結 合 と非 特 異 的 結 合. 125I‑insu1inと ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン 受 容 体 と の 反 応 が 平 衡 状 態 に な る ま で 孵 置 させ た 後4℃ 3,000rpm30分. 間 遠 心 し上 清 を 吸 引 し,生. じた. 沈 澱 物 の放 射 能 活 性 を オ ー トウ エ ル で 測 定 し, こ れ を総 結 合 と した. 104ng/mlの. 非 標 識 インス. リン の 存 在 下 で の 結 合 を 非 特 異 的 結 合 と し,総 結 合 よ り非 特 異 的 結 合 を ひ き,こ. れ を特 異的 結. 合 と し た. f)Binding. Study. Fig.. 1. Time. ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リン 受 容 体 を50mMト 酸 緩 衝 液pH7.4で4℃18時 2)可 a)可. レ ッ トを1%vol/vol. Triton. ●. △‑△. 溶 化 イ ン ス リ ン受 容 体 の 作 製 法. 10万gペ. total. ● … …. 間 孵 置 し た.. X‑100. 間 撹 拌 した後,さ らに4℃200,000gで. 125I‑insulin. △. bound. nonspecific total. △ … …. は 孵 置 後6時. of. bound. nonspecific. 4℃. at. し た 時 総 結 合 は 孵 置 後1.5時. で 凍 結 保 存 し た.. あ っ た.非. の 平 衡 状 態 は4℃. し た.最. at. 4℃. at. 24℃. 24℃. bound. 特 異的 結. 間 で 頂 値 に 達 し た. 24℃ で 孵 置. が,そ. 可 溶 化 イ ン ス リン 受 容 体 の 蛋 白定 量 はWang. at bound. 間 後 も そ の 平 衡 状 態 は 維 持 さ れ た.非 合 は 孵 置 後1時. ま れ る 清 澄 な 上 清 を と り,使 用 す る ま で‑20℃. 溶 化 イ ン ス リン 受 容 体 の 蛋 白定 量 法. to. 間 で 平 衡 状 態 に 達 し,孵 置 後24時. 120分 間 超 遠 心 し,可 溶 化 イ ン ス リン 受 容 体 が 含. b)可. binding. receptor. ●‑●. リス塩. 溶 化 イ ン ス リン受 容 体 を用 いたRRA. で24℃60分. course. insulin. 0.1〜0.15ngの125I‑insulinと250〜300μgの. 間 で頂値 に達 した. の そ れ に 比 し短 時 間 で. 特 異 的 結 合 は 孵 置 後15分 で 頂 値 に 達. 大 特 異 的 結 合 は4℃. ℃ の 時 は16.5%で. あ っ た.特. の 時 は21.3%,. 24. 異 的 結 合 は4℃. の.
(3) イ ン ス リ ン受 容 体 に 関 す る研 究 時 の 方 が 高 値 を示 した が,非. 特 異 的 結 合 は24℃. の 時 の 方 が 高 値 を示 し た. b)孵. 4に. Study. 示 す よ う に18℃. はDilutionの. Fig. 2に 示 す よ う に 特 異 的 結 合 はpH7.8で 高 値 を 示 し,そ. d)Dissociation Fig.. 置 液 のpH. 81. れ よ り酸 性,ア. 最. ル カ リ性 側 で は. 低 値 を 示 し た.. tive. の50%Dissociation. み で は 孵 置 後74分,. Insulin(104ng/ml)で. Dissociation率. は,. れ の 時 間 で も,. Dilution+Native. がDilutionの. Dilution+Na‑. は22分 30分,. 60分,. で あ っ た.. 90分. み よ り高 値 を 示 し た.従. 胎 盤 膜 イ ン ス リ ン 受 容 体 はNegative tivityを. Fig. 2 c)蛋. Effect of pH. 後 の いず. Insulinの. 方. って ヒ ト Coopera. 有 す る こ と が 立 証 さ れ た.. of incubation buffer. 白濃度. Fig. 3に 示 す よ う に イ ン ス リン 受 容 体 の 蛋 白 Fig.. 濃 度 の 上 昇 と と も に 総 結 合 は 上 昇 す るが,非 異 的 結 合 も増 加 す る た め,特 白 濃 度 が500μgと700μgで. 4. Dissociation. 特. 異的 結合 は逆 に 蛋. dilution. ● … … ●. dilution+native. は 低 下 し た. e)Displacement. 3. Effect. of. insulin. receptor. protein. concentrations. ●‑●. total. ● … … ●. nonspecific. bound. insulin. 5に. 示 す. Curve よ う に ヒ. ト 胎 盤 膜 イ ン ス. of. Fig.. bound. only. 104ng/ml. Fig.. Fig.. study. ●‑●. 5. Displacement receptor. curve. of. insulin. リ ン 受.
(4) 82. 久 保. 容 体 へ の125I‑insulinの Insulinを. Insulinが. 正. 幸. 特 異 的 結 合 はNative. 増 加 さ せ る と 低 下 し,. Native. 田. 125I‑insulinと. ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン 受 容 体. へ 競 合 的 に 結 合 す る こ とが 立 証 さ れ た . DisplacementはNative. 50%. Insulinが22ng/mlの. 時 で あ っ た. f)Scatchard Fig.. Plots. 5のDisplacement. Plotsを. 作 製 し た.. Curveよ Fig.6に. 示 す. りScatchard よ う に ヒ ト. 胎 盤 膜 イ ン ス リ ン 受 容 体 に はAffinity の 異 な る2種 Low. の 受 容 体,す. Capacity,. Low. Constant. な わ ちHigh. Affinity‑High. Affinity‑ Capacity. が 存 在 す る こ と が 立 証 さ れ た.. Scatchard. Plots. か ら 各 々 のAffinty. 求 め る と,. High. Affinity‑Low =1. .140×109M‑1,. のAffinity り,. Constantを. CapacityのAffinity Low. ConstantK1. Affinity‑High. Capacity. ConstantK2=0.257×109M‑1で. Average. あ. AffinityKe=0.295×109M‑1で. あ っ た.. Fig.. 7(a),. (b). Specificity. of 125I‑insulin binding. to insulin receptor. 節 リ ウ マ チ(RA),甲 Connective. 状 腺 機 能 亢 進 症,. Tissue. 縮 性 糖 尿 病,イ Dependent. Disease(MCTD),脂. Diabetes. Mellits(IDDM)で. 合 を 調 べ た.. Fig.7(b)に. モ ン と し て,. Glucagon,. hormone(GH),. Fig.6. Scatchard. plots. hormone(TRH),. K2=0.257×109M‑1. mone(TSH), え,特. g)特 Fig.. 異性 7(a),. 示す よ うに各 種 ホル. L‑dihydroxyphenyl‑ Thyrotropin Thyroid. stimulating. releasing hor‑. Testosterone各100ng/mlを. 異 的 結 合 を 調 べ た.各. 加. 種 疾 患 患 者 の血 清. (b)は. ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン 受 特 異 的 結 合 が,種. 々の 患. 容 体 へ の125I‑insulinの 与 え な か っ た.こ. 特 異的 結合 に何 ら影響 を. の こ と に よ り ヒ ト胎 盤 膜 イ ン. 者 血 清 お よび 各 種 ホ ル モ ン で 影 響 さ れ る の か ど. ス リ ン 受 容 体 へ の125I‑insulin結. う か を み た 図 で あ る.. わ め て 高 い こ と が 立 証 さ れ た.. 患 者 血 清 と し て,全 Lupus. γ‑ami. お よ び 各 種 ホ ル モ ン は ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン 受. 容 体 へ の125I‑insulinの. temic. Growth. Cortisol,. acid(GABA),. K1=1.140×109M‑1. 不安. 加 えて 特 異 的 結. C‑peptide,. ACTH,. L‑alanine(L‑DOPA),. of insulinreceptor. 肪 萎. ン ス リ ン 依 存 性 糖 尿 病Insulin. 定 型 糖 尿 病 の 患 者 の 血 清50μ1を. nobutyric. Mixed. Fig.7(a)に. 示す よ うに. 身 性 エ リ テ マ ト ー デ スSys. Ervthematodes(SLE).慢. 性 関. 2)可 i)PEG法. 合 の 特 異性 が き. 溶 化 イ ン ス リ ン 受 容 体 を 用 い たRRA.
