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● シンポジウム 2 神経保護と神経再生
要 旨 近年，様々な組み合わせの転写因子を強制発現させることによって皮膚線維芽細胞などの体細胞から異なる 細胞種を直接誘導するダイレクトリプログラミングの報告が多数されてきている．このダイレクトリプログラ ミングによって作成される iN 細胞は，比較的短期間で誘導でき，かつ腫瘍形成のリスクが少ないなど，多く の利点があり注目を集めている．さらに，神経幹細胞を直接的に誘導する技術も発表され，今後，脳梗塞への 治療応用が期待されている． （脳循環代謝 25：73∼76，2014） キーワード : iN 細胞，ダイレクトリプログラミング，細胞移植治療，脳梗塞1．背 景
2006 年 8 月に京都大学山中伸弥教授らによってマウ ス皮膚線維芽細胞に 4 つの転写因子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc）を強制発現させることで Induced pluripotent stem cells（iPS 細胞）を誘導できることが発表された1）．iPS 細胞はほぼすべての組織に分化する“分化万能性”と無 限に増殖できる“自己複製能”を併せ持つ多能性幹細胞 であり，この技術を使うことで患者自身の細胞から神 経細胞を含む多様な細胞種を誘導しうることから，現 在移植治療への応用が検討されている．しかしなが ら，iPS 細胞は未分化な状態では高い腫瘍形成能があ ることが知られており，臨床応用への大きなハードル となっている．そこで世界中の研究チームが，皮膚線 維芽細胞から iPS 細胞を経ずに直接的に神経細胞を誘 導しようと様々な手法で挑戦を行ってきた．2．iN 細胞とは
2010 年 1 月スタンフォード大学の研究チームは Ascl1, Brn2, Myt1lという成熟した神経細胞に強く発現 している 3 つの転写因子をマウス皮膚線維芽細胞に強 制発現すると，グルタミン酸作動性ニューロン様の細 胞を高率に直接誘導できることを発表した2）．この誘 導された神経細胞は神経細胞特有の活動電位や，シナ プス形成能を持つことが示され，induced neuronal cells （以下 iN 細胞）と名づけられた．この発見の後も複数 の研究室でさらに iN 細胞の研究は進められ，様々な 種類の神経細胞が異なる転写因子の組み合わせによっ て誘導できることが現在までに明らかになっている （図 1，2）3~6）．3．ヒト iN 細胞の開発
筆者の一人である山下は留学先であるコロンビア大 学の Asa Abeliovich 博士の研究室で，Ascl1，Brn2， Myt1l，Olig2，Zic1 の 5 つの転写因子を成人皮膚線維 芽細胞に強制発現させると，わずか 2∼3 週間で iN 細 胞を誘導することができることを見出した．この誘導 された iN 細胞は形態もニューロン様で，約 60％はグ ルタミン作動性ニューロンマーカーの vGLUT1 陽性細 胞であり，他の Tuj1，Neurofilament，NCAM，MAP2 などのニューロナルマーカーも発現していることを免 疫染色で確認した．また iPS 細胞のような未分化な細 胞を介していないかを確かめるため，iN 細胞誘導を開 始 し て 3，7，21 日 後 の 細 胞 を 免 疫 染 色 で Sox2，iN
細胞を用いた新規脳梗塞治療法開発への展望
山下 徹，阿部 康二
岡山大学大学院医歯薬学総合研究科脳神経内科学 〒 700-8558 岡山県岡山市鹿田町 2-5-1 TEL: 086-235-7365 FAX: 086-235-7368 E-mail: tooy@d1.dion.ne.jp脳循環代謝 第 25 巻 第 2 号 ─ 74 ─ 図 1．iPS 細胞を介した神経細胞誘導と，iN 細胞誘導の概略（文献 10 より改変転載） a：iPS 細胞を介する場合，まず山中 4 因子を皮膚線維芽細胞に強制発現させた上で iPS 細胞を作成し， その iPS 細胞から目的の神経細胞を培養下に分化させることで誘導する． b：iN 細胞を誘導する場合，皮膚線維芽細胞に Ascl1，Brn2，Myt1l，Olig2，Zic1 などの複数の転写因子 を強制発現させ直接 iN 細胞を誘導する． c：筆者らが誘導した iN 細胞の免疫染色像．ヒト皮膚線維芽細胞に 5 つの転写因子（Ascl1，Brn2， Myt1l，Olig2，Zic1）を強制発現させて 3 週間後には，培養細胞のうち約 30％が成熟神経細胞マーカーで ある MAP2 陽性細胞となった．Scale bar: 100 μm.
