<総説>エイズ治療薬開発のストラテジー 利用統計を見る

エイズ治療薬開発のストラテジー

 中 島 秀 喜

山梨医科大学微生物学講座 抄録：エイズという疾患が我々の前に大きな社会問題として出現して以来，この十数年の問に 病原体としてのHIV（ヒト免疫不全ウイルス）の発見をはじめ，その発症病理や治療法の開発に 関する数多くの欝を見張るような研究がなされてきた。とりわけ，抗HIV作用を示す物質の発見 は，ウイルスの感染・増殖を阻止することでその発病を抑えようとする，エイズ治療または予防法 としての化学療法の可能性の道を開いたものである．現在HIV感染症の治療薬として認可されて いるものには，AZT， dd至とddCがあるが，これらの薬剤には強い副作用があり，また長期投薬を 受けた患者から，薬剤に低感受性の耐性ウイルス株の分離もみられている．それゆえ，さらに有効 でなおかつ副作用の少ない抗田V薬の開発が強く望まれているわけである．われわれは，エイズ 治療薬の開発を最終目的に，数多くの物質の抗HIV活性の加漉プ・試験での評価とその作用機序 の解明を行っている．ここでは，われわれが採用している試験方法を紹介する． はじめに

 1981年に初めてロサンゼルスやニューヨーク

の男性同性愛者から見つかったエイズ（AIDS，

Acquired Immune De丘ciency Syndrome）は，

原因不明の奇病として恐れられ，急激に世界中

に広がった。その患者層も成人男女にとどまら

ず，エイズ患者を親にもつ乳幼児や，輸血や血

液製剤を使用したために発症した小児にまでも

および，社会的な大問題となっている。エイズ

は，1983年にその原因であるHIV（Human

Immunod西ciency virus，ヒト免疫不全ウイル

ス）が発見されたことで，非常に長い経過を有

するウイルス感染症の終末像であることがわ

かった1−3＞。われわれがエイズとして見聞きす

る患者は，HIV感染者のごく一部にすぎない

が，現在世界中に約1，300万人の感染者がおり，

その大多数は数年後にはエイズを発症するもの

A9

  Ab

〃 〃 C【）4・cg難 1）〒409−38山梨県中巨摩郡玉穂町下河東11！0 受付：1993年9月9日 受理：1993年9月14日       〃

0 1 2 3（mon嚇

㎡㈱    ！薯鯛ρむ〃3舵   ！響κ 魚即吟ノ7      甜〃撫ノ 図1．    よびCD 4陽性細胞数の推移．

Ag

踵砂5 HIV感染症におけるウイルス抗原，抗体お

と考えられている。HIVなどのレトロウイル

スは，一度感染するとそのウイルス遺伝子が感

染宿主細胞の染色体に組み込まれて，細胞の分

裂にともなってウイルス遺伝子も細胞内に温存

されたまま，終生個体から消失することはない。

いわゆる，遺伝病の様相を呈し，現代の医学知

識をもってしても，レトロウイルス感染症の根

治治療は不可能である。しかし図1に示すごと

く，HIV感染症は数ヵ月から数年におよぶ無

40 中 島 秀 喜

症候性キャリア（AC）の時期を経て，体内で

のウイルス量の増加にともないエイズ関連疾患

（ARC），エイズへと増悪していくわけである

から，ウイルスの増殖を抑制する有効な抗ウイ

ルス薬があれば，HIV感染者であってもエイ

ズの発症は予防できるはずである。それゆえに，

世界中の多くの研究機関で，HIVの増殖阻止

物質の開発研究が行われている。われわれのグ

ループも，エイズ治療薬の開発を最終目的とし

て，多領域にわたる物質の試験管内での抗

HIV活性の評価を行っている。本稿では，わ

れわれが行っている抗HIV活性測定試験法を

紹介し，今後のエイズ治療薬の開発における問

題点を考察してみる。

IHIVのウイルス学

 HIVは，レトロウイルス科レンチウイルス

亜科に属するRNA型ウイルスである。レトロ

ウイルスとは，細胞に感染するとその細胞内で

ウイルス自身がもつ逆転写酵素（RT）の働き

でRNA遺伝子がDNAに変換（逆転写）され，

核内に移行して細胞のDNAに組み込まれると

いう感染プロセスを特徴とするウイルスで，多

くは発癌性ウイルスである。その名前の由来は，

逆転写酵素を有する癌ウイルス（REverse

TRanscriptase containing Oncogenic virus） と いうことからきている4）。レトロウイルスは，

ニワトリ，マウス，サルなどの種々の動物種か

ら多数分離されている。ヒトのレトロウイルス

9P160

9P120

9P41

P24

P18

表面エンベロープ

 糖タンパク質

膜貫通エン

ベロープ糖

タンぐク質

・膨＼豹

RNA

脂質膜

逆転写酵素

図2．HIVの構造模型．

としては，成人T細胞白血病や痙性脊髄麻痺

を起こすHTLV−1や，病気との因果関係はい

まだ不明であるがHTLV−IIと呼ばれているも

のとHIVが知られている。さらにHIVは，

従来知られていたものとは異なるウイルスが

1985年に西アフリカのエイズ患者から分離され

たため5’6），世界的な広がりを示す従来型のも

のをHIV−1，西アフリカを中心とした地域に

存在するものをHIV−2と呼んで区別している。

 HIV粒子は直径約100 Hmの球形で，他のレ

トロウイルスと同様のウイルス学的性状，すな

