ミニレビュー
2014 年 8 月 19 日受付 2014 年 8 月 19 日受理 ＊連絡先 〒 989-6711 宮城県大崎市鳴子温泉蓬田 232-3ImageJ を用いた画像解析による根長の評価
田島亮介
東北大学大学院農学研究科附属複合生態フィールド教育研究センター 要 旨：近年根系の様々な形質に注目が集まっているが，その中でも根長は根の養水分吸収を考える上で は重要な形質のひとつである．根長を評価する方法は大きく発展してきており，コンピュータを利用した画 像解析による根長評価が一般的になりつつある．画像解析による根長の評価はコンピュータに画像を読み込 み，その後その画像を一定のアルゴリズムに従って解析する．根長評価には WinRHIZO が使われることが多 いが，著者らはオープンソースの画像解析ソフトウェア ImageJ を用いる方法を提案している．この評価方法 と WinRHIZO で評価した根長はほぼ一致する．この方法は ImageJ の機能であるマクロやプラグインを用い れば，高効率で自動的な根長の評価が可能である．今後は画像解析による根長評価の標準化を図ることで， 様々な環境条件下で評価した複数の論文間での根長を定量的に議論することが可能となると考えられる．ま た，ImageJ による画像解析は根長の評価のみならず，根系のその他の形質や根系以外の作物の様々な形質 の解析にも用いることができる． キーワード：根長，画像解析，ImageJ．Estimation of root length using image analysis with ImageJ: Ryosuke TAJIMA (Field Science Center, Tohoku University)
Abstract : Various root traits has been focused and root length is one of important traits for nutrient and
water uptake from the soil. Estimation of root length has been dramatically improved by image analysis with image-processing software and image scanners. In estimation of root length, WinRHIZO, the special software for root analysis, has been often used but we proposed a novel method of estimating root length using open-source software ImageJ. The estimates by our proposed method using ImageJ closely corresponded to those estimated by WinRHIZO. Using this method, the high-thoroughput and completely automated estimation of root length could be performed by using ImageJ-plugins and ImageJ-macro. It is necessary to establish the standard protocol of root length measurement. The quantitative discussion of root length will be facilitated between many root researchers in the protocol. In addition, various plant traits can be evaluated with image analysis using ImageJ.
Keywords : root length, image analysis, ImageJ.
1．はじめに 近年土壌の利用可能な養水分の少ない土地における 作物生産の向上には，根系の役割が重要であるとして 注目が集まっている（Gewin, 2010）．様々な環境，栽 培条件での作物の根系を評価するには，まず作物の各 生育時期に根が土壌中のどの位置にどれくらい存在し ているかを調査する必要がある．この調査，特にフィー ルドにおける作物根系の調査では，根系を土壌中から 掘り出して，洗い出し，根重や根長を評価することに なる．特に根長は根の養水分吸収を考える上では重要 な形質のひとつであり，実際にストレス条件下で根長 を評価している例は少なくない（例えば，Henry et al., 2011；Kano et al., 2011）． 根長を評価する方法は近年大きく変化してきてい
