固相抽出 ビギナー ズ ガイ ド 日本ウォーターズ株式会社 日本ウォーターズ株式会社 東京本社 東京都品川区北品川 第 5 小池ビル TEL FAX 大阪支社 大阪市淀

　

　

　

　

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日本ウォーターズ株式会社 _{www.waters.com}

Beginner’s Guide

to SPE

Solid-Phase Extraction

Joseph C. Arsenault

Copyright © 2012 Waters Corporation

All rights reserved. No part of this book may be reproduced or transmitted in any form by any means, electronic or mechanical, including photocopying, recording, or by any other information storage and retrieval system, without permission from the Publisher.

Waters Corporation 34 Maple Street Milford, MA 01757

Library of Congress Control Number: 2012944477 Printed in the USA

©2012 Waters Corporation. Waters, Sep-Pak, Oasis, UPLC, Nova-Pak, PoraPak, ACQUITY UPLC, ACQUITY, Atlantis, Xevo, and Alliance are registered trademarks of Waters Corporation. XPoSure, DisQuE, AccQ•Tag, Quattro micro GC, and SunFire are trademarks of Waters Corporation. Luer is a registered trademark of Becton Dickinson. Teflon is a registered trademark of E. I. du Pont de Nemours and Company. Kool-Aid is a registered trademark of Kraft Foods Global Brands, LLC. Rxni is a registered

trademark of Rxi Pharmaceuticals Corporation. October 2012 715003405 VW-FP

はじめに

ようこそ

皆様に固相抽出（SPE）へのご興味を持っていただいたことをとても嬉しく思います。 私たちは皆様のラボにおけるサンプル前処理の課題を解決するためにSPEをどのように活用するかをご紹介したく 本書を作成いたしました。分析機器の進歩、特に感度の向上と高速化により、サンプル前処理方法に対する要望 はますます高まっています。 SPEはある意味、「アラジンと魔法のランプ」に登場する「魔神」のようなものです。ひとたびその使い方がわかれば、 驚くほど様々な分析上の課題を解決する際に役に立ちます。魔神と同じくSPEはツールです。したがって、その 力を左右するのは「ご主人様」である分析科学者の創造性なのです。 本書では、SPEの基本の全てと、過去30年間にこのテクノロジーに携わった世界中の科学者から得られた成功の テクニックをご紹介します。今日、科学者は難しいサンプル前処理や分析上の課題を克服するための手法として、 SPEが役立つ手法であることをこれまで以上に見出しています。本書を通してSPEが持つ能力を理解しマスター することにより、このテクノロジーの持つ力をラボで活用できるようになることを願っています。 ご成功をお祈りいたします。

献辞

簡単ではありますが、私から心よりの献辞を捧げたいと思います。

はじめに、Sep-Pak® _{カートリッジとOasis}® _{ファミリーの開発を通じて、34年以上SPEの世界の先駆者であり}

続けているウォーターズコーポレーションのDr. Patrick McDonaldに本書を捧げます。極めて優秀な科学者である Dr. McDonaldは、SPEテクノロジーなど革新的なクロマトグラフィー製品の開発に携わり、常に自身の優れた知識 や洞察力で世界中の分析科学者が直面している課題の克服に尽力してきました。

次にDr. Uwe Neueに本書を捧げます。クロマトグラフィー界の第一人者の1人であるDr. Neueは2010年に亡く なられましたが、液体クロマトグラフィーの世界の解明と革新に語り尽くせないほどの遺産を遺しました。 私がクロマトグラフィーを学び活用することで成功することができたのは、その知識を惜しみなく授け、助けて くださったこのお二人によるところが大です。

最後に、私とともに液体クロマトグラフィーに寄り添ってくれた素晴らしい家族、妻のAnn Marie、娘のChristine、 息子のJosephに本書を捧げたいと思います。私が科学を追究し、同僚や顧客の皆様が今日の生活をよりよくする 方法を見つけられるよう支援し、そして次世代のためによりよい世界をつくれるよう、私を励まし支えてくれました。

謝辞

本書を執筆するにあたり、素晴らしいアイデアとサポートを提供してくれたDr. Diane DiehlとDr. Mark Baynham に感謝いたします。

Kathy Coffey、Jessalynn Wheaton、John Martin、Dr. Nebila Idris、Damian Morrison、Erin Chambers、Dr. Michael S. Young、 Dr. James Teuscher、Dr. Ben Yong、Xin Zhang、Nicole Cotta、そしてGary Manthaは、惜しみない協力と貴重なコメ ントをくれました。ありがとう。

