技術論文 シュアパス-LBC 保存液を用いた免疫細胞化学染色の 検討 川西なみ紀 1) 則松 良明 2) 入野 了士 3) 1) JR 広島病院診療部臨床検査科 広島県広島市東区二葉の里 ) 愛媛県立医療技術大学保健科学部臨床検査学科生体情報学講座 3) 愛媛県立医

技術論文

シュアパス-LBC 保存液を用いた免疫細胞化学染色の

検討

川西なみ紀

1)

則松　良明

2)

入野　了士

3) 1) JR広島病院診療部臨床検査科（〒 732-0057　広島県広島市東区二葉の里 3-1-36）  2) 愛媛県立医療技術大学保健科学部臨床検査学科生体情報学講座　 3) 愛媛県立医療技術大学保健科学部看護学科地域・精神看護学講座 要 旨 LBC法の一つである BD シュアパス（シュアパス-LBC）法は 3 種類（婦人科用；Gyne，非婦人科用；Red，Blue）の保 存液があり，成分がそれぞれ異なっているため，免疫細胞化学染色（免疫染色）において，抗原保持能力の差異が予測さ れる。シュアパス-LBC 標本を用いた免疫染色の適正な運用のためにも，各保存液での経時的な抗原保持能力を明らかに することとした。方法は肺腺癌での胸水 4 症例の細胞沈渣を用い，それぞれの固定保存期間（1 時間，1 週間，1 ヶ月， 3ヶ月）終了後，核内発現する 4 種類の抗体（Ki67, p53, Cyclin A, MCM7）での免疫染色を実施し，陽性率および 1 時間 を基準とした相対比率を算出した。その結果，次のことが明らかになった。①各保存液での各抗体において，経時に従い 陽性率の減少を認めるものの，一定の相関や傾向を認めなかった。②各保存液は成分が異なるにもかかわらず，経時によ る抗原保持能力に明らかな差異を認めなかった。③抗体の種類によっては保存期間 1 週間ですでに 3 割もの陽性率の低下 をみとめ，陽性率の判定結果が正確でなくなる可能性が示唆された。④今後，使用するマーカーの種類や細胞保存方法・ 期間等，さらなる諸条件の追加検討が必要である。 キーワード シュアパス-LBC，細胞固定保存液，保存期間，免疫細胞化学染色，抗原保持能力 I_はじめに 液状化検体細胞診（liquid-based cytology; LBC）法 は複数枚の標本が作製可能なため，免疫細胞化学染 色（免疫染色）の利用が多くの施設でなされている。 われわれも子宮内膜細胞診判定において，LBC 法の 一つである BD シュアパスTM（シュアパス-LBC）法 （日本ベクトン・ディッキンソン社）を使用し，細胞 形態に免疫染色を加味した判定を行っている1),2)。 しかしながら，シュアパス-LBC 法で用いられる 細胞固定保存液（保存液）には，婦人科用の BD シュ アパスTMバイアル（Gyne）と非婦人科用の BD サイ トリッチTM Red（Red）および BD サイトリッチTM Blue（Blue）の 3 種類が存在し，その成分は各々で 異なっている3)_{ため，免疫染色において，使用する} 保存液の種類に応じて抗原保持能力に差異を認める 可能性が予測される。 そこでわれわれは，日常業務でのシュアパス-LBC 法における免疫染色の適正な運用のためにも，各保 存液の経時的な抗原保持能力を明らかにすることが 重要と考え，検討を行い若干の知見を得たので報告 する。 II_{方 法} 1．対象 2015年 1 月から 2015 年 4 月の間に，三原市医師 会病院にて検査依頼のあった体腔液症例のうち，細 胞沈渣量が 500 μL 以上確保できた肺腺癌での胸水 4 （平成 30 年 1 月 23 日受付・平成 30 年 3 月 22 日受理）

症例である。

2．標本作製方法

1）3 種類の保存液（Gyne, Red, Blue）について， それぞれの細胞保存期間毎に 10 mL 用意し，各症例 での細胞沈渣 100 μL を加え，数回転倒混和した後に 室温にて固定保存した。保存期間は 1 時間（1H），1 週間（1W），1 ヶ月（1M），3 ヶ月（3M）とし，そ れぞれの時間経過後，800 g で 10 分間遠心沈殿後に 上清を除去して細胞沈渣を得た。 2）得られた細胞沈渣をシュアパス-LBC 法にて標 本作製した。標本作製手順は，細胞沈渣に精製水 3 mLを混和して作製した細胞浮遊液 500 μL をスライ ドガラス上の専用チャンバー内に分注し，標本を 5 枚作製した。塗抹標本は 95%エタノールで直ちに固 定を 10 分間行った。 3．免疫細胞化学染色