る（Le Bot et al., 2010）．根長は古くは格子の上に根を 広げて，その格子と根との交点を数え上げて，係数を かけて評価する格子交点法を用いて評価されてきた． その後ルートスキャナを用いて評価する方法が標準的 となったが，現在ルートスキャナは販売されておらず， ルートスキャナを用いて評価した値は，根長を過小評 価 し て い る 可 能 性 も 指 摘 さ れ て お り（Kato et al., 2010），ほとんど使われていない．そのため，コンピュー タに根系の画像を取り込み，それを解析することで根 長を評価する方法が定着しつつある． そこで，本稿では，画像解析を用いた作物根系の根 長の評価について著者の研究例を紹介しつつ，根長を 評価する上での注意点に言及するとともに画像解析ソ フトウェア ImageJ の使用方法について主に述べたい．
2. 画像解析を用いた根長の評価とその注意点 画像解析を利用した根長測定の手順は，まず根系の 画像をコンピュータに読み込み，その後その画像を一 定のアルゴリズムに従って解析するというものである （第 1 図）． 根系の画像をコンピュータに読み込むには，根系を 採取して，根の画像を取得できるようにトレイ上に配 置する必要がある．水耕栽培やグロースポーチを利用 して栽培した作物根系であれば，すぐに解析可能な状 態で根系を採取することができて，画像を取得するこ とは容易であるが，土耕栽培では作業に時間がかかる 場合が多い．ポット栽培であれば，あらかじめふるい で，栽培に用いる培土の粒径を揃える等の工夫によっ て根系の採取が容易になる場合がある．研究の目的上 問題にならない範囲で，ポット栽培試験では根系採取 まで考えて入念に準備をすることが根系を評価する上 では重要である．これらと比較して圃場栽培試験にお ける作物根系の画像の取得には圧倒的に多くの時間と 手間を要する．その中でも最も時間を要するのは採取 して洗い出した根系のサンプルから細かい有機物等の ゴミを除去する過程である．このゴミの除去は画像取 得後，コンピュータ上でおこなうことも可能である． 画像からのゴミの除去方法としては取得した画像を拡 大して，画像編集ソフトウェアを用いて手作業で消す ことが確実ではあるが，これは根系サンプルからゴミ を除去する場合と同様に時間と手間を要する．これと は別に画像解析ソフトウェアを用いて一定の基準でゴ ミと認識される部分を削除する方法もあるが，どのよ うな形状でゴミと根系を分けるかは根系の採取状況， 取得した画像によって一様ではなく，現状では広範囲 で利用可能なアルゴリズムは存在しないと考えられ る．ゴミの除去は根を採取したフィールドによって作 業の軽重に差があり，作物栽培歴が浅く，土壌有機物 の少ない圃場では比較的容易である場合が多い． 採取した根を洗い出した後の画像の読み込みは，カ メラのネガフィルムやポジフィルムをデジタル化する 際に利用する透過原稿に対応したスキャナを利用する ことが望ましい．筆者は現在 GT-X970，ES-G11000（共 にエプソン，日本）を用いている．前者の最大読み取 りサイズは A4（210mm × 297mm）であり後者は A3 （297mm × 420mm）である．A4 サイズのスキャナに対 して，A3 サイズのスキャナは 2 倍のサイズの画像を 読み込めるため，画像取得にかかる時間がある程度短 縮されるものの，価格は 2 倍以上するので，調査の目 的に応じて選択する必要がある． 根系の画像取得に透過原稿に対応したスキャナを用 いる理由は，根の影の映り込みを防ぐためである．根 系の画像を取得する際は，スキャナ上に透明のアクリ ル製またはガラス製のトレイを置き，そこに水を張っ て根を広げていく．その後スキャナで画像を読み込む ことになるが，その際通常のスキャナを用いると根の 影が画像に映り込み，根長を過大評価することになる． 写真撮影によって根系の画像を取得する場合も同様の 第 1 図 画像解析を用いた根長評価の手順．