わち，中心にRNAとRTを含む円錐上のヌク

レオカプシド，周囲に感染細胞膜由来の脂質膜

と糖タンパク質とからなるエンベロープとから

なる（図2）。ヌクレオカプシドはp24と呼ば

れるタンパク質からできており，その周囲は

p18で構成された基本骨格がある。エンベロー

プの糖タンパク質は，脂質膜を貫通している

gp41と呼ばれる部分と，膜から突き出たgp120・

と呼ばれる部分がある。このgp！20は， HIV

のアンテナともいうべき部分で，感染標的細胞

となるヘルパーT細胞の膜表面のCD 4分子に

LTR

結合する。

 HIVの遺伝子構造も他のレトロウイルスの

それと同様で，左端（5’末端）から右端（3’末

端）の方向へgαg（ウイルス粒子の内部構造を

コードする），ρo♂（逆転写酵素とプロテアーゼ の遺伝子），8ηη（エンベロープの遺伝子）が

並び，その両端が繰り返しの塩基配列（LTR；

iong terminal repeat）となっている。この

LTRは，逆転写されたウイルスDNA （プロ

ウイルスDNA）が宿主のDNAに組み込まれ

るのに必要である。またLTRは，ウイルス遺

伝子が発現するときの船頭役（プロモーター）

としても働き，さらに，ウイルスおよび細胞側

のタンパク質に刺激されて働く特異的な促進因

子も含まれていると考えられている7β）。HIV

は，この基本構造に加えて，さらに6つの調節

遺伝子（オ厩，r即，η4ηびψ〃，ψのが複

雑に配列している（図3）。HIVの増殖速度は，

これら調節遺伝子のなかでも厩と箔即が作り

出すタンパク質の相互作用によって制御されて

いる（図4）。オ碗遺伝子の鰯は「活性化因子」

の略号で，この遺伝子が作るTatタンパク質

［亟コ［ト…捌／

gag

□ x』

  Pr55

／1＼

  p18  p25

（マ鵬ス）↓

      蟹

  （キャブシド）

    ↓

P15

↓＼

P7 P6

NC

Pr160

／

P11

LTR

eηv

P23

      P19

 P5

   P6

 P31

 1N（インテク

   ラーゼ）

 μ 

︻・

 P66

RT＋RNaseH

蓉繋）

（ヌクレオキャプシド）（逆転写酵素）

P14

9P160

／＼

    暫1

P27

P25

（膜貫通エン ベロープ） 図3。HIVの遺伝子構造と各遺伝子から作られるウイルスタンパク質．

42 中 島 秀 喜

LTR

LTR

㊥

   RNA

 Tπa数3cr壼ρ偵。鼓

      ↓

εa∫ly Re

_{ﾕa訟燕ぎ／}

◎一＼   ，一、  1一

   v v θ

Tat like Rev like

  RNA

Splici蝕9／T■a■講port

㊥

    Late S㎞t竃1πal

       mRNAs

 ●一Gag−Po1

ト、   ，    、V’

†

Env

      Vi㎜Mat㎜tion

図4．HIVの転写模型

   Revタンパクの産生がみられないときは，2    回スプライシングした調節タンパク質をコー    ドするメッセンジャーRNAがつくられ，    Revタンパク存在下では構造タンパク質を    コードするmRNAの転写が進む．調節タン    パク質であるTatは，転写効率を促進するよ    うに働く．

は，LTRのなかにあるTARという塩基配列

部位に作用してウイルス遺伝子の転写，翻訳量

を高める働きをする9）。観は，それがない場

合と比較して遺伝子発現を100∼LOOO倍にも高

めると計算されている。r8η遺伝子が作るRev

タンパク質は，ウイルス遺伝子にあってgαg

や飢τ遺伝子の発現を制御している塩基配列に

作用して，ウイルス構造タンパク質の発現を促

し，粒子形成をスタートさせる。つまり，調節

タンパク質を生産していた状態を，ウイルス構

造タンパク質を生産するように変換する10＞。

それゆえ，いったんウイルスの複製が開始され

ると，燃とノ初の働きは拮抗しあい，一種の

恒常状態となる。そして，ウイルスの生産がお

だやかに進み，宿主細胞を殺すことなく何年間

もウイルスを生産し続けることを可能にする。

こうした制御機構が，HIV感染症での潜伏期

と増殖期との切り替えに重要な役割を果たして

いると考えられる。

豆抗HIV薬開発のストラテジー

 エイズの化学療法としての抗HIV物質の開

発に際しては，ウイルスの増殖サイクルの様々

なウイルス特異的なステップを，その阻害目的

とした戦略が考えられる。例えば，①感染標的

細胞へのウイルスの吸着，②ウイルスエンベ

ロープと細胞膜との融合，③ウイルスヌクレオ

カプシドの細胞内への侵入，④ウイルスカプシ

ドの赤核，⑤遺伝子RNAからDNAへの逆転

写，⑥プロウイルスDNAの細胞DNAへの組

み込み，⑦プロウイルスDNAからmRNAへ

の転写，⑧mRNAからウイルスタンパク質へ

の翻訳，⑨ウイルスタンパク質前駆体のpro−

teolytic cleavageやgiycosylationなどの修飾，

⑩ウイルス粒子の組み立てや感染細胞からの出

芽などのステップが標的となる（図5）11）。

これらのウイルス増殖における各ステップは，

HIVの遺伝子にコードされた特異的なウイル

  Aπ3cカ．醒θ刀’