(5) イ ン ス リ ン受 容 体 に 関 す る 研 究 Fig. 8は 孵 置 液 中 のTritonX‑100濃. 度 によ. 83. 的 力 価 の 異 な る イ ン ス リ ン誘 導 体, Monocom. り可 溶 化 イ ン ス リ ン受 容 体 へ の125I‑insulinの 特. ponent. 異 的 結 合 が ど の よ うな 影 響 を うけ る の か を示 し. insulin各20ng/mlで125I‑insulinと. た 図 で あ る. TritonX‑100濃. ス リ ン受 容 体 との 特 異 的 結 合 は,生 物 学 的 力 価. 度 が0.02%で. ある. Insulin,. Desoctapeptide. に 比 例 して 各 々4.9%, cementさ. Insulin,. Pro. 可溶化イン. 5.6%。6.9%とDispla. れ た.. ii)Immunoprecipitation法 後 述 す る. イ ンス リン抵抗 性 糖尿 病 患 者の 血 清 中 の 抗 イ ン ス リ ン受 容 体 抗 体 1.. Crude. Membrane. Particulateを. 用いた. 抗 イ ン ス リン 受 容 体 抗 体 の 測 定 0.1ng125I‑insulinと320μgヒ. ト胎 盤 膜 イ ン ス. リ ン受 容 体 と を孵 置 す る際 に,正 び1倍,. 10倍,. 常 人血 清 お よ. 100倍 稀 釈 の 本 患 者 血 清 各50μl. を加 え て,ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン 受 容 体 へ の 125I‑insulinの 特 異 的 結 合 に お よぼ す 抗 イ ン ス リ ン 抗 体 価 の 影 響 を調 べ た.そ Fig.. 8. Effect. of concentrations. of Triton. X‑100. す る と, Triton. X‑100. し て, 時 の 特 異 的 結 合 を100%と 濃 度 が0.5%, %,. 41.8%と. 1%の. 時 の 特 異 的 結 合 は 各 々54.1. 低 下 し て い た.. Fig.9は. ン ス リ ン 受 容 体 へ の125I‑insulinの 7.1%で. あ っ た.. 可溶 化 イ. 特 異 的結 合 は. 時 で あ っ た.同. 1倍,. 10倍, 100倍 稀 釈 の 本 患 者 血 清. を加 え た 時 の 結 合 阻 害 率 で抗 イ ン ス リン 受 容 体 抗 体 価 を 示 し た. 2.症. 例 の 臨 床 経 過 な ら び に そ れ に伴 う 抗 イン ス リン受容 体 抗体 価 の 経 時的 推 移. 50%DisplacementはNative. Insulinが36ng/mlの. し て正 常. 人 血 清 を 加 え た 時 の 特 異 的 結 合 を100%と. 様 に生 物学. 私 達 が 経 験 し たSjogren症. 候 群 を合 併 し た イ. ン ス リ ン抵 抗 性 糖 尿 病 患 者20)の 血 清 を用 い て, 抗 イ ン ス リ ン受 容 体 抗 体 価 の 経 時 的 推 移 と臨 床 症 状 と を 比 較 検 討 し た. 患 者 は45才,女. 性 で,主. 訴 は 口 渇,顔. 面 紅斑. で あ る. 家 族 歴 と し て は 糖 尿 病 は な く,既 往 歴 と し て は19才 の 時 肺 結 核 に 罹 患 し て い る. 現 病 歴 と し て は1972年6月. 多 発 性 関 節 痛 と両. 頬 部 の 紅 斑 を き た し, 11月 に はRaynaud現. 象,. 12月 に は 口 渇 と 多尿 を 自覚 す る よ うに な り,翌 年4月23日. 精 査 の た め 岡 山 大 学 附 属 病 院 第3内. 科 へ 入 院 し た. 入 院 時 現 症 と し て は 肥 満 は な く,顔 を認 め,両 Fig.. 9. Displacement insulin. receptor. curve. of. solubilized. 面 に紅 斑. 側 の 耳 下 腺 腫 脹 が み られ た.. 入 院 時 検 査 異 常 所 見 と して,尿 球 減 少, RAテ. ス ト陽 性,. TPHA反. 糖 陽 性,白. 血. 応 陽性 を.
(6) 84. 久 保. PSL:. Prednisolone.. ANA:. Antinuclear. CPM:. Cyolopiosptsmide.. Antibodies,. OTT:. FOG:. Glucose. Fig.. 認 め た.し. Fasting. Tolerance. Blood. Test,. 10. か し 入 院 時 は 抗 核 抗 体,抗. ロ プ リ ン抗 体 は 陰 性 で,抗DNA抗. 田. IRI:. Laboratory. サ イロ グ. 体 価 は正 常. で あ っ た.. Glucose,. 幸. ESR:. Immunoreective. 示し. た 入 院 後 の 空 腹 時 血 糖 とγ‑グロ ブ リン 血. Erythrocyte Insulin. Sedimentation. (ƒÊU/ml),. BG:. Rate. Blood. Glucose. (mg/dI). findings. 倍 血 清 で72.3%, ら れ た.イ ず,血. 入 院 後 の 臨 床 検 査 所 見 の 推 移 をFig.10に た.ま. 正. 100倍 血 清 で22.3%の. 阻害 が み. ン ス リン投 与 量の 増加 に もかか わ ら. 糖 値 は さ ら に 上 昇 し て い き,イ. 治 療 は 無 効 と判 断 さ れ,か ギ ー が 出 現 し た た め,. ン ス リン. つ イン ス リンア レル. 10月 初 め に イ ン ス リ ン 投. 症 と抗 イ ン ス リン 受 容 体 抗 体 価 の 推 移 と 治 療 を. 与 は 中 止 さ れ た.ブ ホ ル ミ ン1日300mg,つ. Fig.11に. グ リベ ン ク ラ マ イ ド5〜7.5mgの. 示 し た.. 入 院 後 施 行 さ れ た 経 口50gGTTで. 耐 糖能 異常. な わ れ た が,血. と著 し い 高 インス リ ン血 症 と高C‑ペ. プ チ ド血 症. 薬 剤 の 効 果 は み られ な か っ た.こ. 糖 値 は さ らに 上 昇 し,こ れ ら の. が み ら れ た.ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リン 受 容 体 へ の 125I‑insulin結 合 は , 1974年4月26日 の1倍 血 清. 検 索 が お こ な われ,末. で54.8%阻. ㎎/dl, IgA850mg/dl,. 害 さ れ た.こ. で あ っ た た め,当. の 頃尿糖 の排 泄が 増 量. 初 グ リベ ン ク ラ マ イ ドが 投 与. さ れ た が 効 果 は み られ な か っ た.そ. の た め5月. 67.0%,. の頃 免疫 学 的. 梢 血 中 リ ンパ 球 はT‑cell. B‑ce1171.9%で. 1975年1月. いで. 併用 投与がお こ. あ っ た.ま. IgM170mg/dlで. たIgG5000 あ っ た.. に は 抗 核 抗 体 が 弱 陽 性 と な り,こ の. 頃 施 行 さ れ た イ ン ス リ ン テ ス ト(ア. 14日 か ら ラ ピ タ ー ドイ ン ス リ ン の 投 与 が 開 始 さ れ,空. す よ う に 外 来 性 イ ン ス リン の 血 糖 降 下 作 用 は み. 腹 時 血 糖 は しば ら くの 間 ほ ぼ 正 常 値 を示. し た が,食. 後 高 血 糖 は 持 続 して い た.そ. 高 血 糖 が 持 続 し て い き,ラ. の後 も. ピ タ ー ドイ ン ス リ ン. られ な か っ た. 1975年2月. れ,両. 抗 体 価 の 上 昇 が 軽 度 認 め られ た に す ぎ な か っ た.. 拡 張 が み られ た.同. ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン受 容 体 へ の125I‑insulin結. チ グ ラ ム で は,耳. 合 は, 1974年9月6日. れ な か っ た.ま. 血 清 で76.8%,. 10. はFig .10に 示. に は 耳 下 腺 腫 脹,目. の異 常 感 を自覚 した ため 耳下 腺 造影 が お こなわ. は164単 位 ま で 増 量 さ れ た が,抗 イ ン ス リ ン 結 合. の1倍. 位 静 注)で. ク トラ ピ タ. ー ドイ ン ス リ ン50単. 側 に典 型 的 な雪 花 状 陰影 と腺管 末 梢部 の 時 に施 行 され た耳 下 腺 シン. 下 腺 へ の99mTcの たShirmerテ. 摂取はみ ら. ス ト陽 性 を 示 し,.
