Title
Extracellular matrix is required for the survival and differentiation
of transplanted hepatic progenitor cells ( 内容の要旨
(Summary) )
Author(s)
塚田, 良彦
Report No.(Doctoral
Degree)
博士（医学）甲 第797号
Issue Date
2009-03-25
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/25305
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氏名(本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与要件 学位論文題目 塚 田 良 彦(滋賀県) 博 士(医学) 甲第 797 号 平成 21年 3 月 25 日 学位規則第4条第1項該当 Extracellularmatrjxisrequiredforthesurvivalanddifferentiation
of transplanted hepatic progenitor cells
審 査 委 員 (主査)教授 柴 田 敏 之 (副査)教授 囲 貞 隆 弘 教授 原 明 論文内容の要旨 【背景･目的】 細胞外マトリックスは細胞の生･死および増殖･分化に影響する｡基底膜に類似した細胞外マト リックスであるEngelbreth-Holm-Swarm(EHS)ゲル上で培養された成熟肝細胞は,コラーゲンやプラ
スチックディッシュ上で培養された細胞に比較して,hepatocyte nuclear factor-4(HNF-4)を始め
とした転写因子の活性化を通じ,アルブミンなど肝細胞特異的機能の発現が長期間維持されること が知られている｡ 肝移植は肝不全に対する根本的治療と考えられているが,ドナー不足や外科的手術の侵襲などの 問題点がある｡そこで近年,幹細胞や骨髄細胞を用いた細胞移植の研究もなされ,肝機能の改善な ど一定の効果が認められるが,実用化には至っていない｡ 今回の研究では,EHSゲルが,分化増殖能に優れた肝前駆細胞の肝細胞への分化誘導に与える影 響について検証し,肝細胞移植の候補となり得る可能性について検討した｡ 【対象と方法】 妊娠14.5日目のC57BL/6Jマウス胎児肝よりLineagecelldepletionkitを用いて血液系細胞を 除去し,肝前駆細胞の分離を行った｡プラスチックディッシュ,EHSゲル,1型コラーゲン上にて細 胞を培養した｡培養4日目に細胞を回収し,RNAおよび蛋白を抽出し,リアルタイムPCR(TaqManProbe 法)にてアルブミン,HNト4,CytOkeratin19(CK19)のmRNAの発現量を,Westernblot法にてアル ブミン,alpha-fetoprotein(AFP),HNF-4,HNト1,CK19の蛋白発現量を比較検討した｡また,アル ブミン,CK19の蛍光免疫染色を行い,ディッシュ上の細胞塊における蛋白発現を比較した｡ 次に,ヌードマウスの皮下にgreenfluorescentprotein(GFP)トランスジェニックマウスの胎児 肝より分離した肝前駆細胞(1×105)をEHSゲル,コラーゲンゲル,DMEM/F12メディウムとともに細 胞移植し3週間後に結節を摘出し,結節のサイズを測定し,組織学的な検討を行った｡ 【結果】 EHSゲル上で培養された細胞は球状の細胞塊を形成した一方,プラスチックディッシュまたは1 型コラーゲン上で培養された細胞は扁平に伸展した形態をとり,蛍光免疫染色にて中心部の細胞は 主にアルブミンに対して染色されるのに対し,周辺部の細胞はCE19で染色され,細胞が肝細胞およ び胆管系細胞双方への分化能を有している事が示唆された｡Westernblot法による蛋白発現量の解 析では,EHSゲル上で培養された細胞は,プラスチックまたは1型コラーゲン上で培養された細胞
ー61-に比べて,アルブミンおよびAFPの発現量が増加していたが,CK19の発現量は低下していた｡HNF-4 および-1の発現量はEHSゲル上で培養された細胞で増加した｡リアルタイムPCRによる解析では, EHSゲル上ではアルブミンmRNAが,1型コラーゲン上ではCK19mRNAの発現の増加が認められた｡ これらの結果より,EHSゲルは肝前駆細胞を肝細胞へ分化させる作用を有している事が示唆された｡ GFPマウス由来の肝前駆細胞をEHSゲル,コラーゲンゲル,DMEMメディウムに懸濁のうえヌード マウスの皮下に移植し,3週間後に結節を摘出して比較検討したところ,コラーゲンゲルおよびDMEM メディウムの結節ではわずかなGFPの検出を認めたのみであったのに対し,EHSゲルでは結節内に GFP陽性細胞の存在が確認された｡また,皮下移植されたEHSゲル内の細胞に対する免疫染色では AFPの発現が認められた｡これらの結果より,EHSゲルは1nvIvoにおいても,肝前駆細胞の生存に 寄与し,肝細胞への分化を誘導する事が示唆された｡ 【考察■結論】 成熟肝細胞において,コラーゲンやプラスチックディッシュ上での培養に比べ,EHSゲル上での 培養では細胞が球状に維持され,HNF-4を始めとした転写制御因子の発現を介して,肝細胞特異的 遺伝子の発現が誘導される｡しかし,成熟肝細胞の場合,肝前駆細胞のような増殖能がないため, 肝細胞移植の候補としては不十分である｡今回の研究では,EHSゲルによって肝前駆細胞から肝細 胞への分化が促進され,成熟肝細胞の場合と同様にその機能が維持されることが証明された｡その 機序は不明だが･,成熟肝細胞と同様に肝前駆細胞の形態に変化がみられたことより,細胞骨格の変 化に伴い,HNF-4などの転写因子が活性化された結果,肝細胞への分化が誘導された可能性が考え られる｡ さらに今回,血アブFOにおいてもEHSゲルが肝前駆細胞の分化,生存維持に有用であることが確 認された｡肝細胞の皮下への移植のメリットとしては,牌周囲など外科的な手技が必要な部位への 移植や血管内投与での移植に比べて侵襲や塞栓のリスクが低く,移植細胞の除去なども容易である ことが挙げられる｡今回の研究により,EHSゲルを用いた肝前駆細胞移植が肝不全患者に対しての 有用な治療法である可能性が示唆された｡ 論文審査の結果の要旨 申請者 塚田良彦は､成熟肝細胞に対すると同様､肝前駆細胞に対しても EHSゲルがin vitro で分化誘導･維持効果を発揮することをまず確認した｡さらに肝前駆細胞をEHSゲルに懸濁しヌー ドマウス皮下に移植したところ､in vivoにおいても細胞分化が誘導されることを見出した｡この EHSゲルの効果は､肝前駆細胞自体が有する高い増殖機能と合わせ､肝細胞移植療法の有力なツー ルとなる可能性を示唆し､肝臓病学･再生医学の進歩に少なからず寄与するものと認める｡ [主論文公表誌]
Yoshihiko Tsukada,Masahito Nagaki,AtsushiSuetsugu,Yosuke Osawa,Hisataka Moriwaki: Extracellularmatrixisrequiredforthesurvivalanddifferentiationoftransplantedhepatic
PrOgenitor cells.
Biochemicaland BiophysicalResearch Communications381,733-737(2009).