    ①

E〃3メOZ7

 ②

    喫、．．，

㌶勲黛＼

 CD4 βロd曲8⑩

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   ⑨（939、P・1，anΨ，

       ￥ひx？， ▼if？）    Regulatory proteihS    rl「her       （tat」「e￥，轟ef） が。刀  ⊂＝瓢＝＝＝瓢＝＝⊃Vira奮RNA

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斗」触・

  9一〉’一一¶   ［｝一、／一、．昭

  0＿し一＿口 RNA expod

図5．HIVの感染，複製サイクル    丁丁の番号は，本文中の抗ウイルス薬の標的部位の・番号と一致する．

スタンパク質の作用とともに，細胞側の酵素や

修飾が関係する。ウイルスの吸着は，前項でも

述べたようにHIVのエンベロープ糖タンパク

質のgp120が標的細胞膜のCD4分子と結合す

ることによって起こる12憎14）。ウイルスRNAか

らDNAへの逆転写は， HIVのもつRTの作

用であり，このときテンプレートとして作用し

たRNAはHIVのRNaseHの作用で消失す

る。プロウイルスDNAの細胞DNAへの組み

込みは，インチダラーゼやエンドヌクレアーゼ

と呼ばれる酵素の働きで起きる。ウイルスタン

パク質前駆体は，HIV特異的プロテアーゼの

作用でcleavageを受け， g鰐および解gヵ・♂遺

伝子産物はこのプロテアーゼの働きで，p24や

p！8などの構造タンパク質やRTやプロテアー

ゼそのものように，HIV粒子の形成に必要な

タンパク質ができることになる。さらに，ウイ

ルスの複製にあったっては，前頃に述べたよう

に複雑にかつ精巧に制御された，種々の調節遺

伝子の作用が重要な役割をする玉5）。このよう

に，HIVの複製・増殖に特異的で，細胞の増

殖には直接影響を与えないようなステップを

44 中 島 秀 喜

Anti−HIV activity assay（HIV−1 and／or HIV−2）

       羅  ㌦  離

試験物質

一次スクリーニング

標的細胞

パラメーター

試験方法

MT−4細胞

HIV感染による細胞傷害の阻止

MTT試験

No

効係数（SI）＞10

STOP

Yes

二次スクリーニング

標的細胞

パラメーター

試験方法

MT−4細胞

田V感染によるウイルス抗原タンパク質発現の阻止

間接蛍光抗体法、FACS解析

No

効物質の選別

STOP

Yes

抗HIV活性確認試験

標的細胞

試験方法

MT−4細胞

プラーク形成阻止試験

MOLT−4、他ヒトT細胞株

蛍光抗体法、ウイルス抗原発現阻止試験

末梢血単核球細胞

p24（ウイルスコアタンパク質）発現阻止試験

U937

蛍光抗体法、ウイルス抗原発現阻止試験

末梢血マクロファージ

p24（ウイルスコアタンパク質）発現阻止試験

CD4÷HeLa細胞

p24（ウイルスコアタンパク質）発現阻止試験

フォーカス形成阻止試験

図6．抗HIV活性物質スクリーニング試験のフローチャート．

狙って薬剤をデザインしていくのが，抗ウイル

ス物質開発のストラテジーである。

皿抗HIV活性測定試験方法

 抗HIV活性を加腕ro試馬奥で評価するには，

細胞培養のテクニックを主として用いることに

なる。ここで用いる方法は，合理的に抗HIV

活性の評価を進めるために考慮しなければなら

ない幾つかの必要な要素がある。例えば，①同

時に多くのサンプルを，再現性良く評価できる

こと，②判定までの培養i期間が短期であること，

③ウイルス複製の全ステップを反映しているこ

と，④可能な限り加漁・での感染状況を反映

していることなどである。これらに加えて，多

領域にわたる多くの試験物質の申から抗HIV

物質としての可能性があるものをセレクトする

スクリーニング試験においては，低コストでな

おかつ客観性の高い試験方法が望まれる。これ

らのポイントを満足するものとして，われわれ

は，HTLV−1陽性ヒトT細胞株であるMT−4

細胞を感染標的とした感染系を抗HIV活性測

定試験のスクリーニング法として，下記に述べ

るような手順で活性物質の検索を行っている

（図6）。 ユ）一次スクリーニング試験’（CPE抑制試験）

 試験物質の抗HIV活性を調べる最初の加

沈ro試験として， HIV感染によって引き起こ

される細胞傷害（CPE）の阻止力を示標にする。

H：IVに感染したMT−4細胞で見られるCPE

は，軽度の空胞状変性を伴う細胞変性である。

これらは，通常トリパンブルー染色を行い，生

細胞数を顕微鏡的観察で測定することで判定さ

れる。しかし，この方法は煩雑で，特に多数の

サンプルの活性を評価するのには向いていな

い。われわれは，HIV感染MT−4細胞を，種々

の濃度の試験物質を加えて96穴マイクロタイ

タープレートで培養し，これをMTT（3一［4，5− dimethylthlazoL2−yl］一2， 5−diphenyltetrazolium

bromide）法で判定している。 MTT試薬は生細

胞に取り込まれると，黄色から紺青色をした

formazanの結晶となる（図7）16）。各穴に析

出したformazan結晶をTriton X／isopropanol

で溶解させ，細胞培養液の色調をODリーダー

で測定し，非感染細胞のそれと比較することで

CPEの程度を判定する（図8）17）。我々の研

究室では，これらの実験操作をコンピューター

コントロールしたワークステーションを用いて

自動化し，一度の試験で数十から100件体にお

よぶ試験物質を同時に評価可能なシステムを作

ノ、

麟〃N  N

   CH3

  N

  ＝

  N

日 一

N−N擁C

く〕〔

CH3

CH3

3一（4，5−dimethア1thiazol−2一ア1）一2，5−

diphenアltetrazolium bromide（MTT）

for1皿azan

Cθ11ロ1ar rθdαc’fo刀of MTTω∂わ1召e fbmlaz∂刀．ρro（1〃。’

      図7．MTT試薬およびformazanの構i造．

46 中 島 秀 卜

い、1∼（声墾（ノビ’

         へ

●●・◎◎◎◎◎◎醐●iΣ）

適◎σ◎σ◎◎●C●惚・

図8．硫酸多糖体のデキストラン硫酸を用いた抗HIV活性測定試験の結果    上3列はHIV感染MT−4，下3列は非感染MT−4細胞を種々の濃度の薬剤とともに培養した後，    MTT試薬を加えた．デキストラン硫酸を1．6μg／mZ以上加えた場合， HIV感染による細胞傷害（CPE）    を完全に阻止して，MT−4細胞は非感染の場合と同様にMTTをformazanに変換し，培養液は青褐    色に変色している． 図9．抗HIV活性試験を行っているワークステーション    コンピューターコントロールしたワークステーションを用いて，試験物質の希釈や    MTT試薬処理などの作業を自動化している．また，測定機器もコンピューターコ    ントロールされ，これらのシステムを使用することで，一度にユ00サンプルにもお    よぶ試験：物質の評価が可能である．