iN細胞を用いた新規脳梗塞治療法開発への展望 ─ 75 ─ Pax6，sRT-PCR 法で FoxG1，Otx2 などの幹細胞や神 経芽細胞のマーカーを検討したが，全くそれらの発現 は認めなかった．以上のことから我々は，直接的に神 経細胞の誘導を行うことができたと結論づけた．また 誘導後 3∼5 週間後の iN 細胞に対してパッチクランプ 法で検討したところ，ニューロンに非常に類似した電 気生理学的特徴を持つことが明らかになった．最後に この誘導された iN 細胞が生体内で機能するかを調べ るために，GFP で標識した iN 細胞を胎児期（E12∼ E13）のマウス脳室内に移植した．移植された iN 細胞 は時間の経過とともに脳実質へと移動し，神経突起を 伸展していることがわかった．また新鮮脳切片上の iN 細胞に対するパッチクランプ法の検討により，iN 細胞 は自発的な発火をし，その自発的発火は GABAa 受容 体アンタゴニストであるピクロトキシンの処理により 増大が確認されたことから，抑制系ニューロンによる 制御をうけていることが示唆された．以上のことから 移植された iN 細胞は脳内に生着し既存の神経ネット ワークに組み込まれうることが明らかになった． 以上の実験から成人皮膚線維芽細胞からも iN 細胞 が誘導できることが示された．
4．iN 細胞を用いた細胞移植療法の可能性
細胞移植治療の移植細胞として，大量の移植細胞を 準備するのが比較的困難な点はあるものの，iN 細胞は 未分化な状態を経ずに誘導されることから腫瘍形成リ スクが低いと予想され，iN 細胞は魅力的な移植細胞源 であるといえる．すでにハーバード大学の研究グルー プがマウス皮膚線維芽細胞からドパミン作動性ニュー ロン様の細胞を誘導し，これらの細胞が実際にドパミ ン放出能を持ち，かつ 6–OHDA パーキンソンモデル マウスに移植した場合，移植された iN 細胞は脳内で 長期間生存し，運動機能改善効果を示したことを報告 している7）． さらに近年，慶應義塾大学の岡野栄之教授・赤松和 土講師研究室を含む複数の研究グループから，神経幹 細胞をダイレクトリプログラミングで誘導する技術が 報告された8, 9）．神経幹細胞は神経細胞やそれをサポー トするグリア細胞に分化でき，かつ増殖能を持つ．移 植細胞を大量に準備することも比較的容易であろうと 予想される．これらダイレクトリプログラミング技術 で誘導された神経幹細胞が同様に治療効果を示すこと ができるのかも今後注目される．5．おわりに
これまでの研究で，様々な転写因子の組み合わせに より，目的の神経細胞が直接誘導できることがわかっ てきた．しかしながらどのようにして細胞の運命が変 えられるのか，そのメカニズムはほとんど不明のまま である．また治療や病態解析に応用する場合に強制発 現された転写因子が移植細胞に影響しないのかは今後 注意深く検討する必要がある．また今後移植治療等に 使用する際には，腫瘍形成能が本当にないのか，長期 にわたってその安全性を確認する必要がある． 様々な課題は残っているものの，このダイレクトリ プログラミング技術によって，目的の神経系細胞を短 期間でかつ未分化な状態を経ずに直接的に誘導するこ とが可能となってきており，今後，脳梗塞に対する細 胞治療療法への応用が期待される． 文 献1） Takahashi K, Yamanaka S: Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126: 663–676, 2006
2） Vierbuchen T, Ostermeier A, Pang ZP, Kokubu Y, Südhof TC, Wernig M: Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature 463: 1035–1041, 2010 3） Caiazzo M, Dell’Anno MT, Dvoretskova E, Lazarevic D,
Taverna S, Leo D, Sotnikova TD, Menegon A, Roncaglia P, Colciago G, Russo G, Carninci P, Pezzoli G, Gainetdinov RR, Gustincich S, Dityatev A, Broccoli V: Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature 476: 224–227, 2011
4） Matsui T, Takano M, Yoshida K, Ono S, Fujisaki C, Matsuzaki Y, Toyama Y, Nakamura M, Okano H, Akamatsu W: Neural stem cells directly differentiated from partially reprogrammed fibroblasts rapidly acquire gliogenic competency. Stem Cells 30: 1109–1119, 2012 5） Qiang L, Fujita R, Yamashita T, Angulo S, Rhinn H,
Rhee D, Doege C, Chau L, Aubry L, Vanti WB, Moreno H, Abeliovich A: Directed conversion of Alzheimer s disease patient skin fibroblasts into functional neurons. Cell 146: 359–371, 2011
6） Son EY, Ichida JK, Wainger BJ, Toma JS, Rafuse VF, Woolf CJ, Eggan K: Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell 9: 205–218, 2011
7） Kim J, Su SC, Wang H, Cheng AW, Cassady JP, Lodato MA, Lengner CJ, Chung CY, Dawlaty MM, Tsai LH, Jaenisch R: Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell Stem Cell 9: 413–
脳循環代謝 第 25 巻 第 2 号
─ 76 ─ 419, 2011
8） Lujan E, Chanda S, Ahlenius H, Sudhof TC, Wernig M: Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A 109: 2527–2532, 2011
9） Matsui T, Takano M, Yoshida K, Ono S, Fujisaki C,
Matsuzaki Y, Toyama Y, Nakamura M, Okano H, Akamatsu W: Neural stem cells directly differentiated from partially reprogrammed fibroblasts rapidly acquire gliogenic competency. Stem Cells 30: 1109–1119, 2012 10） 山下 徹，阿部康二：iN 細胞を用いた脳再生医療の
展望．分子脳血管病 12: 52–55, 2012