問題がある． 根をトレイ上に広げる際，特に湛水条件で栽培した イネの根等の細根が多いサンプルの場合は，精密ピン セットを用いる必要があるが，精密ピンセットを用い るとトレイが傷つきやすい．この傷も大きい場合には 根として認識される可能性がある．根長を精確に評価 するためには頻繁にトレイを交換することが望まし い．なお，ガラストレイの方がアクリルトレイより傷 つきにくい． 画像解析をおこなうための根系画像は圧縮されない 画像形式（例えば TIFF 形式）で読み込むことが望ま しいが，圧縮された JPG 画像でも解析は可能である． 圧縮率が低い場合には TIFF 画像を用いた解析と値が 大きく異なることはない．また，画像を取得する際の 解像度も根長の評価に影響する．そのため，論文には 解像度として画像の DPI（dots per inch：ドット密度） を記載する必要がある．これまでの研究では 200-600dpiの範囲で読み込む例が多い．著者らが提案した 方法では 400dpi で読み込み，解析をおこなっている． 次に根長を評価するための画像解析について解説す る．画像解析をおこなうには，画像処理ソフトウェア が必要である．その中で根系解析専用の画像処理ソフ ト ウ ェ ア で あ る WinRHIZO（Regent Instruments Inc. Quebec, Canada, 2000）は最も広く利用されている．し かし，WinRHIZO にはいくつかの問題点がある．まず， 根長を含む根系の形質を評価する際のアルゴリズムが 公開されていないことがあげられる．そのため，使用 者はソフトウェア内で画像がどのように処理されて根 長が評価されているか知ることはできない．また， WinRHIZOで根長について信頼性の高いデータを取得 するには Bouma ら（2000）の方法に準じておこなう 必要があるが，この方法では画像を細分化して根長を 評価していくので時間を要する． 加えて WinRHIZO は高価なソフトウェアであり，作物根系に注目する研 究者全てが利用できるとは限らない． そこで，著者らは WinRHIZO を利用しない根長の評 価方法としてオープンソースの画像解析ソフトウェア ImageJを用いる方法を提案した（詳細は Tajima and Kato, 2011, 2013）．この評価方法では，根長を算出す るアルゴリズムではなく，画像から根長を評価できる 状態に変換する前処理である 2 値化に注目した．作物 根系の画像から根長を評価するには，画像をあるしき い値で白黒のみの画像に変換するこの 2 値化という行 程が必要である．この変換は WinRHIZO では公開され ていない何らかのアルゴリズムでなされている．一方， ImageJを使って，既存の根長を算出するアルゴリズム を利用する場合，これまでは目視で根系画像を確認し ながらしきい値を設定する必要があった．しかし，目 視でしきい値を設定する場合にはコンピュータのモニ タや周囲の環境，研究者に依存して，しきい値の設定 は異なり，それは根長の値にも影響しうる．Tajima と Kato（2011）にも示したがしきい値による根長の評価 値は大きく異なってくる．このデータのうち，実際に 目視で選択される可能性のありそうなしきい値だけで 見ても，しきい値によって根長の評価は 3 割程度異 なってくる．また，画像 1 枚ずつしきい値を設定して いくと多大な時間を要する．そこで，著者らは画像の 2値化の値を自動で定めるアルゴリズムを複数検証し て，ImageJ を用いて評価した根長と WinRHIZO で評 価した根長とがほぼ一致するアルゴリズムを見つけて 提案した．本方法を用いれば，研究者に依存せず，素 早く根長を評価することが可能である．この方法は直 径別の根長についても検証済である（Tajima and Kato, 2013）． 今回提案した方法では同じ根系の画像を用いれば， 研 究 者 に 依 存 せ ず に 同 じ 値 が 算 出 さ れ， そ れ は WinRHIZOで評価した値との定量的な議論も可能であ ると考えられるが，今後さらなる手法の標準化をおこ なう必要があると考える． 以上紹介したように ImageJ を用いると高効率な根 長の画像解析システムを比較的簡単に構築することが 可能である．その際に ImageJ のマクロおよびプラグ インを利用するとさらに効率の良く解析をおこなうこ とが可能となる．そこで次項ではこの ImageJ のマク ロとプラグインについて解説する． 3. ImageJ の利用とマクロおよびプラグイン まず ImageJ について簡単に解説する．ImageJ はオー プンソースの画像解析ソフトウェアで，様々な画像形 式，画像処理に対応していることから，現在医学系を 中心に多くの研究分野で利用されている．オープン ソースであるために ImageJ のソースコードは全て公 開されており，利用者が画像処理の過程を確認するこ とが可能で，必要に応じてソフトウェアそのものを改 変することもできる． ImageJ はアメリカ国立衛生研 究所（NIH）で開発されていた画像解析ソフトウェア NIHImageを 発 展 さ せ て 構 築 さ れ た．