り上げている（図9）18腎19）。

2）二次スクリーニング試験（HIV抗原発現抑

f昔u言丸匿灸）

 HIVに感染した細胞は， HIVの複製にとも

なってウイルス特異的抗原タンパク質を発現す

るようになる。このHIV抗原陽性細胞率を，

HIV抗体陽性血清を一次抗体とした間接蛍光

抗体法で判定することで定量的に表わすことが

できる。これには，蛍光顕微鏡による観察と，

1asedow cytoHuorometryによる測定とを併せ

て判断し，客観的に評価している18119）。

3）抗HIV活性確認試験

 上記の試験で抗HIV活性が認められた物質

に関して，その効果の確認を行う。これには，

感染標的細胞をMT遜細胞以外のヒトT細胞

株，例えばMOLT−4， CEM， H9細胞や正常

ヒト末梢血単核球細胞（PBMC），さらには単

球／マクロファージ系細胞学のU937細胞やヒ

ト末梢血マクロファージ，CD4陽性HeLa細

胞などを用いている．また，使用するウイルス

も必要に応じて，HIV一ユのみならずHIV−2

株や，HIV感染症患者から分離された新鮮分

離ウイルスを用いる．判定方法は，ウイルス抗

原の発現抑制や培養上清中に遊離したHIV−1

のコアタンパク質であるp24量を酵素抗体法

（antigen capture ELISA）で測定する方法な

どを用いている．また，MT辺細胞を用いたプ

ラーク形成抑制試験20）やCD 4陽性HeLa細胞

を用いたフォーカス形成抑制試験21’22）などを

用いて抗ウイルス活性の評価を行うことも可能

である．

W抗HIV活性物質の作用機序の解明

 上記の試験で抗HIV活性が認められた物質

に関して，その作用機序を解明するためにさら

に詳細な実験を行う必要がある．図10に示した

フローチャートは我々が行っている種々の実験

系で，ウイルスの複製の各々のステップを反映

するような実験を組み合わせて試験物質の作用

機序を決定しようと試みている。

1）ウイルス吸着阻害試験

 HIV感染の一番最初のステップは，ウイル

スエンベロープ糖タンパク質gp120と標的細胞

膜表面のCD 4分子との結合である。この段階

を試験物質が阻害するか否かを知るために，濃

縮したHIV粒子をCD 4陽性細胞に暴露させ

てウイルス粒子の吸着をさせた後，抗HIV抗

体陽性血清を一次抗体，FITC標識抗ヒトIgG

抗体を二次抗体とした，間接蛍光抗体法を行い， laser How cytometryでこれを測定している。

HIVが吸着した細胞では，蛍光強度が非吸着

のものより強くなる。この反応に，種々の濃度

の試験物質を加えた場合，吸着阻害作用があれ

ば蛍光強度は非吸着こそれと違わないことにな

る。この蛍光強度を比較することで，吸着阻害

作用の程度を評価し得る23）。また，二次抗体

として1251標識抗ヒトIgGを用いたラジオイム

ノアッセイでも同様に評価できる24＞。

2）多核巨細胞形成抑制試験

 HIV感染は， CD 4陽性細胞にcell−freeの状

態で感染するほかに，既にHIVの感染が起こ

り，プロウイルスDNAが組み込まれてしまっ

て持続感染細胞となったものが，その細胞膜表

面に出現したgp120と未感染細胞膜表面のCD

4分子と結合して細胞融合を呈する，cell−to−

cellでの感染の拡大が起きる場合とがある。こ

のとき，融合した細胞はさらに周囲の未感染細