そして最後に、ウォーターズの化学製品マーケティングコミュニケーションチーム、特に本書の制作で献身的に働い てくれたNatalie Crosier、Vicki Walton、およびIan Hanslopeに、心より感謝したいと思います。

［

目次

］

目次

はじめに

_{... 3}

献辞および謝辞

_{... 4}

サンプル前処理における固相抽出の利点

_{... 17}

固相抽出の定義 ... 18 SPEの4つの主要な恩恵 ... 19 1. 複雑なサンプルマトリックスの単純化 ... 19 2. MSアプリケーションにおけるイオンサプレッションとエンハンスメントの低減 ... 22 3. サンプルマトリックスから分析種を属性の違いにより分画する能力 ... 23 4. 微量成分の濃縮 ... 25

SPE

は

_LC

です

_{... 27}

極性に基づく分離 ... 29 極性に基づくメソッドの設計 ... 30 移動相 ... 30 固定相 ... 31 分析種の性質 ... 31 順相SPE ... 32 逆相SPE ... 33 コンディショニングと平衡化ステップの重要性 ... 35 撥水現象と乾燥がSPEにもたらす影響 ... 39 逆相SPEの保持曲線 ... 41 pHの影響 ... 43 電荷に基づく分離：イオン交換クロマトグラフィー（I EC） ... 44 解離状態 ... 44 SPE用イオン交換充塡剤の選択 ... 48 強陽イオン交換-逆相ミックスモード充塡剤 ... 48 強陰イオン交換-逆相ミックスモード充塡剤 ... 49 弱陽イオン交換-逆相ミックスモード充塡剤 ... 50

［

目次

］

弱陰イオン交換-逆相ミックスモード充塡剤 ... 51 4種類のイオン交換-逆相ミックスモード充塡剤を用いたSPEメソッド開発を簡素化する強力なストラテジー ... 51 専用固相 ... 55 大気中のホルムアルデヒドその他のアルデヒドおよびケトン分析用Sep-Pak DNPH -シリカカートリッジ .... 55 オゾンスクラバーカートリッジ ... 57 ポータブルポンプを使った、室内大気中のアルデヒド測定用 Waters XPoSureアルデヒドサンプラーカートリッジ ... 58 地表および地下水中の爆発性物質分析用PoraPak Rdx Sep-Pakカートリッジ ... 59 Sep-Pak Dryカートリッジ ... 60

主要な用語と計算

... 61

ホールドアップボリュームの測定 ... 63 流速と線速度 ... 64 線速度とは ... 64 流速コントロールの重要性 ... 65 スケーリングと線速度 ... 66 回収率計算 ... 69 SPE製品あるいはプロトコルの調整 ... 70 マトリックス効果の計算 ... 72

ラボで

_{... 77}

固相抽出製品の形状 ... 78 シリンジ形状 ... 79 シリンジバレル型 ... 79 Vac RC型 ... 80 96ウェルプレート ... 81 µElution 96ウェルプレート ... 82 クローズ設計のカートリッジ ... 83 Classicカートリッジ ... 83 Plusカートリッジ ... 84 Lightカートリッジ ... 84

［

目次

］

オンライン処理 ... 85 分散型SPE ... 87 基本的なセッティング‐送液方法 ... 90 重力による自然落下 ... 90 加圧とポンプ圧 ... 92 減圧 ... 95 サンプルと溶媒のロード ...97 ルアー型カートリッジで減圧を利用する方法 ...99 96ウェルプレートで減圧を利用する方法 ... 100 SPEメソッドのステップ ...101 オリジナルサンプルの調製 ...101 SPEカートリッジの準備 ...102 SPEカートリッジのコンディショニング ...102 SPEカートリッジの平衡化 ...104 サンプルロード ...106 分析妨害成分の洗浄 ...108 分析種の脱離 ...109 溶媒乾固と移動相への再溶解 ...110

メソッド開発

_{... 113}

SPEメソッドの開発 ...114 サンプル/分析種の属性 ...115 サンプルマトリックスの調製 ...115 様々な問題解決のためのSPEストラテジー ...116 ストラテジー1：パススルー ...116 1. サンプル容量がホールドアップボリュームより多い場合 ... 117 2. サンプル容量がホールドアップボリュームより少ない場合 ... 119 ストラテジー2：分析種のキャプチャー（捕捉） ...122 ストラテジー3：分析種のキャプチャー（捕捉）と分画 ...125 ストラテジー4：分析種のキャプチャー（捕捉）と濃縮 ...131 微量成分の濃縮メソッド ...131 濃度の算出 ...137 クロマトグラフィーモードの選択 ...138 適切な製品サイズの選択 ...139