NIHImage は Apple社 の Macintosh コ ン ピ ュ ー タ に 搭 載 さ れ た MacOS上でのみ動作したが，ImageJ はプログラミン グ言語 Java で構築されており，MacOS のみではなく Linuxや Windows 等のその他の OS 上でも動作する． 現在も開発が続けられており，NIH のサイト（http： //rsb.info.nih.gov/ij/index.html）から最新版をダウンロー ドして利用できる．ImageJ は拡張性が高く，マクロや プラグインを導入して様々な解析をおこなうことがで きる．あらかじめ様々な解析に必要なプラグインを導
第 2 図 ImageJ におけるマクロとプラグインの使用方法．
A. マクロの記録方法．B. マクロの記録例．C. マクロのインストール．D. マクロインストール後の画面． E. プラグインのコンパイルと使用方法．F. コンパイル後のプラグインの使用方法．
入した強化版 ImageJ とも言えるソフトウェアも複数 配布されている．その代表的な例は Fiji であり，これ もダウンロードして利用できる（http：//fiji.sc/Main_ Page）．ImageJ の利用方法全体については上で紹介し た NIH のサイトの "Documentation" にある ImageJ User Guideを参照して欲しい． 著者らが提案した根長を評価する方法は ImageJ 単 独では作業工程が多いために煩雑である．そこで，マ クロかプラグインであらかじめその作業行程を記述し て利用する必要がある．マクロとプラグインは見かけ 上似た動作をする場合が多いが，その記述方法は大き く異なる． マクロは複雑な作業工程を記述することはできない が，自然言語に近く直観的に扱いやすい．ImageJ を立 ち上げて Plugins ＞ macros ＞ Record... を選ぶと，その 後 ImageJ でおこなう一連の動作を記録することが可 能であり，その記録を再利用してマクロを記述するこ とができる（第 2 図 A, B）．一方，プラグインは Java を利用して記述されるために基本的な Java の知識がな いと構築することが難しい．しかし，プラグインは ImageJの性能を最大限活用できる．例えば，著者らが 提案した根長評価をマクロとプラグインそれぞれで記 述して動作させると，動作環境にもよるが，処理速度 はプラグインがマクロの約 1.2 倍の早さとなった． マクロとプラグインは記述方法だけでなくその利用 方法にも若干の差異がある．マクロは ImageJ を立ち 上げ Plugins ＞ macros ＞ Install... を選択して，マクロ ファイルを選択するとインストールされる（第 2 図 C）． その後 Plugins ＞ macros を選択すると導入されたマク ロが表示され，これを選択するとマクロが動作する（第 2図 D）．対して，プラグインを利用する場合は作成 したプラグインをあらかじめImageJのプラグインフォ ルダ内にサブフォルダを作成してそこに保存しておく 必要がある．その後 Plugins ＞ Compile and Run... を選 択して，プラグインファイルを選択するとプラグイン プログラムがコンパイルされて動作する（第 2 図 E）． プラグインは一度コンパイルして導入した後は， ImageJの Plugins のリストに表示され，それ以降再度 コンパイルせずに使用することができる（第 2 図 F）． このようなマクロやプラグインを用いると作業工程 を自動化することが可能であり，ImageJ で早く大量の 画像を評価することが可能となる． マクロ，プラグインの導入および利用例として，簡 単な根長測定プログラムをマクロとプラグインで作成 し，サイト（http://blukaniro.web.fc2.com/Support/index. html）に掲載した．どちらのプログラムも ImageJ で開
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図
8. 画像解析を用いた解析例．
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A. 根粒の画像とその解析例．B. 画像取得に用いるシステムと取得した．葉の
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画像．
C. 群落の写真とその２値化．供試作物は全てダイズ．