抗体は Ki67（clone：MIB-1 FLEX RTU 希釈済み抗 体，Dako 社），Cyclin A（clone：6E6，希釈倍率：

100 倍，Leica Biosystems

社），MCM7（Minichro-mosome maintenance protein7，clone：DCS-141.1，希 釈倍率：200 倍，Leica Biosystems 社），p53（clone： DO-7，FLEX RTU 希釈済み抗体，Dako 社）を用い た。染色手順であるが，内因性ペルオキシダーゼ活 性を阻止後，Cyclin A はクエン酸緩衝液（PH6.0） を，Ki67，MCM7，p53 は EDTA 緩衝液（PH9.0）を 使用し，抗原賦活（95℃，30 分）を実施した。次に 1次抗体を反応後（1 時間，室温），ヒストファイン 検出キット（ヒストファイン シンプルステイン MAX-PO：ニチレイ社）によるポリマー法にて，インキュ ベート（室温，30 分）した。その後，DAB にて発 色（ペルオキシダーゼ反応）し，標本はヘマトキシ リンで対比染色し，脱水，透徹，封入した。 4．検討方法 免疫細胞化学染色の評価は，いずれの抗体も細胞 核が茶色に染色された場合を陽性と判定し，かすか な染色や染色されない場合は陰性と判定した。標本 毎に対物レンズ 40 倍視野で無作為に選択した 10 視 野の細胞について，それぞれの陽性率を算出した。 陽性率は陽性細胞核数／標本中の総核数とした。ま た，1H の陽性率を 1（基準）とし，1W，1M，3M での相対比率を算出した。 なお， 統計解析は「R」統計ソフトウェア（バージョ ン 3.4.3，URL：http://www.r-project.org/index.html）を 使用し，Steel-Dwass test により分析した。p 値が 0.05 未満を統計的に有意とみなした。 5．倫理的配慮 本研究は三原市医師会病院の臨床研究倫理審査委 員会の審査・承認を得ている（平成 26 年 6 月 5 日， No. 260602）。 III　結 果 1．陽性率の比較 各保存液における各保存期間での陽性率と相対比 率を Table 1 に示す。 1）Ki67 全ての保存液で経時に従い陽性率の減少を認め た。Gyne および Red において 1H は 1W，1M，3M 陽性率（%）の比較 細胞固定保存液

Gyne Red Blue

Ki67 1H 70.8 ± 26.1 a, b, c 67.5 ± 24.1 a, b, c 69.1 ± 21.4 c 1W 48.1 ± 21.7 e 46.1 ± 22.0e _{e 57.0 ± 21.9} 1M 35.7 ± 21.7 38.8 ± 23.8 53.5 ± 21.7 3M 20.8 ± 19.1 21.5 ± 21.7 46.1 ± 23.1 p53 1H 80.5 ± 18.3 b, c 76.7 ± 22.4 b, c 67.8 ± 19.8 c 1W 74.2 ± 22.4 e 63.5 ± 32.1 e 62.1 ± 22.2 e 1M 60.5 ± 25.1 f 51.3 ± 29.9 f 57.1 ± 12.6 f 3M 3.5 ± 6.6 25.1 ± 28.4 21.1 ± 22.5 Cyclin A 1H 36.1 ± 22.4 b, c 32.6 ± 18.0 26.7 ± 16.8 1W 24.1 ± 14.4 23.4 ± 13.4 25.2 ± 11.6 1M 21.2 ± 12.3 22.1 ± 14.1 22.9 ± 11.9 3M 15.6 ± 11.9 19.1 ± 15.9 16.9 ± 12.7 MCM7 1H 79.6 ± 21.8 b, c 78.8 ± 20.5 a, b, c 77.0 ± 25.7 b, c 1W 62.0 ± 23.8 e 51.4 ± 27.1 59.6 ± 25.5 e 1M 43.9 ± 24.5 41.5 ± 27.3 48.5 ± 25.2 3M 29.0 ± 23.6 31.2 ± 26.7 36.1 ± 30.7 Steel-Dwass test p < 0.05 a；1H は 1W との間において有意差あり b；1H は 1M との間において有意差あり c；1H は 3M との間において有意差あり d；1W は 1M との間において有意差あり e；1W は 3M との間において有意差あり f；1M は 3M との間において有意差あり （1H；1 時間，1W；1 週間，1M；1 ヶ月，3M；3 ヶ月） Table 1 