(7) イ ン ス リ ン受 容 体 に 関 す る研 究. Fig.. Sjogren症. 11. Clinical. features. 候 群 と診 断 さ れ た.こ. and. changings. of. の 頃 血 沈 は1. 時 間値 が91mmと 亢 進 し,抗 核 抗 体 陽 性(Speckled Pattern),. RA因. 子 陽 性 と免 疫 学 的 異 常 を 示 し,. 空 腹 時 血 糖400mg/dl,. 1日 尿 糖200gと. 尿 病 状 態 を呈 した.ヒ. ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン受 容. 著 しい糖. 体 へ の125I‑insulinの 結 合 は, 2月28日 清 で100%, 76.2%と. 10倍 血 清 で94.8%,. の1倍. 血. 100倍 血 清 で. 著 し い 阻 害 が み ら れ た.ま. たIM‑9細. 胞 に よ る 抗 イ ン ス リ ン受 容 体 抗 体 価 の 検 索 が 米 国 のNational. Institutes of HealthのFlierら. に よ っ て な さ れ, 500倍 血 清 で も50%の. 結合 阻害. を 示 し高 力 価 で あ る こ とが 示 さ れ た.. 3月 初 旬. プ レ ドニ ゾ ロ ン(PSL)の ら に3月. 投 与 が 開 始 さ れ,さ. 末 に は サ イクロフ ォス フ ァマ イ ド(CPM). も併 用 投 与 され た.同. 時 に ア ク トラ ピ ッ ドイ ン. titers. of. antireceptor. 85. antibodies. B‑cellの 減 少 が み ら れ,同. 時 に 血 糖 も低 下 傾 向. を示 し た.ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン受 容 体 へ の 125I‑insulinの 結 合 は6月1日 の1倍 血 清 で な お 91.6%,. 10倍 血 清 で40%,. の 阻 害 が み ら れ た が,. 100倍 血 清 で16.8%. 2月 に 比 し 抗 イ ン ス リン. 受 容 体 抗 体 価 が 減 少 し血 糖 値 の 低 下 傾 向 が み ら れ,こ. れ らの 免 疫 抑 制 療 法 の 効 果 を 認 め た.. 月 初 旬 結 核 性 髄 膜 炎 を合 併 し た が,抗. 6. 結核剤の. 投 与 に よ り改 善 を み た. 6月 末 に は モ ノ コ ン ポ ‑ネ ン トセ ミ レ ン テ イ ン ス リ ンが 投 与 され た . 一 時 結 核 性 髄 膜 炎 の た め 中 止 され て い たCPM も7月. 末 に は 再 び 投 与 さ れ た.そ. の 後 白血 球 減. 少 の た め 本 剤 は 一 時 中 止 さ れ て い た が, 旬 よ り)50mgか ら25mgの た.. 8月 中. 週4日 投 与 が お こ な わ れ. 9月 に は 空 腹 時 血 糖 が 正 常 化 した た め,モ. ス リ)ンも最 高440単 位 ま で 投 与 され た.こ れ らの. ノ コ ン ポ ー ネ ン トセ ミ レ ン テ イ ン ス リ ン は 中 止. 免 疫 抑 制 療 法 に よ り,高. さ れ た.ヒ. 善,抗. 核 抗 体 の 陰 性 化,末. γ‑グロ ブ リ ン 血 症 の 改 梢 血 中T‑cellの. 増 加,. ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン受 容 体 へ の125I‑. insulinの 結 合 は, 10月21日. の1倍. 血 清 で も12 .9.