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第 3 図 画像解析を用いた解析例． A. 根粒の画像とその解析例．B. 画像取得に用いるシステムと取得した葉の画像例．C. 群落の写真と その 2 値化．供試作物は全てダイズ．いた画像について根長の評価をおこなう．マクロは 400dpiの画像にしか対応していないが，プラグインは 任意の解像度をあらかじめ選択できるように設定し た．なお，これらはあくまでマクロおよびプラグイン の動作および利用方法を確認するためのものであり， そのまま根長の評価に利用することは薦めない． 4. 画像解析の根長評価以外への応用例 ここまで画像解析を用いた根長評価について解説し てきた．画像解析を利用した解析については根長の評 価以外にも応用ができる．根系に関しては，例えば ImageJの プ ラ グ イ ン と し て SmartRoot（Lobet et al., 2011），Cornell 大学の Kochian のグループが精力的に 進めている RootReader（Clark et al., 2011）などがある． これらの画像解析プログラムは根長以外の根の形質も 解析することが可能で根系の 3 次元解析にも対応して いる．これらのプログラムは水耕や寒天培地などを用 いて試験をおこない，根系全体をきれいに採取できる ことが前提となっており，取得する根系のサンプルに よっては利用が難しいと考えられる．また，根系を解 析する際に重要となる根端の抽出に関して，最近では 機械学習を用いる方法も提案されている（Kumar et al., 2014）．今後有力な方法になりうるが，学習履歴に よっては同じ画像を用いても解析結果が異なる可能性 がある． ImageJを用いた画像解析は根系以外にも用いること ができる．その例として 3 つ簡単に紹介したい．1 つ めはマメ科作物根系に形成される根粒の粒径分布の評 価である．筆者はかつてマメ科作物の窒素固定能力に 関連して根粒の粒径分布を円定規を用いて調査したこ とがあるが（Tajima et al., 2006），多大な時間と手間を要 する調査であった．しかし，根粒を根から外してスキャ ナ上に配置して，画像解析すれば，根粒の粒径分布を 簡単に評価することが可能となる（第 3 図 A）．2 つめ は葉面積の測定である．葉面積の測定には専用の葉面 積計を用いることが多く，スキャナを利用するよりも 効率が良い場合が多い．しかし，ScanSnap FI-SV600（富 士通，日本）を利用すると葉面積計と同程度には効率 よく評価することが可能である（第 3 図 B）．このスキャ ナは書籍をスキャンするための非接触型のスキャナで あるが，葉面積測定に応用できる．3 つめは作物群落 の写真を用いた被度の評価である．この評価ではバッ クグラウンド（土の表面等）と植物体との区分けが難 しいことが問題になるが，カラー写真を用いて， ImageJでカラー情報を RGB 分解し，その情報を適宜加 減乗除すると，植物体部分を精度よく自動的に解析で きる可能性がある（第 3 図 C）．これについてはまだ検 証段階にあるためアルゴリズム等の詳細は割愛する． 5. おわりに 以上紹介してきたように，ImageJ を用いれば，解析 過程の透明性が担保されるとともに，比較的安価に根 長解析のシステムを構築することが可能である．コン ピュータを利用した画像解析による根長の評価は，根 系の採取，画像の取得方法，画像処理ソフトウェアに よって値が異なる可能性があり，様々なデータを定量 的に議論する際は注意が必要である．著者らが提案し た方法は少なくとも同じ画像から同じデータを得ら れ，WinRHIZO での解析結果とも比較可能な方法であ るが，今後は画像解析による根長評価手法を整理して， さらに標準化を図る必要があると考えている．それに より，様々な環境条件下で評価した複数の論文間での 根長を定量的に議論することが可能となり，根系に関 する研究の更なる発展が望めると考えられる．また， ImageJによる画像解析は根長の評価のみならず，根系 のその他の形質や根系以外にも作物に関する様々な解 析にも用いることができる． 本稿で紹介した根長の評価やその他の解析に用いる プログラムはマクロ，プラグインともに配布可能であ る．また，先のマクロとプラグインの例以外も同じサ イトで配布準備中である． 謝辞 本稿に関連した研究の一部は科学研究費（22405015, 23780013, 2660012）の助成を受けておこなった． 引用文献
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