［

目次

］

メソッド開発におけるマスバランスとトラブルシューティング ...139 ストラテジーの選択 ...144 ストラテジー1：パススルー ... 144 ストラテジー2：キャプチャー（捕捉） ...147 ストラテジー3：キャプチャー（捕捉）および分画 ...150 ストラテジー4：キャプチャー（捕捉）および微量成分濃縮 ...151 ロードキャパシティ/ブレークスルー ...154 クロマトグラフィー条件設定の重要性 ...155 ブレークスルーの実験 ...156 メソッドスケーリング：サンプル容量と充塡剤量 ...162

トラブルシューティング

_...165

一般的なサンプル前処理に関する問題の原因 ...168 温度コントロール ...168 流速コントロール ...168 pHコントロール ...168 サンプルの調製と抽出 ...171 サンプルマトリックス ...172 バイアルの状態 ...172 サンプル溶解溶媒 ...172

付録：

_{SPE & LC}

用語集

_{... 173}

付録：

_SPE

のための

_Oasis

充塡剤テクノロジー

_{... 191}

はじめに ...192 Oasisケミストリーの広範な選択肢 ...193 高く安定した回収率 ...194 Oasis HLBとC18固相の乾燥が回収率に及ぼす影響比較 ...195 少ない充塡剤で高いキャパシティ ...196 極めて優れたバッチ間の再現性 ...196 一般的なSPEメソッドの充塡剤量および溶媒の選択 ...197 簡易メソッド開発プロトコル ...198

［

目次

］

付録：アプリケーション

_...201

魚介類中のPAH定量 ...202

乳児用粉ミルク中のMelamineおよびCyanuric Acid分析 ...203

ミルク中の残留動物用医薬品の多成分分析 ...204 脳脊髄液中のAmyloid βペプチド ...204 ポリエチレングリコール400（PEG 400）の血漿からの除去 ...205 血漿および血清タンパク質消化物 ...205 河川水中の内分泌かく乱物質 ...206 土壌中の有機塩素系農薬およびPCB ...206

付録：参考文献リスト

_...207

図一覧

図1：SPEメソッドの例 ...19 図2：複雑なサンプルの例 ... 20 図3：サンプルマトリックスの複雑さの比較 ... 20 図4：より適切なサンプル前処理による定量の正確性の向上 ...21 図5：SPEテクノロジーにより大幅に改善したベースライン ...21 図6：サンプルマトリックスの影響によるイオンサプレッションの例 ... 22 図7：適切なSPE前処理で軽減されたイオンサプレッション ... 23 図8：SPEによるサンプル前処理 ... 24 図9：微量成分の分析例 ... 25 図10：SPEの力 ... 26 図11：極性範囲 ... 29 図12：移動相と固定相の適切な組み合わせが極性に基づく分離を実現 ... 30 図13：移動相のクロマトグラフィー極性範囲 ... 30 図14：固定相のクロマトグラフィー極性範囲 ...31 図15：化合物/分析種のクロマトグラフィー極性範囲 ...31 図16：順相クロマトグラフィー ... 32 図17：逆相クロマトグラフィー、SPEとLC ... 33 図18：逆相SPE ... 34 図19：高極性表面と高極性の液体 ... 35 図20：非極性表面と高極性の液体 ... 36 図21：細孔が湿潤した状態の逆相充塡剤 ...37 図22：細孔の撥水現象（De-Wetting） ... 38 図23：撥水された細孔により分析種の保持に障害が出ている例 ... 38 図24：コンディショニングと平衡化のステップ ... 39 図25：細孔の撥水現象がもたらす回収率の低下 ... 40 図26：Oasis HLB充塡剤の純粋な逆相保持曲線 ... 42 図27：イオン交換クロマトグラフィー ... 44

