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ウイルス感染防御機能を司るプラズマサイトイド樹状細胞
を活性化する
Lactococcus lactis subsp. lactis JCM 5805
に関する研究
藤原 大介
キリン株式会社基盤技術研究所
ウイルス感染防御機能を制御する免疫系の司令塔的な役割を果たす細胞としてプラズマサイトイド樹 状細胞が注目を集めている。本研究では、プラズマサイトイド樹状細胞活性化効果を有する乳酸菌株を探 索した。マウス骨髄細胞由来プラズマサイトイド樹状細胞を用いたスクリーニングにより、Lactococcus lactis subsp. lactis JCM 5805 がこの効果を有することを見出し、作用機序として本菌株がプラズマサイ トイド樹状細胞に認識され、活性本体である DNA が TLR9 依存性の活性化反応を引き起こすことが示 唆された。また、本乳酸菌を用いたヒトにおける pDC に対する作用についても紹介する。Key words：Plasmacytoid dendritic cell, Lactococcus lactis subsp. lactis, TLR9
総
説
＊ To whom correspondence should be addressed. Phone ： +81-45-330-9005
Fax ： +81-45-788-4042 E-mail ： d-fujiwara@kirin.co.jp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 RNA 分解酵素の発現を誘導し2）、CD8+T 細胞、Th1 細胞、 NK 細胞などの細胞性免疫を高めるなど、マルチプルな経 路を介して抗ウイルス機能を発揮する。従って pDC を欠 損したマウスにおいては、ウイルス抗原に対する CD8+T 細胞の応答反応・IFN 産生が起こらなくなるなど重篤な ウイルス抵抗性欠陥が起こることが最近確認され、改めて pDC の抗ウイルス機能における重要性が浮き彫りになっ ている3）。 1．pDC 活性化乳酸菌の探索 上記のような背景から考えて、pDC を活性化するよう な乳酸菌が仮に見つかれば、安全にウイルス感染リスクを 低減させることにつながると期待される。しかし、本研究 開始時に pDC は一般に乳酸菌を含む細菌の貪食ができず、 直接活性化されないことが報告4）されていたが、もし見 つかれば競争力ある素材となることが考えられたためスク リーニングを行うこととした。 上述のように pDC のヒト末梢血単核球に占める割合は 極少量であり、ヒト pDC を単離してスクリーニングを行 うのは現実的ではない。したがって、マウスから採取した 骨髄細胞を Flt-3L によって分化誘導した pDC/mDC 混合 培養細胞を用いてスクリーニングを行うこととした。pDC の活性化指標としては、IFN-αを用いた。31 菌種からな る計 125 株の乳酸菌株を pDC/mDC 培養細胞にそれぞれ 加熱死菌体として添加し IFN-αの産生量を測定したが、 既報通り殆どの乳酸菌株で IFN-αの産生は見られなかっ た。しかし、3 株において 100 pg/ml 以上、13 株におい て 50 pg/ml 以上の IFN-α産生が認められた（表 1）。非 常に興味深いことに 100 pg/ml 以上の産生を誘導した 3 株は全てLactococcus lactis subsp. lactis（以下 L. lactis と略す）に分類され、50 pg/ml 以上の産生誘導を示した 株は全て乳酸球菌に分類されるものであった。しかし、ほ とんどの球菌では活性は検出されなかったことから、球菌 であることは pDC 活性化の必要条件であるが、他にも必 要な要素が存在していることが示唆された。100 pg/ml 以 上の産生を誘導した 3 株のうち最も安定に pDC を活性化 し得る菌としてL. lactis JCM 5805 を選択し、以下の解析 を行った。 2． L. lactis JCM 5805 の in vitro における pDC 活性 化効果 L. lactis JCM 5805 の Flt-3L 誘導 pDC/mDC 培養細胞 表 1． マウス骨髄由来 pDC/mDC 培養細胞における IFN-α産生 誘導乳酸菌 骨髄細胞から試験管内で誘導した pDC 培養細胞に乳酸菌死菌体 を添加・培養後、上清中の IFN-α量を測定した。 図 2．乳酸菌株の pDC への添加による IFNs 誘導産生量比較 pDC 培養細胞に乳酸菌ないしは CpG-DNA を添加し、培養後 ELISA にて各種 IFNs の産生量を測定した。 * 無添加サンプルに対して p<0.05 で有意差有り。Pam3CSK4,＝ TLR2L, LPS=TLR4L, CpG-DNA＝TLR9L の各ポジティブコント ロール。対照乳酸菌＝Lactobacilus rhamnosus ATCC 53103 図 1．JCM 5805 添加による pDC 上表面分子の発現の変化
pDC 培養細胞に乳酸菌ないしは CpG-DNA を添加し、培養後 フローサイトメーターにて細胞表面マーカーの発現を観察した。 * 無添加サンプルに対して p<0.05 で有意差有り