(8) 86. 久 保. %の. 阻 害 が み ら れ た に す ぎ な か っ た.ま. 田. 正. 幸. たIM‑9. 細 胞 で も 抗 イ ン ス リ ン受 容 体 抗 体 は も は や 検 出 さ れ な か っ た.同 GTTで. 時 に10月. に 施 行 さ れ た 経 口50g. は 耐 糖 能 は 正 常 化 し,ま. テ ス ト(レ で は,前. た イ ンス リン. ギ ュ ラ ー イ ン ス リ ン0.1単. 値 が82mg/dl,. 位/kg静. 注). 30分 値 が45mg/dl,そ. の. 後 は 著 し い 低 血 糖 症 状 の た め テ ス トの 継 続 は で き な か っ た.. 11月 末 に はCPMも. 経 過 観 察 中,. 12月. が み ら れ た.ヒ 125I‑insulinの %,. 中 止 し,. PSLで. 中旬 に再 び軽 度 の耐糖 能 異 常. ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン 受 容 体 へ の 結 合 は , 12月9日. 10倍 血 清 で も33.5%の. の1倍. 血 清 で47.1. 阻 害 が み ら れ,再. び. 抗 イ ン ス リ ン 受 容 体 抗 体 価 の 上 昇 を 認 め た.そ こ で 再 びCPMの. 投 与 が お こ な わ れ た.ヒ. 盤 膜 イ ン ス リ ン 受 容 体 へ の125I‑insulinの 1976年5月18日. ト胎 結 合 は,. Fig.. 12•@ Displacement in. の 血 清 で は ほ とん ど 阻 害 が み ら. れ な か っ た.な. curve. presence. of. insulin. of. antireceptor•@. of. insulin. receptor antibo. dies. お そ の後 の検 索 に よ って本 患 者. の 抗 イ ン ス リ ン 抗 体 はIgGに. the. ある こ とが確 認 さ. れ た. 全 経 過 を 通 じて イ ン ス リ ン拮 抗 ホ ル モ ン が 測 定 さ れ た が 正 常 で あ り,そ. の 他 の イ ン ス リ ン抵. 抗 性 の 原 因 は 認 め ら れ な か っ た. 3.. Displacement. CurveとScatchard. Ana‑. lysis 抗 イ ンス リン受容 体抗 体 が イ ンス リン受容 体 へ の125I‑insulinの る た め に,. 特 異 的 結 合 に 与 え る 影 響 をみ. 0.1ngの125I‑insulinと300μgの. ヒ ト. 胎 盤 膜 イ ン ス リ)ン受 容 体 と1975年4月5日 倍 患 者 血 清50μlと 清50μlの り,. を 孵 置 し た.. Fig.12は. 存 在 下 で のDisplacement. Fig.13は. の10 患者 血. Curveで. そ のDisplacement. Fig.. 13•@ Scatchard the. あ. Curveよ. り作. Fig.13に. 示 す. plots. presence. of. antireceptor. receptor. in. antibodies. K1=0.417•~109M-1 K2=0.105•~109M-1. 製 し たScatchard. Plotsで. あ る.. よ う に 抗 イ ン ス リ ン 受 容 体 抗 体 の 存 在 下 で も,. が,コ. ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン 受 容 体 に はAffinity. 体 の 存 在 下 で イ ン ス リ ン受 容 体 数 に 有 意 の 変 化. stantの. 異 な る2種. Affinity‑Low Capacityが は,. の 受 容 体,す. Capacity, 存 在 し,各. K1=0.417×109M‑1,. Average. Affinity. Low. な わ ちHigh. 々 のAffinity. K2=0.105×109M‑1,. ン ト ロ ー ル のK1,. と,患. 者 血 清 添 加 に よ りK1は36.6%, Keは43.4%で. Plotsの. 4.可. Constant. Ke=0.128×109M‑1で K2,. あ っ た.一. 横 軸 切 片 は イ ン ス1)ン. す る. K2は35.6. 方Scatchard 受 容体 数 を示す. 溶 化 イ ン ス リ ン受 容 体 を用 い た 抗 イ ン ス リ ン受 容 体 抗 体 の 検 出. a) あ っ. Keを100%と. ン トロ ー ル に 比 し抗 イ ン ス リ ン 受 容 体 抗. は み ら れ な か っ た.. Affinity‑High. た.コ. %,. Con‑. PEG法. 可 溶 化 イ ン ス リン 受 容 体 へ の125I‑insulinの 特 異 的 結 合 は,患. 者血 清 中 に含 まれ る抗 イ ンス リ. ン 抗 体 へ の125I‑insulinの 特 異 的 結 合 を 減 じ て 求 め た.正. 常 人 血 清,抗. 価 を 示 す 患 者 血 清,. イ ン ス リ ン抗 体 価 が 高 力 1975年2月28日. の本 患者 血.
(9) イ ン ス リン 受 容 体 に 関 す る研 究 清 各50μlに つ い て 試 み た.可. 溶 化 イ ン ス リ ン受. 容 体 へ の125I‑insulinの 結 合 は 各 々6.4%, 0.2%で. 5.2%,. あ っ た.. 血 清 中 の 抗 イ ン ス リン 受 容 体 抗 体 で 可 溶 化 イ ン ス リ ン 受 容 体 へ 結 合 し た125I‑insulinと. は,. (i)材. 89%,. 料 な らび に方 法. あ ら か じめ 正 常 人 血 清 と イ ン ス リ ン抵 抗 性 糖 尿 病 患 者 の 血 清 を56℃30分. 間 孵 置 し た. Harri‑ 血. の正 常妊 婦 の 正 常 満期 分 娩 胎盤 よ り 可 溶 化 イ ン ス リン受 容 体 を0.. 02%TritonX‑100加0.1M燐. 酸ナ トリウム緩 衝. 液pH7.4で24℃1時. 間 孵 置 し た 後,前. た 正 常 人 血 清 で100倍. に稀 釈 した前処 理 患者 血. 清 を20μl加 え,さ. らに1時. ム 緩 衝 液pH7.4で10倍. の後. 酸 ナ ト リウ. に 稀 釈 し た 羊 抗 ヒ トIgG. を50ul,. 100μl, 150μlを 加 え て4℃4時. し た.そ. の 後Beckman. 5分 間 遠 心 し,生. 処理 し. 間 孵 置 し た.そ. 氷 冷 して 反 応 を 完 全 に 止 め0.1M燐. 10倍 稀 釈IgG50μl, 2.51%,. 間孵 置. Microfuge4℃10,000g. 0.93%,. 3.11%で. 50μl,. 1.30%で. 150μlで. あ っ た.一. 100μl,. 各 々0.. 方患 者 血清. 150μlで. あ っ た.. お こ な い,各. Blankは. 法 と同様 な操 作 を. 々 羊 抗 ヒ トIgGで. し た125I‑nsulinを. 各 々0.73%,. Receptor. 正 常 人 血 清 を 用 い て 上 記2方. 非特 異 的 に沈 降. 示 し て い る.正. 常 人血清 で. 可 溶 化 イ ン ス リ ン受 容 体 へ 非 特 異 的 に 結 合 した 125I‑insulinは. ,. 10倍 稀 釈 羊 抗 ヒ トIgG50μl,. μl, 150μlで 各 々0.62%, た.ま. 0.83%,. 1.01%で. あ っ. insulinは,. 10倍 稀 釈 羊 抗 ヒ トIgG. 150μlで 各 々0.68%,. 0.80%,. 50μl, 100μl,. 1.02%で. あ っ た.. 従 っ て 抗 イ ン ス リ ン 抗 体 へ の125I‑insulinの. じた沈 澱 物 の放 射 能 活 性 を オ. 的 結 合 は,Receptor 抗 ヒ トIgG. と 同 様 に 孵 置 させReceptor. 0.13%,0.29%で. し た.. (ii)結 果. 100. た 正 常 人 血 清 と 非 特 異 的 に 沈 降 し た125I‑. ー トウ ェ ル で 測 定 した .正 常 人 血 清20μlを 上 記 Blankと. 100μl,. 中 の 抗 イ ン ス リ ン 抗 体 へ 結 合 し た125I‑insulinは, 10倍 稀 釈IgG. sonら の 方 法24)に準 じ, 0.15ngの125I‑insulinと. 作 製 し た240μgの. 本 患者 の. 血 清 中 の 抗 イ ン ス リン 抗 体 へ 結 合 し た125I‑insulin. b)Immunoprecipitation法. 液 型 がO型. 87. Blankを. 50μl,. 100μl,. 減 じ10倍. 150μlで. あ っ た.同. 特 異 稀釈 羊. 各 々0.05%,. 様 に抗 イ ンス リン. 受 容 体 抗 体 で 可 溶 化 イ ン ス リ ン 受 容 体 へ の125I‑. Fig.14は. 可 溶 化 イ ン ス リン 受 容 体 を 用 い て19. 75年2月28日. の 本 患 者 の 血 清 中 の 抗 イ ン ス リン. insulinの. 特 異 的 結 合 は,. Receptor. じ10倍 稀 釈 羊 抗 ヒ トIgG50μl, 各 々0.16%,. 1.58%,. 100μl,. 1.81%で. 考. 減. 150μlで. あ っ た.. 察. ポ リペ プ チ ド ホ ル モ ン は,各 激 な,か. Blankを. 々 の 受 容 体 と急. つ 可 逆 的 な 特 異 的 結 合 を 介 し て,標. 的. 器 官 に そ の 生 物 学 的 作 用 を 発 現 させ る こ とは 既 知 の 事 実 で あ る.イ 125,00025)位. ン ス リン 受 容 体 は 分 子 量. のGlycoproteinの1種. に 存 在 し,ス. で形質 膜 上. テ ロ イ ドホ ル モ ン と は 異 な り,受. 容 体 を介 し て イ ン ス リ ン が 細 胞 内 へ 入 る こ とは. Fig.. 14. Immunoprecipitation ●‑●. method. patient's. serum. with. ● … ● patient's. serum. without. ○‑○. receptor. normal. serum. with. ○ … 〇 normal. serum. without. な い と さ れ て き た.し. か し イ ン ス リ ン受 容 体 は. い くつ か のSubunitか. ら な り26). , 125I‑insulinの. 細 胞 内 へ の 移 行,す. な わ ちInternalizationが. Autoradiographyで. 認 め ら れ た と い う事 実 か ら. receptor イ ン ス リン もそ の 受 容 体 を介 し て 細 胞 内 へ 入 る. receptor receptor. こ と が 確 認 さ れ た27 .し 特 異 的 な125I‑insulinの. 受 容 体 抗 体 の 検 出 をImmunoprecipitation法 お こ な っ た 図 べ あ る.図. で. に示 す よ うに本 患者 の. Intemalizationが. か し細 胞 内 小 器 官 へ の 集 積 像 は 認 め ら れ ず,. イ ンス リン作 用発 現 に 必 須 の. 条件 で あ るか 否か は今 後 の研 究 課題 として 残 さ.