［

図一覧

］

図28：分析種の解離状態とpHの関係 ... 45 図29：イオン交換-逆相ミックスモード充塡剤のOasisファミリー（RP＝逆相） ... 45 図30：Oasis MCXの弱塩基性化合物保持曲線 ... 48 図31：Oasis MAXの弱酸性化合物保持曲線 ... 49 図32：Oasis WCXの強塩基性化合物保持曲線 ... 50 図33：Oasis WAXの強酸性化合物保持曲線 ...51 図34：Oasis 2×4メソッド開発ストラテジー ... 52 図35：分析種の荷電状態とpHの関係 ... 52 図36：Oasis MCXによる弱塩基性化合物の捕捉 ... 53 図37：Oasis WAXによる強酸性化合物の捕捉 ... 53 図38：Oasis MAXによる弱酸性化合物の捕捉 ... 54 図39：Oasis WCXによる強塩基性化合物の捕捉 ... 54 図40：Oasis MCXによる両性イオン性化合物の捕捉 ... 55 図41：Sep-Pak DNPHカートリッジ―ショートボディーとロングボディー ... 56 図42：代表的なアルデヒドおよびケトン類DNPH誘導体のHPLC分離（DNPH） ... 56 図43：実験室大気中の低濃度アルデヒド類の分析 ...57 図44：自動車の排出ガス中の高濃度アルデヒド類の分析 ...57 図45：オゾンスクラバーカートリッジ ... 58 図46：大気サンプリングシステムのフロー図 ... 58 図47：Waters XPoSureアルデヒドサンプラー ... 58 図48：XPoSureアルデヒドサンプラーを使った実験室大気中の低濃度アルデヒド分析 ... 59 図49：PoraPak Rdxカートリッジ ... 59 図50：E PAメソッド8330分析種のアイソクラティック分離（PoraPak Rdx） ... 60 図51：Sep-Pak Dryカートリッジ ... 60 図52：SPE製品のホールドアップボリューム ... 62 図53：空隙容積の身近な例 ... 63 図54：流速コントロールが必要なロード、洗浄、脱離のステップ ... 65 図55：流速をコントロールする重要性‐ロードステップ ... 66 図56：SPE製品の小径から大径へのスケーリング ...67

［

図一覧

］

図57：SPE製品の大径から小径へのスケーリング ... 68 図58：回収率の確認 ... 69 図59：より正確な回収率の確認 ... 70 図60：回収率の計算 ...71 図61：マトリックス効果の測定方法 ... 73 図62：第1の状況（マトリックス効果なし） ...74 図63：第2の状況（著しいイオンサプレッション） ... 75 図64：第3の状況（イオンエンハンスメント） ... 76 図65：SPE製品のラインアップ ... 78 図66：シリンジバレル型カートリッジ ... 80 図67：拡張リザーバーバレル型Vac RC ... 80 図68：96ウェルプレート ...81 図69：96ウェルプレートのOasis充塡ベッド構成 ...81 図70：96ウェルプレートのシリカベースの充塡ベッド構成 ... 82

図71：Waters Oasis µElutionプレート ... 82

図72：特許取得済µElutionプレート先端のデザイン ... 83 図73：Classicカートリッジ ... 83 図74：Plusカートリッジ ... 84 図75：Lightカートリッジ ... 84 図76：オンラインSPE 製品 ... 85 図77：オンラインSPEシステムのロード・脱離ステップの流路図 ... 86 図78：2本のSPE カラムを使った複雑なオンラインSPEシステム ...87 図79：QuEChERS法分散型サンプル前処理製品DisQuE ...87 図80：DisQuEチューブ1のプロトコル（QuEChERS法） ... 88 図81：DisQuEチューブ2のプロトコル（QuEChERS法） ... 89 図82：重力を送液力として利用 ... 90 図83：重力を送液力として利用 ...91 図84：遠心力を利用 ...91 図85：シリンジ/プランジャーを利用した加圧式の送液力 ... 92

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図一覧

］

図86：適切な流速コントロール‐液滴 ... 92 図87：流速コントロールの重要性 ... 93 図88：加圧のためのシリンジ接続 ... 93 図89：ポンプとクローズ設計のカートリッジの接続 ... 94 図90：96ウェルプレート用加圧送液プロセッサー ... 94 図91：ガラス製のバキュームマニホールド ... 95 図92：ガラス製バキュームマニホールドの接続例 ... 96 図93：シリンジ型カートリッジへの溶液のロード ...97 図94：リザーバーの接続 ... 98 図95：大容量サンプルのロード ... 98 図96：ルアー型S P E製品 ... 99 図97：クローズ設計のS P E 製品への溶液のロード ... 99 図98：マニホールドに取り付けた96ウェルプレート ...100 図99：適度な湿潤が必要な充塡剤の細孔 ... 103 図100：有機溶媒を使った逆相充塡剤細孔のコンディショニング ...104 図101：水またはサンプル溶解溶媒を使った細孔の平衡化 ... 105 図102：ロードステップでの化合物の捕捉には細孔の適切な湿潤が必要不可欠 ...106 図103：サンプルロード ... 107 図104：分析妨害成分の洗浄 ...108 図105：分析種の溶出 ...109 図106：溶媒乾固と移動相への再溶解 ...110 図107：乾固と再溶解のステップが必要な理由 ... 111 図108：ストラテジー1：パススルー ... 117 図109：サンプル容量がホールドアップボリュームより多い場合のパススルーストラテジー ...118 図110：サンプル容量がホールドアップボリュームより多い場合のパススルーストラテジー ...119 図111：サンプル容量がホールドアップボリュームより少ない場合のパススルーストラテジー ... 120 図112: サンプル容量がホールドアップボリュームより少ない場合のパススルーストラテジー ...121 図113：キャプチャー（捕捉）ストラテジー‐ロードステップ ... 122 図114：キャプチャー（捕捉）ストラテジー‐洗浄ステップ ... 123