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L. lactis JCM 5805 を経口で摂取したときにin vivo にお いて pDC の活性化が実際に起こるかどうかは、食品とし 図 4．乳酸菌の pDC による取り込みの違い pDC 培養細胞に蛍光標識した乳酸菌を添加 し、蛍光顕微鏡観察を行った。 図 3． IFN-α産生における TLR 関連 KO マウスでの JCM 5805 添加の効果 各種 KO マウス骨髄から pDC を誘導、乳酸菌ないしは CpG-DNA を添加し、 培養後 ELISA にて IFN-α量を測定した。 * 野生型（WT）マウス由来 DC における反応に対して p<0.05 で有意差有り
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 ての有効性を考えるときに大変重要なポイントである。そ こで、本菌株の加熱死菌体をマウスに経口投与したとき腸 管所属リンパ節の pDC が活性化し得るかどうかを検討し た。その結果、腸間膜リンパ節 pDC の MHC class II およ び CD86 の発現量が L. lactis JCM 5805 摂取群で有意に上 昇することが示された（図 5）。このことから本菌株の摂 取により、in vivo で実際に pDC が活性化されることが示 唆された。 5．L. lactis JCM 5805 のヒトに対する効果 これまでの結果からL. lactis JCM 5805 はマウス pDC に対して活性化効果を有することが示唆されたため、次に ヒト細胞に対する効果を検討した。ヒト末梢血単核球に対 してin vitro で本菌株を添加し pDC の活性化の有無を調 べた。その結果、図 6 に示すように 2 例のドナーどちらに おいても本菌株添加によって pDC 上の活性化マーカーの 有意な上昇が認められたが、対照菌株では変化が認められ なかった。 さらにヒトにおけるL. lactis JCM 5805 の摂取の効果を 図 6．ヒト pDC に対する乳酸菌添加効果 上段・下段にそれぞれのドナー由来 pDC の反応を示した。 ヒト pDC に乳酸菌あるいは CpG-DNA を添加後、フローサイト メーターで細胞表面マーカーの発現量を測定した。 * ** 無添加に比べてそれぞれ p<0.01、0.05 で有意差有り 図 7．JCM 5805 含有ヨーグルト摂取のヒト pDC に対する効果 健常人ボランティアにプラセボないしは JCM 5805 で発酵した ヨーグルトを摂取させ、開始前後の血中 pDC 活性化度合をフロー サイトメーターで測定した。 * 両グループ間に p<0.05 で有意差有り 図 5． JCM 5805 摂取 1 週間後の腸間膜リンパ節 pDC の活性 化度 マウスに JCM 5805 を経口摂取させた後、腸間膜リンパ節中の pDC 活性化度合をフローサイトメーターで観察した。
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Plasmacytoid dendritic cells are crucial for the initiation of inflammation and T cell immunity in vivo. Immunity, 23, 958-71 (2011).
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Lactococcus lactis subsp. lactis JCM 5805 stimulates
plasmacytoid dendritic cells which regulate anti-viral
immune system
Daisuke Fujiwara
Central Laboratories for Key Technology
1-13-5, Fukuura Kanazawa-ku Yokohama
Plasmacytoid dendritic cell is getting a lot of attention as a “commander in chief” which regulates anti-viral immune system. In this study, we screened for lactic acid bacteria which are able to stimulate plasmacytoid dendritic cell. Lactococcus lactis subsp. lactis JCM 5805 was selected by the screening using murine bone marrow-derived plasmacytoid dendritic cell. It was suggested that the strain JCM 5805 was recognized by plasmacytoid dendritic cell and TLR9-dependent activation was induced by its DNA. Effects of L. lactis JCM 5805 on human pDC are also introduced.