胞とも融合を繰り返し，多核巨細胞を形成する

ことになる。われわれは，HIV持続産生細胞

であるMOLT−4／HIVと非感染のMOLT−4細

胞とを混合培養すると，速やかに細胞融合が起

こり，顕著な多核巨細胞が認められることを利

用して，この感染系に試験物質を加えて，cell−

to−ce11感染による細胞融合の阻止，すなわち

gp120とCD 4との結合阻害作用の評価を行っ

ている25−27）。 3）Time of addition試験

 試験物質の作用部位を予測する方法の一つと

して，薬剤をHIV感染後少しつつ時問をずら

して加え，ウイルス暴露後どれ位の時間までに

薬剤処理をすれば有効な抗ウイルス活性が得ら

48 中 島 秀 喜 抗磁V活性作用機序の解析 吸着ノ多核巨細胞形成阻止試験 使用細胞 パラメーター 試験方法 使濡細胞 パラメーター・ 試験方法 M74細胞 ウイルス粒子の細胞餓畿面への吸砦阻止 FACS郷厨 または ラジオイムノアッセイ MOLT・4およびMOん7・4／HW細麹 総滋融合による多嫉巨峰勘形成の阻止 願置畳鰻察、恥3io購1轟dexの算幽 Yo5 _{ウイルス粒子の級貌または}  接黛細胞形成組止の匿 着阪害物 賊0 ウイルス侵入阻止試 僕用細麹 手技 パラメーター 試験方法 MT・4細痴 びCでウイルスの吸着まで完了させた後、試 験物質を謂えてから、37●Cに温度を上げて 培養を陪冠する ウイルス抗源タンパク質発現阻止 閥撲蛍光抗体法 No イルス抗漂の発 入段階の阻害物 Yes プロウイルスDNA出現阻止試験（逆転写段階の醒轡） 徒吊細灘 パラメーター 試験方法

器盤灘謬末繍球細灘ジ

No 逆転写酵素（RT）活性試験 ロウイルスDNAの隆 No 核段階の限寄物 RT活性掬瀬作用 Yes Yes 転写ノ翻訳段階の阻害 焼串細胞 手按 パラメーター 賦験方法 U三細嵐、ACH・2細胸、 J22・HL60細滋 上1巳H＝V慢性感染細胞をTPAやTNFで刺激し、 試験物質を加えて培養する ウイルス抗原タンパク質の出現、 培養上溝中の構Vコアタンパク質量 闇接蛍光抗体法、p24 EL匿SA Ye5 ハイブリダイゼーション No 沢段階の隠讐物 聾君V潮印RNAの薩 Yes 脚写段階の阻害物 ウイルス抗灘タンパク質、    24量の低下 _{試験物質の細胞内取り込みの確認}  MT・4細滋、 MOLT・4細灘、 MOLT・4／HW細胞、  U1細胞、 ACH・2細胞、∫22・HL60細麹  細胞をF匿TC標繊した試験物質とともに培養し、  細胞内への物質の取り込みを、共魚点レーザー  走査型顕微鏡で規察する プロセッシングノグリコシレーション段階の阻害 僕用細胞 pラメーター 詞ｱ方怯 HIV感染MT4細胞、 MOLT4／mV細胞、U工細胞、ACH・2細胞、322。H二60細胞 Eイルス特異的タンパク質の検出ウエスタンプロット法 ﾆ疫沈峰反応試験 Ye8 抗HWポリクローナル抗体  抗p24モノクローナル抗体  抗gp120モノクローナル抗体 @      Ye8       Yeε HWタンパク質        24の減少  訳阻讐物一    プロテアーゼ@    害物No 賢0       賊O リコシレーション @ 阻書物質 ウイルス粒子の組み立て、出芽阻害物質 図10．抗HIV活性物質の作用機i序解明のための試験方法のフローチャート     これらの試験をみ合わせ，その結果を総合的に判断することで，薬剤の活性部位を想定していく．