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図一覧

］

図115：キャプチャー（捕捉）ストラテジー‐脱離ステップ（第2のケース） ... 124 図116：キャプチャー（捕捉）および分画ストラテジー ... 125 図117：キャプチャー（捕捉）および分画ストラテジー‐ロードステップ ... 126 図118：キャプチャー（捕捉）および分画ストラテジー‐脱離1 ... 127 図119：キャプチャー（捕捉）および分画ストラテジー‐脱離2 ... 128 図120：キャプチャー（捕捉）および分画ストラテジー‐脱離3 ... 129 図121：キャプチャー（捕捉）および分画ストラテジー‐脱離4 ... 130 図122：SPEを使った微量成分濃縮‐ストラテジー4 ... 132 図123：微量成分濃縮ストラテジー‐サンプルを追加してロード ... 133 図124：微量成分濃縮ストラテジー‐脱離ステップ ...134 図125：微量成分濃縮ストラテジー‐逆方向の脱離ステップ（シリンジ） ... 135 図126：微量成分濃縮ストラテジー‐逆方向の脱離ステップ（Plus） ... 136 図127：マスバランス‐k値の影響 ...140 図128：マスバランス‐k値の変更 ... 141 図129：マスバランス‐サンプル容量の変更 ... 142 図130：強溶離溶媒の利点 ... 143 図131：マスバランス‐パススルー‐完全な脱離ステップ ... 145 図132：マスバランス‐パススルー‐不完全な脱離ステップ ...146 図133：マスバランス‐キャプチャー（捕捉） ... 147 図134：マスバランス‐捕捉‐完全な脱離ステップ ... 149 図135：マスバランス‐捕捉および分画 ... 150 図136：マスバランス‐微量成分濃縮 ... 152 図137：脱離ステップにおける逆方向の送液方法 ... 154 図138：ブレークスルーの検討‐ロード ... 156 図139：ブレークスルーの検討‐回収率とロード容量 ... 157 図140：回収率とロード容量 ...160 図141：ロードステップ ...161 図142：純粋な逆相充塡剤の保持マップ ...168 図143：シリカベースのSPE充塡剤におけるpHの影響 ... 169

［

図一覧

］

図145：充塡剤の解離状態 . ... 170 図146：シリカベースの充塡剤使用時における、不適切なpHコントロールによる塩基性化合物の回収率の低下 ....171 図147：理論段数（N）の計算方法 ...177 図148：逆相条件下の溶離力 ... 179 図149：高圧グラジエントシステム ...180 図150：低圧グラジエントシステム ... 181 図151：ホールドアップボリューム‐SPEカートリッジ ... 182 図152：理論段数（N）の計算方法 ...186 図153：独自の水湿潤性Oasis HLBポリマー ... 193 図154：Oasis充塡剤 ...194 図155：Oasis HLB：充塡剤の乾燥の影響は見られず ...195 図156：ブレークスルーのない高キャパシティを実現する高い保持性能 ... 196 図157：Oasis HLBのバッチ間再現性 ... 196 図158：Oasis 2×4メソッド ...198

図159：Oasis96ウェルメソッド開発プレート：CephalexinのOasis 2×4メソッド評価 ...199

表一覧

表1：順相/逆相クロマトグラフィーの比較 ... 34 表2：保持時間 ... 43 表3：イオン交換ガイドライン ... 46 表4：イオン交換‐逆相ミックスモードOasisファミリー ... 48 表5：流速コントロールの必要なステップ ... 65 表6：カートリッジのIDと線速度の関係 ...67 表7：マトリックス効果の状況 ... 73 表8：コンディショニングおよび平衡化のステップの必要性 ... 102 表9：クロマトグラフィーモードと充塡剤の選択 ...138 表10：スケーリング情報 ... 163 表11：新しい条件へのスケーリング ... 163 表12：スケーリング情報 ... 163 表13：新しい条件へのスケーリング ...164 表14：メソッド開発プロセス時の問題 ... 166 表15：既存のメソッド実施時の問題 ... 167 表16：Oasis 96ウェルプレートおよびカートリッジのキャパシティと溶出容量 ... 197 表17：一般的なSPEメソッドの脱離溶媒選択ガイド（1-D）†_{溶離溶媒は分析種の極性に基づいて選択 ... 197}