(10) 88. 久 保. 田. れ た 問 題 で あ る. 個 々 の ホ ル モ ン に よ りそ の 受 容 体 部 位 は 相 異 容 体 の もつ 一 般 的 特 性 に 類 な わ ち受容 体 とホ ル モン の特. 異 的 結 合 は,孵 置 液 のpH,孵. 置 時 の 温 度,受 容. 体 の 蛋 白 濃 度 に よ り影 響 を う け る が,そ. の結 台. は きわ め て 特 異 性 が 高 い こ とが 証 明 さ れ て い る. イ ン ス リン 受 容 体 は, Negativc を有 し28), Scatchard Constantの. Capacityが. Cooperativity. Plots解 析 よ りAffinity. 違 う2種. Affinity‑Low. の 受 容 体,す. Capacity,. Low. な わ ちHigh. Affinity‑High. あ る こ と が 証 明 さ れ て い る.. 基 礎 的 検 討 をお こ な い,前. 結 果 を え た が,以. 述 の よ うな. 下 これ らの事 項 につ いて若 干. の 考 察 を加 え て み た.. IDDMで. 清 で は 影 響 を う け ず,ま tide,. GH,. DOPA,. こ な っ た 今 回 の 実 験 で は,平 で の 時 間 は24℃ の 方 が4℃. 値 を示 した. Harrison9)も. 者がお. 衡 状 態 に達 す る ま よ りも短時 間 で あ っ. 異 的 結 合 は 逆 に4℃. TRH,. Dissociation. L‑. Testosteroneの. 各種 ホ. の 特 異性 が 高 い こ と. Studyに. つ い て,筆. 者 の今 回の. 実 験 で は ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン 受 容 体 はNega tive. Cooperativityを. た.同. 様 にDe. Studyを. 有 して い る こ と が 示 さ れ. Meyts28)は. お こ な い,こ. に はNegative. 人 リン パ 球 と ラ ッ ト. れ ちの イ ン ス リ ン受 容 体. Cooperativityが. あ っ た と述 べ. て い る.. の 方 が24℃ よ り高. 可 溶 化 イ ン ス リン 受. 受 容 体 はScatchard nity. で12時 間, 15℃ で2時. 間,. 間, 37℃ で30分 間 で あ っ た と し て い. して 特 異 的 結 合 は 低 温 で 孵 置 す る ほ ど高. 体 か ら な り, Affinity‑Low LowA. ffinity‑High. 者がおこ. pacity. な っ た 実 験 で は 特 異 的 結 合 はpH7.8で. 最大値 を. Capacity. 値 を示 した. Marshall29)も 特 異 的 結 合 はpH7.0 〜8 .0で 最 大 で あ っ た と し て い る.. 各 々High. K1=1.140×109M‑1, Capacity. のAverage. K2=0.257×109 Affinity. あ っ た.. Posner7)も. Ke=0.. ヒ ト胎 盤 膜 イ. の 異 な るAffinity. Cons. 有 す る イ ン ス リ ン 受 容 体 か ら な り,各 ConstantはHigh. Affinity‑Low. K1=4.2×10aM‑1,. Low. K2=0.7×108M‑1で. 々 Ca. Affinity‑High あ っ た と報 告 し. て い る. 以 上 ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン 受 容 体 の 基 礎 的 検 討 を お こ な い,ヒ. 蛋 白 濃 度 に つ い て は 筆 者 の 今 回 の 実 験 で は,. の イ ン ス リン 受 容. Constantは. ン ス リ ン 受 容 体 は2種. 関 係 で は,筆. れ よ り酸 性 側 で も ア ル カ リ性 側 で も低. Affinity. あ り,そ. tantを. 析 に よ る と, Affi. 異 な る2種. Capacity. Affinity. 値 を示 した と報 告 して い る.. Plots解. Constantの. 295×109M‑1で. 示 し,そ. TSH,. C‑pep. GABA,. が 示 さ れ た.. る ま で の 時 間 は4℃. つ ぎに 孵 置 液 のpHの. Cortisol,. ル モ ン の 影 響 も う け ず,そ. M‑1で. る.そ. 肪 萎縮. たGlucagon,. ACTH,. 容 体 で 温 度 の 影 響 を み て お り,平 衡 状 態 に 達 す. 24℃ で1時. MCTD,脂. 不 安定 型 糖尿 病 の 患 者 の血. 筆 者 の 今 回 の 実 験 で は ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン. 温 度 と時 間 経 過 に つ い て で あ る が,筆. た が,特. 状 腺 機 能 亢 進 症,. 性 糖 尿 病,. 肝 細 胞 膜 の イ ン ス リ ン 受 容 体 のDissociation. 筆 者 は ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リン 受 容 体 を 用 い た RRAの. 幸. ウ マ チ,甲. を 認 め は す るが,受 似 点 を 認 め る.す. 正. ト胎 盤 膜 イ ン ス リン 受 容 体 の. 特 性 を 明 ら か に し た.そ. して この 基礎 的検討 を. 特 異 的 結 合 は 蛋 白濃 度 の 増 加 と と も に350μgま. ふ まえて 私達 が 経 験 した イ ンス リン抵抗 性糖 尿. で は 増 加 し た が, 500μgと700μgで. 病 患 者 の 抗 イ ン ス リン 受 容 体 抗 体 に つ い て 検 討. は 逆 に減 少. し た. Marshall29)も 特 異 的 結 合 は ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リ)ン受 容 体 の 蛋 白 濃 度 が500μgま. では正 の. 相 関 関 係 を 示 し て 増 加 して い くが,そ. れ以上 の. を 重 ね た. Flier30)ら. はAcanthosis. Nigricansを. 血 中 イ ン ス リ ン 濃 度 が 著 し く 高 く,か. 伴 い, つ 外来性. 蛋 白濃 度 では 総結 合 は ほぼ 平衡 状 態 に達 す るの. イ ン ス リ ン に 対 す る 反 応 が 極 め て 悪 い6例. に 対 し て,非. 満 を伴 な わ な い 女 性 糖 尿 病 患 者 の 報 告 を お こ な. 特 異的 結合 は 逆 に増 加 す るた め特. 異 的 結 合 は 減 少 し た と述 べ て い る. 特 異 性 に つ い て み る と,筆. 者が お こ な った今. 回 の 実 験 で は ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン受 容 体 へ の 125I‑insulinの 特 異 的 結 合 は , SLE,慢 性関節 リ. っ た.そ. して こ れ らの 患 者 か ら 採 取 し た 単 球 に. 対 し て は125I‑insulinの り,か. の肥. つ こ の う ち3人. 結 合 は 著 し く低 下 し て お の 患 者 で は ラ ッ ト肝 細 胞. 膜 や ト リ赤 血 球 に 患 者 血 清 を 前 孵 置 さ せ る と,.