れるかという，いわゆるtime of addition試験

を用いることがある。感染したウイルスの複製

は，図5に示したステップを追いながら，時間

の経過とともに進むはずである。まず，すべて

の細胞に感染が起きるのに十分な量のウイルス

量（multiplicity of infection；MOI＞1）を0。C

で処理する。この状態では，ウイルスの吸着は

起こっているが，細胞内への侵入は起こってい

ない。その後，温度を37。Cに上げるとともに，

時間を追って薬剤を加え，培養を行う。20時間

以上培養を行うと，抗HIV物質を加えていな

い場合，すべての感染細胞にはウイルスタンパ

ク質の発現がみられるが，抗HIV物質を加え

たものは，作用部位の違いに応じてウイルスタ

ンパク質の発現抑制が認められる，薬剤処理の

タイミングに違いがみられる。ウイルスタンパ

ク質の発現は，間接蛍光抗体法で確認できる。

また，プロウイルスDNAの出現を

polymerase chain reaction（PCR）法で評価し， 感染の程度を評価することもできる18）。

4）逆転写酵素（RT）活性阻害試験

 RTは，ρo♂遺伝子によってコードされた

H：IV自身が持つ酵素で，この働きでウイルス

RNAはDNAへと逆転写される。抗HIV物質

がRT活性阻害作用があるか否かは， RT活性

阻害試験で評価する。これには，detergent処

理したHIV粒子や， recombinantのRTを用

いて，poly（rA）．01igo（dT）12．18をテンプレー

ト・プライマーとしたアッセイ方法で判定して

いる28・29）。

5）プロウイルスDNAの転写以後の段階での

阻害作用

 感染細胞の染色体に組み込まれたプロウイル

スDNAは，細胞の増殖にともなって複製され，

mRNAへ転写される。そして，ウイルスタン

パク質の前駆体が作られ，cleavageや

glycosylation， myristylationなどの種々の修飾

を受けて，コアタンパク，マトリクスタンパク

やエンベロープ糖タンパク質などが形成され

る。プロウイルスDNAやmRNAは，試験：物

質とともに培養したHIV感染細胞をPCR法

で調べて検討する。

 ウエスタンイムノブロット法や免疫沈降法

（RIP）もまた，ウイルス構造タンパク質が形

成されているか否かを判定するのに重要な方法

である。もし，試験物質にHIVのプロテアー

ゼ活性やglycosylatiOnの阻害作用があるなら

ば，その物質と伴に培養したHIV感染細胞に

は，p24のような成熟コアタンパク質や正常な

gp120糖タンパク質の検出がされないことにな

るであろう。

6）転写活性化の阻害作用（HIV潜伏感染細胞

からのウイルス誘発の阻害作用の評価試験）

 H：IV感染症では図1で示したように，感染

後すぐにエイズの発症が起きるのではなく，多

くの場合数年から十数年に及ぶ無症候性キャリ

アの時期を経てリンパ節腫大症が起こり，免疫

不全に関与する種々の症状が発症してエイズへ

と進展していく。この免疫不全の増悪には腫瘍

壊死因子（TNF）やインターロイキン6（IL−6）

などのいろいろなサイトカインの関与が予想さ

れている30β1）。一方，HIV以外のいろいろな

Ce画一free HIV infec擁on

  鯵 難

    鯵鯵

CD4 Cocu薩i▼a電ion of MOLτ一4 and MOLT−4’卜｛IVcells

霧⑥＋雛⇒鯉⑥

マドム ビ き   がきソロきほ オじセ ゆほぎごゆゆ コくニ  ミ

審㊥怨圃⇒器㊥器

C◎c醸1電i▼a纏。騰ofτNF電reated UI a轟d MOLT4 cells

藩麺⑥膿⇒轡奮

図11．HIV感染拡大様式のモデル    加溺ηoで起きていると考えられる感染様式   を反映するような加沈プ。の感染系を考案し，   それを利用して種々の物質の抗ウイルス作用    を評価する．

50 中 島 秀 喜 微生物（ウイルス，細菌，マイコプラズマなど）

の感染によるHIV増殖の促進作用も無視でき

ない32『34）。HIVは， T細胞のみならず単球／マ

クロファージへの感染があるが，生体ではこれ

らの細胞への感染がHIVの持続感染やほかの

標的細胞への伝播のためのりザーバーとして重

大な働きをすると考えられている35㎜37）。われ

われは，この潜伏持続感染から転写が活性化さ

れ，ウイルス感染が拡大していく状態を加漉

ブ。の試験で評価することを目的に，二つのアッ

セイ系を考案した。使用する細胞は，HIV潜

伏感染のモデルとして考えられているU138）， J22HL6039）やACH 2細胞40）である。前二者は

単球／マクロファージ系の細胞株後のものは

T細胞株にHIVを感染させ，プロウイルス

DNAの組み込みは起こっているが，ウイルス

タンパク質や粒子の発現は非常に低レベルであ

るか，検出レベル以下のものである。試験方法

は，一つはホルボールエステル（発癌プロモー

ター）の一つであるTPAでこれらの細胞を処

理してHIVを誘発させ， HIV抗原タンパク質

を指標として蛍光抗体法で測定する。もう一つ

は，生理的物質であるTNF一α存在下でU1細

胞をMOLT−4細胞と混合培養して， HIVタン

パク質を誘発したU1細胞とMOLT−4細胞と

で細胞融合を起こし，形成される多核巨細胞を

みる（図U）。この試験は，潜伏感染からHIV

の誘発，さらにCD 4陽性細胞へのウイルス感

染の拡大という，実際に加η抽。で起こってい

ると考えられる現象をカバーしている41）。

V エイズ治療薬およびその候補物質

 現在，HIV感染症治療薬として認可されて

いるものに，核酸誘導体で逆転写酵素の活性阻

害作用をもつAZT42’43）やddl， ddC44）がある。

AZT（zidovudiRe）は，チミジンの糖残基3’