［

表一覧

］

サンプル前処理における

固相抽出の利点

［

固相抽出の定義

］

よりよいサンプル前処理のための強力な手法

分析科学者は、求める結果を得るための最適な手法を決定するにあたり、多くの課題に直面します。サンプル前 処理手法やアプローチの選択は、分析の成否を左右する可能性のある重要な問題です。 もちろん、一切サンプル前処理が不要ならば、それに越したことはありません。しかし実際には、ほとんどの場 合においてサンプル前処理が必要です。既存のサンプルに対してスループットを向上させる、または分析あたり のコストを下げるためにメソッドを改善しなければならないこともあるでしょう。あるいは、種類の異なる様々 なサンプル中の、新規の分析種について分析、報告するよう求められることもあるかもしれません。新たな種類 のサンプルには、新しい分析課題が存在する可能性があります。さらに、科学者は今日、かつてないほど低濃度 の値を正確性と精度を損なうことなく報告しなければならないという重大な課題に直面しています。 本書は、サンプル前処理技術の非常に強力な手法である固相抽出（SPE）について、幅広い知識を得て理解を深め られるよう構成されています。クロマトグラフィー用パーティクルを充塡した製品を使用するこのテクノロジーが 皆さんの抱えている分析課題の解決にどのように役立つかを見ていきます。

固相抽出の定義

SPEは、固体粒子、通常はクロマトグラフィー用パーティクルをカートリッジに充塡して使用し、サンプル中の 異なる成分を化学的特性により分離するサンプル前処理技術です。一部、気体中に含まれるサンプルを処理する 特殊なアプリケーションもありますが、サンプルはほとんどの場合、液体の状態です。図1は、黒色で示した サンプルがSPEカートリッジを移動していき、クロマトグラフィーの原理に基づいてサンプルを構成している 個々の色素成分に分離されていく様子を表しています。

［

SPE

の

4

つの主要な恩恵

］

ロードサンプル （黒色） ステップ脱離 1 ステップ脱離 2 1 本のカートリッジで 3 種類の色素すべてを分画可能 脱離 ステップ 3 注：色素を分画する ために脱離力の 異なる溶媒を使用 固定相 図1. S PEメソッドの例 クロマトグラフィー充塡剤を用いてサンプル中の異なる成分を分離し、その後の分析試験の精度をより高めること ができます。例えばSPEは、分析の妨害成分の選択的な除去によく使われます。 SPEは、クロマトグラフィーの充塡剤は固体であり、サンプルは液体の状態であるため、技術的には「液-固相抽出」 と呼ぶのが正しい名称ということになります。HPLCに使用されている液体クロマトグラフィーと同じ基本原理が SPEに適用されていますが、形状と使用目的が異なり、分析試験の前にサンプルをより分析しやすい状態にする ために用いられます。 サンプル前処理では、血漿や唾液、尿など生体試料、水や空気、あるいは土などの環境サンプル、穀物、肉、魚介類といっ た食品や、医薬品、栄養補助食品、飲料、工業製品など幅広い種類のサンプルを取り扱います。蚊の頭部をサンプル として扱うこともあります。蚊の脳から抽出した神経ペプチドの分析に用いられたサンプル前処理手法が、SPEでした。 （Waters Applications Database, 1983）

SPE

の

₄

つの主要な恩恵

SPEによって得られる多くの恩恵の中から、特に有用な4つを紹介します。

1.

複雑なサンプルマトリックスの単純化

分析化学者にとって最も難しい問題の1つに、分析種が複雑なサンプルマトリックス中に含まれている問題が あります。例えば、穀物中に含まれるマイコトキシンや、エビ中に含まれる抗生物質、あるいは血漿、血清、尿中 の薬物代謝物などを分析する場合です。サンプルマトリックス中には、分析種のほかに多くの分析を妨害する 分析妨害成分が含まれており、分析を著しく困難にします。