(11) イ ン ス リン 受 容 体 に 関 す る研 究 125I‑insulinの 結 合 が 低 下 す る 事 実 を み い だ し. ,. 89. よ う に 抗 イ ン ス リ ン受 容 体 抗 体 価 の 詳 細 な経 時. 患 者 の 血 清 中 に 存 在 す る 免 疫 グ ロ ブ リ ン の1つ. 的 推 移 を 観 察 し た の は 他 に な く,われ わ れ の症 例. が125I‑insulinと イ ン ス リ ン受 容 体 との 特 異 的 結. は こ の 点 に お い て も興 味 の あ る 貴 重 な症 例 で あ. 合 を 抑 制 し,そ. っ た.. れ が イ ン ス リ ン抵 抗 性 の 病 因 で. あ る と推 論 した.さ ら にKahn31)ら Nigricansを. はAcanthosis. 上 述 の 如 く本 患 者 の イ ン ス リ ン抵 抗 性 の 病 因. 合 併 し極 め て 強 度 の イ ン ス リ ン 抵. 抗 性 を示 す6症. 例 の う ち,若. 年女 子 で 成長促 進. や 男 性 化 を 示 し イ ン ス リ ン受 容 体 の 一 次 的 欠 如 を有 す る と思 わ れ る もの をType. Aと. し,血. 清. 中 に イ ン ス リン 受 容 体 へ の イ ン ス リ ン結 合 の 阻 害 を も た らせ る 因子 を 有 す る も の をType し た.そ. して こ れ ら6症. Bと. 例 の 臨 床 症 状 と検 査 成. Type. Bは,臨. が み ら れ,臨 値 の 亢 進,白 症,抗. 床 的 所 見 と し て はAcanthosis 液 腺 腫 脹,関. 節 痛,頭. 沈. γ‑グロ ブ リ ン 血. 核 抗 体 陽 性 等 の 免 疫 学 的 異 常 が み ら れ る.. 本 症 例 で はAcanthosis な い が,臨. Nigricansこ. そ み られ. 床 的お よび臨 床検 査所 見 は前 述 の所. 見 と き わ め て よ く一 致 し, Type の で あ る.筆. Bに 属 す る も. 者 は 前 述 の 如 く ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス. リ ン 受 容 体 を用 い てType. Bの 症 例 の 患 者 の 血. 清 中 の 抗 イ ン ス リ ン受 容 体 抗 体 価 の 詳 細 な 変 動 を 観 察 し た.そ. 性 を ひ き お こ す 機 序 を 考 察 す る た め に, 1975年 4月5日. の 本 患 者 の10倍 稀 釈 血 清50μlを 加 え て. Scatchard っ た.抗. Plotsを. 作 製 し,そ. の解析 をお こな. イ ン ス リン 受 容 体 抗 体 に よ り,ヒ. して興 味 深 い こ とに抗 イ ンス リ. ト胎. 盤 膜 イ ン ス リ ン受 容 体 へ の125I‑insulinの 結 合 は に 比 べ51.9%と. 低 下 し て い た .ま. た 同 時 に お こ な っ たScatchard. 髪 の脱毛. 床 検 査 所 見 と して は 蛋 白尿,血 血 球 数 の 減 少,高. ら に 抗 イ ン ス リ ン受 容 体 抗 体 が イ ン ス リ ン 抵 抗. コ ン トロ‑ル. 績 に つ い て 詳 細 な 報 告 をお こ な っ た.. Nigricans,唾. は 抗 イ ン ス リ ン受 容 体 抗 体 と考 え ら れ る が,さ. High. Affinity‑Low. M‑1,. Low. Affinity‑High. ×10gM‑1, M‑1と. Plots解. Capacity. Average. Capacity. Affinity. 析 で は,. K1=0.417×109 K2=0.105. Ke=0.128×109. いず れ もコ ン トロ ー ル に 比 べ 低 値 を示. し た が,イ. ン ス リン 受 容 体 数 に は 有 意 の 差 は み. ら れ な か っ た.春. 日33ら も同 様 に 本 患 者 の 抗 イ. ン ス リ ン受 容 体 抗 体 に よ っ て ヒ ト脂 肪 細 胞 の イ ン ス リ ン受 容 体 のAffinity み られ た が,イ. Constantの. 低 下が. ン ス リン 受 容 体 数 の 変 化 は み ら. れ な か っ た と報 告 し て い る.こ ス リ ン 受 容 体 抗 体 は,イ. の事 実 は 抗 イ ン. ン ス リ ン受 容 体 そ の も. ン受 容体 抗体 価 の 経時 的推 移 と臨床 経過 は きわ. の に結 合す る とい うよ りはむ しろそ の近 傍 に結. め て よ く相 関 した.す. 合 す る と考 え ら れ,そ. な わ ち免疫 抑 制療 法 の 開. の た め イ ン ス リン とイ ン. 始 と と もに 抗 イ ン ス リ ン受 容 体 抗 体 価 の 低 下 が. ス リ ン 受 容 体 の 特 異 的 結 合 が 阻 害 さ れ,そ. の結. み ら れ,そ. 果 イ ン ス リ ン 作 用 の 発 現 が 阻害 さ れ て,著. しい. れ に伴 な い臨床 上 の諸 検 査 の改善 が. み ち れ た. Type. Bの 症 例 で の 治 療 経 過 と抗 イ. ンス リン受容 体 抗体 価 の変 動 の関 係 につ いて は Muggeo32)ら. の 観 察 が あ る が,彼. らの症 例 で は. 抗 イ ン ス リン 受 容 体 抗 体 価 は1975年 1:40で. 極期 の 時 は. あ り, 1977年 ス テ ロ イ ド治 療 前 は1:. 1で あ り, 1977年 ス テ ロ イ ド治 療 後 は0で た と述 べ て い る.さ. ら にScatchard. あっ. Plots解 析. に よ る と1975年 極 期 に は 単 球 の イ ン ス リ ン受 容 体 数 の 減 少 お よ びAffinity 低 下 が み られ, Affinity‑High. Constantの. Capacityの. の 増 加 が み ら れ た が,. イ ン ス リン 受 容 体 数. 1977年 ス テ ロ イ ド治 療 後. は 正 常 に な っ た と述 べ て い る.し Type. 著 しい. 1977年 ス テ ロ イ ド治 療 前 はLow. Bの 症 例 で,わ. か しなが ら. れ わ れ の症例 で観 察 した. イ ン ス リン 抵 抗 性 の 病 態 が 生 じ た も の と考 え ら れ る. ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン受 容 体 か らTriton. X‑. 100で イ ン ス リ ン 受 容 体 の 可 溶 化 を 試 み る と と も に,そ. の 可 溶 化 イ ン ス リ ン受 容 体 を 用 い て 抗. イ ン ス リン 抗 体 の 検 出 に つ い て 検 討 を お こ な っ た.ま. ず 可 溶 化 イ ン ス リン 受 容 体 へ の125I‑insu. linの 結 合 に 対 す るTriton と,孵. 置 液 のTriton. X‑100の. X‑100の. 濃 度 をみ る. 濃度 が 上昇 す る. に つ れ て 可 溶 化 イ ン ス リ ン受 容 体 へ の125I‑insu linの 結 合 は 低 下 し て い っ た.こ. れ はTriton. X‑. 100が 可 溶 化 イ ン ス リ ン受 容 体 部 位 を 機 械 的 に 覆 い 隠 し125I‑insulinと の 接 触 を 妨 げ る た め と考 え ら れ る.ヒ. ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン受 容 体 へ の 結.