位のOH基をN3に置換したもので，細胞に取

り込まれる際に感染細胞のチミジンキナーゼで

リン酸化を受ける。リン酸化されて活性型と

なったAZT−TPはHIVのRTと結合し，合

成過程にあるプロウイルスDNA鎖に組み込ま

れることで，DNA鎖の合成終結因子として作

用する45）。AZT−TPは細胞のDNAポリメラー

ゼよりRTに対する親和性が約100倍以上も強

く，そのためウイルス選択性がでる。しかし，

副作用があることも事実であり，AZT服用中

の患者に重篤な貧血や頭痛，嘔：気，嘔：吐などが

みられる46）。また，6カ月以上の長期服用患

者から，AZT耐性のウイルスも分離されてき

ている47）。さらに，本年4月にヨーロッパの

グループにより3年に及ぶAZT治療の追跡調

査の結果が報告され，当初言われていたような

AZTのHIV患者の延命効果は認められなかっ

たというようなことが判明した48）。これに関

しては，さらに詳細な臨床試験の評価を待たね

ばならないであろうが，AZTの効果に疑問が

もたれているのも事実である。ddlやddCも

AZTと同様の作用機序49＞で，特にddCはAZT

との併用使用という制限もついており，これら

核酸誘導体以外の薬剤の認可が真に期待されて

いる。現在，加η伽。試験での抗HIV活性が

確認され、臨床試験段階にある薬剤も多数ある。

その主なものを表1にまとめてみた。詳細につ

いては、各々の文献を参照されたい。 おわりに

 エイズ治療薬開発のストラテジーという題目

で，われわれが行っている種々の抗HIV活性

測定試験：，作用機序の解析方法について述べて

みた。われわれは主として，活性物質のランダ

ムスクリーニングを行い，そこで効果が認めら

れたものに関して，詳細な作用機序を検討する

という方法をとっている。しかし，生化学的，

分子構造的に効果が期待できる物質をあらかじ

め分子設計しておき，その活性を検討していく

という方法もある。それに関するものとしては、 アンチセンスオリゴヌクレオチド72−75）などが

ある。いずれの方法をとるにしても，H：IV感

染症の適当な動物モデルがない現在，加癬塑

試験での活性の評価は，抗HIV薬開発の上で

表1．初腕roおよび訪挽ηoで抗HIV作用が認められている主な物質

抗HIV活性物質

吸着・融合阻害剤

三三阻害剤

硫酸多糖体29・4％1）、

硫酸アルキルオリゴ糖52柔

可溶性CD453づ6）、 Pradimicin A 5758）、

合成ペプチドT22185％o）、

グリチルリチン61’62）

    63）

_Bicyclam

逆転写酵素阻害剤

ヌクレオシド系

非ヌクレオシド系

転写・翻訳阻害剤

AZT 42・43・64美ddI 44）、 ddC 44）、

D4T 65・66！他のdideoxynucleoside

Nevirapine67）、TIBO誘導体68）、

HEPT誘導体6黛70）、 pyridinone誘導体71）

アンチセンスオリゴヌクレオチド7芸75）

プロテアーゼ阻害剤   Ro31−895976’77）、 A−7700378）、

       SKF 10838979）、 U8174980）

グリコシレーション阻害剤

ウイルス発芽阻害剤

カスタノスペルミン81幽83）、

デオキシノジリマイシン83）

インターフェロン84・85）

52 中 島 秀 喜

重要な部分を占めることになる。本稿で紹介し

た試験方法は，世界中の多くの研究施設で行わ

れている方法でもある。しかし特筆しておきた

いのは，われわれはこれらの試験方法を合理的

に組み合わせ，一度に多数の試験物質を迅速に

かつ再現性良く，客観的に評価できるシステム

を作り上げたことである。今後われわれは，生

体内で起きる反応をより反映し，的確な活性の

評価を行える試験方法の開発を目指すととも

に，真に有効なエイズ治療薬の開発を目的とし

た，基礎医学としてのウイルス学の研究をさら

に押し：進めていくつもりである。 謝 辞   本を校閲していただいた、当教室主任教授の

伊藤正彦教授に深謝します。また，原稿作成を

手伝ってもらった田中玲子嬢に感謝します。 文 献 1） Barre・Sinoussi F， Chermarm J−C， Rey R，麗α♂．    Isolation of a T−lymphotroplc retrovlrus from    apatient at risk for acqulred immune de§cien−    cy syndrome 1（AIDS）． science l983；裂20：    868−871， 2）Popovic M， Samgadharan MG， Read E， Gallo    RC． Detection， lsolation， and continuous produc−    tlon of cytopathlc retroviruses（HTLVJII）from    patients with AIDS and pre−AIDS． Science    1984；丘∼24：497−500． 3）Levy JA， Hoffmann AD， Kramer SM，66αZ．    Iso｝atio擁 of lymphocytopathic retrovlrαses    from San Francisco patlents wlth AIDS． Scien−    ce 1984；225：840−842． 4）Telch N． Taxonomy of retroviruses．1π：Weiss    R，Teich N， varmus H， Cof6n J， eds． RNA    tumor viruses． Cold Spri難g Harbor Labora−    tρry・1986：25・ 5） Clavel F， Guetard D， Brun．VeziRet F，認α乙    ISOIatiOn Of a neW human retrOviruS frOm    Wes￡African patients with AIDS． Science    1986；223：343−34，6． 6）Clavel F， Guyader M， Gue重ard D，8孟α乙Molecu−    lar cloning and polymorphlsm of the human    lmmunode5clency virus type 2． Nature l986；    324：691−695． ︶ 7 ︶ 8 ︶ 9 10） 11） 12） 13） 14） 15） 16） 17） 18） 19） 20） Cullen BR， Malim MH． RegulatloR of HIV4 gene expression． Nucleic Acids Mol Bio11990； 4：176−184，． Gilmore TD． NF−kappaB． KFB1， dorsal and re． Iated matters、 Ce1茎1990・62：84王一843。        