［

SPE

の

4

つの主要な恩恵

］

まず解決しなければならない問題点は、分析種を定性、定量するために、多くの成分が含まれる複雑なサンプル 成分を分離することです（図2を参照してください）。 AU 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 分 このサンプルのクロマトグラムには多くのピークが検出されていますが、その大半は分析種のピークではありません 図2. 複雑なサンプルの例 複雑なサンプルは、わずかな変化でも分離の難しい分析種の分離に影響を及ぼす可能性があるため、正確な分析 が難しい場合があります。 もう1つ考慮しなければならないのは、分析サンプル中に存在する分析妨害成分です。このような成分が多量に 存在すると、ロードのたびに装置が汚染され、試験を中断しなければならなくなる可能性があります。この分析 妨害成分をサンプル前処理の段階で除去しておけば、分析種をより簡単にかつ確実に分析できるようになります。 図3の上図に元の分析サンプル、下図にSPEで前処理を行ったサンプルのクロマトグラムを示し、比較しました。 AU 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 AU 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 分 いくつかの成分は、MSまたは カラムに問題を起こし、ダウンタイムを 増加させる可能性がある 必要な ピークだけ を分析 図3. サンプルマトリックスの複雑さの比較

［

SPE

の

4

つの主要な恩恵

］

サンプルマトリックスを単純化するもう1つの恩恵は、定量の正確性が向上することです。図4で分析種1を示す 青線のピークは、一見問題のないように見えますが、赤で示したブランクサンプルと比較すると、サンプルマトリッ クス由来のコンタミネーションの影響を受けていることがわかります。適切なSPE前処理を行ったクロマトグラム を下に示します。妨害成分の影響を受けず、化合物1の定量の正確性が向上しています。 ブランクサンプルマトリックス スパイクサンプル ブランクサンプルマトリックス スパイクサンプル ピーク1はサンプルマトリックス 由来のコンタミネーションの 影響を受けている ピーク2と3は クリーン ピーク1はクリーン 1 2 3 0.004 AU 10 分 8 6 4 2 0 1 3 2 0.004 AU 図4. より適切なサンプル前処理による定量の正確性の向上 もう1つの例を図5に示します。上図のクロマトグラムでは、分析種1、2のどちらにもサンプルマトリックス中の 分析妨害成分の影響が大きく出ています。それに対して下図は、S P Eで適切なサンプル前処理を行ったことでベース ラインが大幅に改善し、分析結果の正確性が向上しています。同様にサンプルから分析種を分離、精製する場合でも、 はるかに精製度の高い抽出液を得ることができます。 PDA (0.01 AUFS ) 1 2 0 5 10 分 1 2 SPEサンプル前処理未実施のメソッド SPEメソッド 図5. SPEテクノロジーにより大幅に改善したベースライン

［

SPE

の

4

つの主要な恩恵

］

2. MS

アプリケーションにおけるイオンサプレッションとエンハンスメントの低減

複雑なサンプルマトリックスの2つめの問題は、検出器として質量分析計（LC/MSまたはLC/MS/MS）を用いた場合 に生じます。正しいMS信号応答（感度）を得るには、化合物が適切にイオン化されなければなりません。サンプ ルマトリックス中の分析妨害成分により、化合物のイオン化が阻害されると、シグナル強度が著しく低下します。 その様子を示したのが図6です。上図は生理食塩水に溶解した分析種を注入した場合のシグナルです。それに対 し下図は、ヒト血漿中の同じ分析種を分析した結果ですが、レスポンスが大幅に抑制（サプレッション＞90％）さ れているのがわかります。下図のサンプルは、一般的なタンパク質沈殿を前処理として行いましたが、この方法 ではイオンサプレッションを引き起こすマトリックス中の分析妨害成分を除去することはできず、結果としてシ グナルレスポンスが大幅に低減しました。 . 260 300 340 380 420 460 500 540 580 620 m/z 100 % 0 591.7 354.4 518.5 472.6 485.5 609.6 Scan ES+ Scan ES+ 354.4 260.2 291.3 609.6 485.6 472.6 411.5 591.6 100 % 0 50/50 水/ACN ＋ヒト血漿上清液 50/50 水/ACN タンパク質沈殿処理をした ヒト血漿抽出液に添加した分析種 分析種スタンダード水溶液 260.2 291.2 354.4 411.4 472.6 485.6 591.6 609.5 -97 % -96 % -86 % -93 % -93 % -95 % -89 % -93 % イオンサプレッション（％） 図6. サンプルマトリックスの影響によるイオンサプレッションの例 もう1つ、このサプレッションの影響がよくわかる例が図7です。タンパク質沈殿法のみで前処理した血漿サンプ ルを用いた上図のMSクロマトグラムでは、terfenadineのピークが80％も抑制されています。それに対し同じサン プルをSPEメソッドで前処理した下図のクロマトグラムでは、イオンサプレッションが最小限に抑えられているの がわかります。サンプルマトリックス中の分析妨害成分を除去することで、化合物のイオン化が適切に行われ、より 正確なシグナルを得ることができます。