(12) 90. 久 保. 合 が100%阻. 田. 害 さ れ る抗 イ ン ス リ ン受 容 体 抗 体. 価 を示 す 患 者 血 清 と可 溶 化 イ ン ス リン 受 容 体 と を孵 置 す る と,そ れ た.こ. の 特 異 的 結 合 は97.2%阻. 害 さ. の よ うに 可 溶 化 イ ン ス リ ン受 容 体 で も. 正. 幸. て い た. (4)ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン受 容 体 へ の125I‑insu linの 特 異 的 結 合 は, SLE,慢. 性 関 節 リ ウ マ チ,. 甲状 腺 機 能 亢 進 症, MCTD等. の 自己抗 体 を有. 抗 イ ン ス リン 受 容 体 抗 体 の 検 出 が 可 能 で あ る こ. す る患 者 の 血 清 お よ び 脂 肪 萎 縮 性 糖 尿 病, IDDM. とが 証 明 さ れ た. 一 方 本 患 者 血 清 中 の 抗 イ ン ス リ ン受 容 体 抗 体. で 不 安 定 型 糖 尿 病 の 患 者 の 血 清 の 影 響 を うけ な. が ヒ トの イ ン ス リン 受 容 体 に 対 す る抗 体 で,し. ACTH,. か もIgG分. TSH,. 画 の 抗 体 で あ る と す れ ば,可. ン ス リ ン 受 容 体 を用 い たRRAで,適 抗 ヒ トIgGを. 溶化 イ 当量 の羊. か っ た.ま. たGlucagon,. Cpeptide,. Cortisol, GABA, Testosteroneの. GH,. L‑DOPA,. TRH,. 各 種 ホ ル モ ンの影 響 を. う け な か っ た. つ い でType. Bイ. ンス リン 抵 抗 性 糖 尿 病 患 者. 加 え るImmunoprecipitation法. で. こ の 抗 体 の 検 出 が 可 能 で あ る と 考 え,筆. 者 は. の 血 清 中 の 抗 イ ン ス リ ン受 容 体 抗 体 に つ い て 検. Harrison24)の 方 法 に 準 じ て1975年2月28日. の100. 索 を お こ な い,以. 下 の(5)〜(8)の 結 論 を え た.. 倍 稀 釈 患 者 の 血 清20μl中 の 抗 イ ン ス リ ン 受 容 体. (5)血清 中 の 抗 イ ン ス リン 受 容 体 抗 体 に よ っ て. 抗 体 価 を 測 定 し た.そ の 結 果 は10倍 羊 抗 ヒ トIgG. 生 じ た イ ン ス リ ン抵 抗 性 糖 尿 病 の 患 者 の 血 清 中. 50μl,. の 抗 イ ン ス リ ン受 容 体 抗 体 価 の 経 時 的 推 移 は 臨. 100μl,. pitation法. 150μlを 加 え たImmunopreci. で 各 々0.16%,. っ た 。Harrison24)ら tation法. 1.58%,. 1.81%で. あ. に よ る とImmunoprecipi. 床 像 と よ く相 関 し,プ. レ ドニ ゾ ロ ン と サ イ ク ロ. フ ォ ス フ ァ マ イ ドの 免 疫 抑 制 療 法 に よ っ て,臨. は, 125I‑insulinと 種 々 の 細 胞 の イ ン ス. リ ン 受 容 体 と の 結 合 阻 害 を み る方 法 や 抗 イ ン ス リ ン 抗 体 の 急 性 イ ンス リン 用 効 果 を み る 方 法 等. 床 上 の 改 善 と と も に 抗 イ ン ス リン 受 容 体 抗 体 価 も低 下 し て い っ た. (6)抗イ ン ス リ ン受 容 体 抗 体 は,ヒ. トの 胎 盤 膜. よ り,一 層 鋭 敏 な 抗 イ ン ス リ ン受 容 体 抗 体 の 検. イ ン ス リン 受 容 体 のHigh. 出 法 で あ る と述 べ て い る.従 っ て 本 方 法 はType. cityお. Bの 症 例 の 診 断 に は 欠 く こ と の で き な い 検 出 法. ず れ のAffinity. で あ る と考 え られ る.. ン リ ン 受 容 体 数 に 有 意 の 変 化 を与 え な か っ た.. 結. ン. ス リン 受 容 体 へ の125I‑insulinの 特 異 的 結 合 に つ 下(1)〜(5)の 結 論 を え た .. (1)ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン 受 容 体 へ の125I‑insu 置 液 の 温 度, pH,蛋. 白. ら解 析 す る と,ヒ. ト胎. 濃 度 に 影 響 さ れ た. (2)Scatchard. Plotsか. Constantも. 容 体 の 近 傍 に 結 合 し,イ ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン受 容 体 を 用 い て,イ. linの 特 異 的 結 合 は,孵. Affinity‑High. ン ス リン 受 容 体 へ の イ. ン ス リ ン の 結 合 を 阻 害 し,著. し い イ ン ス リ ン抵. 抗 性 の 病 態 を 発 現 さ せ る もの と推 論 さ れ た. (7)ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス リ ン受 容 体 か ら イ ン ス リ ン受 容 体 をTriton. X‑100で. 可 溶 化 し,可. イ ン ス リン 受 容 体 を 用 い たRRAのPEG法. イ ン ス リン 受 容 体 抗 体 の 検 出 は 可 能 で た え ら れ た 結 合 阻 害 率 は ヒ ト胎 盤 膜 イ. nity Constant,す. な わ ちHigh. Affinity‑Low. と一 致 し て い た.. Affinity‑High. Capacityの. 容 体 が 存 在 し,各. 々 のAffinity. K1=1.140×109M‑1, Average. Affinity. Constantは,. (8)羊抗 ヒ トIgGに. え られ た結果. よ るImmunoprecipitation. 法 で も抗 イ ン ス リン 受 容 体 抗 体 の 検 出 は 可 能 で. K2=0.257×109M‑1で, Ke=0.295×109M‑1で. によ. っ て,抗. ン ス リ ン受 容 体 を用 い たRRAで. 受. 溶化. あ り,ま. の 異 な っ たAffi. Low. い. 低 下 さ せ た が,イ. 盤 膜 イ ン ス リ ン受 容 体 に は2種. Capacity,. Capa. Capacityの. 従 っ て 抗 イ ン ス リ ン 受 容 体 抗 体 は イ ン ス リ ン受 語. い て 検 索 を お こ な い,以. よ びLow. Affinity‑Low. あ っ た.本 あっ. 法 はType. Bの 症 例 の 検 索 に は 欠 く. こ と の で き な い 検 出 法 で あ る と思 わ れ る.. た. (3)Dissociation. Studyよ. リ ン受 容 体 はNegative. り ヒ ト胎 盤 膜 イ ン ス. Cooperativityを. 右 し. 謝. 辞. 稿 を終 る に あ た り直接 御 指 導 を い た だ い た 香 川医.