ラ Simoi H， Shida H， Maki M， H：a之anaka M． Effects of a hlghly basic reglon of human im． munode丘ciency virus Tat protein on nuclear loca1三zation， J Virol 1990；64：1803−1807． Pomerantz RJ， Trono D， Feinberg MB， Baltl， more D． Cells nonproduc毛ively lnfected with  HIV−1 exhibit an aberrant pattern of viral RNA expression：amolecular for latency． Cell  1990；61：1271−1276． De Clercq E． New promising inhibltors of the human lmmunode丘ciency virus． Antimicrob Agents：Vira11989；2：401−410． Klatzman D， Barre−Sinoussi F， Nugeyre MT，麗  α乙 Se蓋ective troP圭sm  of lymphadenopathy− assodated virus （LAV） fbr he蓋per4nducer  lymphocytes． Science l 984；312：763−766． Dalgleish AG， Beverly PCL， Clapha PR 6‘α♂． The CD4（T4）antigen is an essent｛al compo− nent of the receptor for the AIDS rαrovirus． Na￡ure 1984；3］【2：763−766． McDougal JS， Mawle A， Cort SP． Cellular tropism o｛ the human re宅rovirus HTLV− III／LAV．1． Role of T cell acdva宅ion and ex− presslon of the T4 antigen． J Immunol 1985； 135：315−3162． Haseltine WA． Repllcation and pathogenesis of the AIDS virus． J Acquir， Immune De看clency Syndromes 1980；1：217−240， Mossman T． Rapid colorimetric assay for cellu． 1ar growth and surviva1：apPlicatlon to prolif− eratio鍛 and cytotoxic assays． J Immunol Methods 1983・65：55−63．       ラ Pauwels R， Balzarini J， Baba M，8オα♂． Rapid arld automated tetrazolium−based colorlmetric assay for the detection of anti−HIV com− pounds J vlrol Methods l 988；20：309−321． Nakashima H， Masuda M， Murakaml T，6‘α♂． Ant沁uman immunodeficiency virus actlvlty of novel synthetic peptlde， T22（［Tyr．5，12， Lys−7］polyphemusin II）l a posslble lnhiblωr of virus−cell fusior［． Antlmicrob Agents Che− mother 1992・36：1249−1255．       タ Nakashima H， Muraka戯丁， Yamamoto N，6‘ αZ．Inhibition of human immunode6ciency viral replication by tannins and related com− pounds． Antivira韮Res 1992；18：91−103． Nakashima H， Pauwels R， Baba M，認α♂． Tet− razolium−based plaque assay fbr HIV−l and HIV−2， its use in the evaluatlon of antlviral

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rp es 3E} pt

Strategies for the Development ef Anti-Human

Immunodeficiency Virus Agents

Hideki Nakashima

DePart7nent ofMicrobiologl>,, Yamanashi Medical Univeisidy

The unprecedented speed with which the etiologic agent of AIDS, human immunodeficiency virus (HIV),

was isolated and characterized is truly remarkable. [lrhe discovery of some anti-KIV compounds suggested that

antiviyal chemotherapy of AIDS was feasible and opened tlie search for more potent and selective anti-HIV agents. Among those compounds, AZT, ddl and dclC have been Hcensed for the treatment of AIDS. However,

serious toxic side effects, in particular myeiotoxicity, have also been observed. The prolonged use of AZT and ddl may lead to the emergence of HIV strains with reduced sensitivity to those drugs. Under these situations, it is highly desirable to find other compounds with specific efficacy and reduced toxicity. This review will focus on the in vitro cell culture systems which are used in our laboratory for the evaluation of anti-HIV activities. Dis-cussion is also made of the prornising compounds which have been proved to have anti-HIV activity in vitro, some of which are in the preclinical testing stage.