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つの主要な恩恵

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0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 分 0 % 100 0 % 100 MRM 472.2 > 436.4 1.27e6 MRM 472.2 > 436.4 1.27e6 1.89 1.91 80％のイオンサプレッション 最小限のイオンサプレッション SPE (Oasis MCX) PPT 注：サンプルは乾固して再溶解 グラジエント時間＝1.5 分 SPEによりサプレッションを引き起こす分析妨害成分を除去することで 分析種のシグナル抑制が起こっていない 図7. 適切なSPE前処理で軽減されたイオンサプレッション 場合によっては、サンプルマトリックス中の分析妨害成分が、化合物のシグナルを大幅に増大させることがあり ます。これはイオンエンハンスメントと呼ばれ、結果が真値より高い不正確な値になります。適切なS P Eメソッド の活用で、サンプル中の分析妨害成分を除去し、イオンエンハンスメントの影響を最小限に抑えたより正確な値 を得ることができます。

3.

サンプルマトリックスから分析種を属性の違いにより分画する能力

分析者は、幅広い物性をもつ化合物が含まれているソフトドリンクの分析時など、分析効率を大幅に向上させる ため、サンプルを属性の違いにより分画しなければならないことがあります。例えば、化合物を極性の違いで 分画する際にS PEメソッドが適用できます。高極性化合物と非極性化合物とを分画し各画分を別々に分析するこ とで、それぞれの画分に含まれる成分の極性が類似していてそれに適した分析条件を設定できるため、分析効率 を向上させることができます。

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つの主要な恩恵

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S PEによる分画効果例を図8に示しました。ここでは、複雑な乾燥粉末サンプル（紫色のグレープジュースミックス） が高極性成分、赤色色素、青色色素、非極性成分の4つに簡単に分画されています。この能力がいかに優れてい るかについては、本書中の別の項で取り上げていきます。 画分1（透明） 水 高極性成分 （透明） 画分2 8％ I PA 赤色 徐々に溶媒の強さを上げていくステップグラジエントを使用 分画 画分3 35％ I PA 青色 画分4 70％ I PA 非極性成分 （透明） 図8. SPEによるサンプル前処理 SPEによるサンプルの分画についての詳細は、125ページのメソッド開発を参照してください。

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つの主要な恩恵

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4.

微量成分の濃縮

分析者は今日、1兆分の1（ppt）またはそれ以下のかつてないほど低い含有率の化合物について報告が必要なこと が少なくありません。通常、前処理を行わずにこのレベルの含有率のサンプルを分析する場合、感度面において 分析機器の限界があります。 これを示す良い例が、環境サンプル中に含まれる微量の汚染物質や生体試料中に含まれる代謝物の経時変化を分 析する場合です。図9の上図は前処理未実施のサンプルのクロマトグラムで、分析種のレスポンスが非常に低く なっています。微量成分の濃縮にSPEを使用したサンプルを同じ条件で分析した下図のクロマトグラムでは、分析 種のシグナル強度が著しく高くなり、サンプル中に含まれる分析種の濃度を、正確に求められるようになります。 4 5 分 3 2 1 0 SPEでサンプル中の分析種を濃縮 ―良好なレスポンス* *SPE濃縮後の容量から、元の濃度を計算へロードしたサンプル容量と 分析種の濃度が低すぎる （定量が困難） 図9. 微量成分の分析例 SPE で使用される固相充塡剤の高い保持能力は、他のサンプル前処理アプローチでは非常に困難である成分の 濃縮を可能にすることがあります。

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つの主要な恩恵

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まとめ

これまで見てきた通り、SPEがもたらす4つの主要な恩恵により、サンプル分析の成功率を向上させることができ ます（図10を参照してください）。 サンプルロード （黒色） 脱離 1 脱離 2 1 本のカートリッジで 3 種の色素すべてが分離 逆相クロマトグラフィー 脱離 3 SPE の4つの主要な恩恵 1. サンプルの単純化 2. マトリックス効果の軽減 3. 分画 4. 微量成分の濃縮 図10. S P Eの力 本書では、SPE の基本の全てと、過去30年間にこのテクノロジーに携わった世界中の科学者から得られた成功の テクニックをご紹介します。今日、科学者は難しいサンプル前処理や分析上の課題を克服するための手法と して、SPE が役立つ手法であることをこれまで以上に見出しています。 本書を通してSPEが持つ能力を理解しマスターすることにより、このテクノロジーの持つ力をラボで活用できるように なることを願っています。

　

　

　

　

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