(13) イ ン ス リ ン受 容 体 に 関 す る研 究. 91. 科 大 学 河 西 浩 一 助 教 授 に 感 謝 し,本 研 究 の御 指 導,. 金(研 究 課 題 番 号267110,研. 究 課 題 名抗 イ ン ス リン. 御 校 閲 を うけ た岡 山大 学 第3内 科 大 藤 眞教 授 に深 甚. 受 容 体 抗 体 に 関 す る研 究)の 助 成 に よ りお こ な わ れ. な る感 謝 の 意 を表 す.. た.. 本 研 究 の 一 部 は 昭 和52年 度 文部 省科 学 研 究 費 補 助. 文 1. Yallow, R. S. and Berson, S. A.: 39, 1157-117, 2.. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. J. Clin. Invest.,. 1960.. Kreisberg, R. A. Boshell, B. R, Diplacido, J. and Roy, F. R.: Insulin secretion in obesity. N. Engl. J. Med. 276, 314-319,. 1967.. 3. Freychet, P., Roth, J. and Neville, D.M.Jr.: sulin to the plasma membranne 1833-1837, 4.. 献. Insulin receptors in the liver:. and its relation to insulin bioactivity.. Cuatrecasas, P., Desbuquois, B. and Krug, F.:. Insulin-receptor interactions. Biochem. Biophys. Res. Commun. 44, 333-339,. 1971.. liver membranes.. J. Biol. Chem. 249, 2249-2257,. Suzuki, K., Ohsawa, N. and Kosaka, K.: 42, 399-402,. in liver cell membranes.. aspects of the insulin receptor. interaction in. 1974.. Radioreceptor. assay for insulin.. J. Clin. Endocrinol. Metab.. 1976.. 7.. Posner, B. I.:. 8.. Haour, F. and Bertrand, J.:. Insulin receptors in human and animal placental tissue.. of human placenta.. 1974. J. Clin.. 1974.. Harrison, L.C., Billington, T., East, I. J., Nichols, R. J. and the properties. Diabetes. 23, 209-217,. Insulin receptors in the plasma membranes. Endocrinol. Metab. 38, 334-337, 9.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 68,. 1971.. 5. Kahn, C.R., Freychet, P. and Roth, J.: Quantitative. 6.. Specific binding of 125I-in. of the insulin receptor oihuman. Clark, S.:. The effect of solubilization on. placental membranes.. Endocrinology. 102, 1485-1495,. 1978. 10. Olefsky, J. M., Bacon, V.C. and Baur, S.: Insulin receptors of skeletal muscle: sites and demonstration. Specific insulin binding. of decreased numbers of sites in obese rats. Metabolism. 25, 179-191,. 1976.. 11. Olefsky, J. M. and Reaven, G. M.: Effects of age and obesity in 125I-insulin binding to isolated adipocy tes.. Endocrinology.. 96, 1486-1489,. 1975.. 12. Anderson, O. Gliemann, J. and Gammeltoft, S.: human adipocyte.. Diabetologia. 13, 589-593,. 13. Olefsky, J. M., and Helen Chang: receptors.. Receptor binding and biological effect of insulin in 1975.. Insulin binding to adipocytes. Evidence for for functionaly district. Diabetologia. 27, 946-958,. 1978.. 14. Bar, R. S., Gorden, P., Roth, J., Kahn, C.R. and Meyts, P. D.:. Fluctuations. tign of insulin receptors on circulating monocytes of obese patients.. in the affinity and concentr. J. Clin. Invest. 58, 1123-1135,. 1976. 15. Nielsen, H. B., Pedersen, O., Kragballe, K. and Sorensen,N. S.: The monocyte as a model for the study of insulin receptors in man.. Diabetolgia. 13, 563-569,. 1977.. 16. Gavin, J., Gorden, P., Roth, J., Archer, J. A. and Buell, D.N.: insulin receptor.. J. Biol. Chem. 248, 2202-2207,. 17. Pollet, R. J., Standaert, M. L. and Haase, B.A.: J. Biol. Chem. 252, 5828-5834,. 1977.. Characteristics. of the human lymphocyte. 1973.. Insulin binding to the human lymphocyte receptor..
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(15) イ ン ス リン 受 容 体 に 関 す る 研 究. Studies. on. insulin. receptor. Part Studies. on. radioreceptorassay. particulate. and in. a. 1. using. determination. patient. human. of. with. Department. of. extremely. Internal. Specific. studies. Specific by. labelled. were. binding. temperature. insulin. of. particulate. of. and. of. autoantibodies diabetes. Okayama Prof.. binding. T.. to. University. Medical. School. Ofuji). insulin. receptors. on. human. placental. crude. out.. 125I-insulin. pH. receptor. membrane. KUBOTA. Medicine,. insulin. carried. crude. insulin-resistant. (Director:. membrane. placental. anti-insulin. Masayuki Third. 93. to. the. human. incubation. placental. buffer. membrane. and. by. the. particulate. protein. was. affected. concentrations. of. the. receptor. Scatchard. stants,. high. (K2).. The. average. analysis. showed. affinity-low K1. and. K2. affinity. (Ke). Dissociation. of. that. capacity values. was. human. placental. component were. insulin. (K1). and. 1.410•~109M-1. receptor. low. and. has. affinity-high. two. affinity. capacity. 0.257•~109. M-1,. con. component. respectively.. The. 0.259•~109M-1. labelled. insulin. from. the. placental. insulin. receptor. demonstrated. negative. cooperativity. Specific sera. of. binding. patients. rheumatic. with. to. lipoatrophic. and. RRA. change. of. dependant. glucagon,. as. connective. insulin. was. systemic tissue. unstable. to. the. C-peptide,. type. clinical change. not. affected. lupus. disease,. by. the. erythematosus, or. by. the. sera. of. diabetes.. placental GH,. IgG resistant. features of. ACTH,. insulin. and. receptors.. by. insulin. receptor. cortisol,. GABA,. resistant. PEG. and. was. not. L-DOPA,. diabetes. were. measured. immunoprecipitation. affinity finding. binding. using. condition.. solubilized. insulin. to. be. using. indispensable. to. receptor solubilized. detection. of. anti. diabetes. patient. with. anti-receptor. type. resulted. constant. insulin. B insulin. antibodies.. antibodies.. suggests of. using. Immunoprecipitation. is thought. the. of. method RRA.. cyclophosphamide. the This. inhibit. of. titers. by. anti-receptor. decreased. insulin-resistant. with. glycol rate. B insulin. of. and. a patient. particulate. anti-human. and. of. in. polyethylene. prednisolone. antibodies. extremely. insulin. inhibition. disappearance. receptor. receptor. by the. goat in. in. and. numbers. mixed. receptor. such. receptor.. rate with. with. diabetes. insulin. insulin. and. closely. consisting. the. membrane. antibodies. The related. insulin. diseases,. labelled as. antibodies. well. receptor. receptor. such. receptor. inhibition. corresponded insulin. and of. placental. placental. The. placental. testosterone.. using. solubilized. binding. hormones. Anti-insulin by. the. and. diabetes. the. various. TSH,. to. auto-immune. hyperthyroidism,. Furthermore related. 125I-insulin various. arthritis,. patients. TRH,. of. with. that to. in Scatchard. of. the. insulin. anti-receptor the. resistant. diabetes. Immunosuppressive. insulin. complete analysis receptor, antibodies receptor,. cor therapy. remission. of. showed but. did bind. thereby. clinical. that not to. anti affect. near. causing. the an.
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