よりも，また，1W は 3M よりも有意に高値であっ た。Blue において 1H は 3M よりも有意に高値であっ た。また，1H の陽性率を基準として 1 とすると， Gyneの 1W の相対比率は 0.68，1M は 0.50，3M は 0.29であった。同様に Red の 1W は 0.68，1M は 0.57，3M は 0.31，Blue の 1W は 0.82，1M は 0.77， 3Mは 0.66 であった。 2）p53 全ての保存液で経時に従い陽性率の減少を認め た。Gyne および Red において 1H は 1M，3M より も，また，1W および 1M は 3M よりも有意に高値で あった。Blue において 1H，1W，1M は 3M よりも 有意に高値であった。また，Gyne の 1W の相対比率 は 0.92，1M は 0.75，3M は 0.04 であった。同様に Redの 1W は 0.82，1M は 0.66，3M は 0.32，Blue の 1Wは 0.91，1M は 0.84，3M は 0.31 であった。 3）Cyclin A 全ての保存液で経時に従い陽性率の減少を認め た。Gyne において 1H は 1M，3M よりも有意に高値 であった。Red および Blue においては各期間の間に おいて，有意差を認めなかった。また，Gyne の 1W 相対比率は 0.66，1M は 0.58，3M は 0.43 であった。 同様に Red の 1W は 0.69，1M は 0.67，3M は 0.57， Blueの 1W は 0.94，1M は 0.85，3M は 0.63 であった。 4）MCM7 全ての保存液で経時に従い陽性率の減少を認め た。Gyne および Blue において 1H は 1M，3M より も，また 1W は 3M よりも有意に高値であった。Red において 1H は 1W，1M，3M よりも有意に高値で あった。また，Gyne の 1W 相対比率は 0.78，1M は 0.55，3M は 0.36 であった。同様に Red の 1W は 0.65，1M は 0.53，3M は 0.39，Blue の 1W は 0.77， 1Mは 0.63，3M は 0.46 であった。 IV_{考 察} 最近，種々の病変での判定のため，シュアパス-LBC法標本を使用した免疫染色が多くの施設で利用 されている。シュアパス-LBC 法での各保存液の成 分および作用として，Gyne はエタノール（21.7%） とメタノール（1.2%），イソプロパノール（1.1%）， ホルムアルデヒド（約 0.08%）等を含み，Red はイ ソプロパノール（23.3%）とメタノール（10.0%）， ホルムアルデヒド（0.4%）等から成り，両者ともに 溶血作用とタンパク凝集抑制作用を有する。一方， Blueはエタノール（44.0%）とメタノール（5.0%） 等から成り，溶血作用とタンパク凝集抑制作用は有 さない3)。 日常業務における LBC 標本での免疫染色は細胞 形態判定から通常，固定後 1 週間以内にはバイアル の残余検体から標本作製され，実施されるが，場合 によっては固定保存後数週後，さらに数ヶ月経た残 余検体を使用することもあると思われる。また，各 保存液の製品安全性は Gyne と Red が 1 ヶ月，Blue は 2 週間である。そのため，各保存液の成分の違い は，経時的な抗原保持能力に影響することが予測さ れた。われわれは，日常業務でのシュアパス-LBC 法における免疫染色の適正な運用のためにも，各保 存液の経時的な抗原保持能力を明らかにすることは 重要と考え，核内抗原である Ki67，p53，Cyclin A および MCM7 を用い，検討を行った。上述の 4 種類 の抗体はいずれも核内で発現するタンパク質であり， 陽性部位の検出が容易であるとともに，陽性率等が 計測し易い利点がある4)。 検討の結果，Ki67 の陽性率（Table 1）において， Gyneと Red では 1M および 3M は 1W よりもそれぞ れ有意に陽性率の減少を認めたが，Blue は 1W，1M および 3M の間でそれぞれ有意な減少は見られな かった。p53 において，全保存液の 3M は 1W およ び 1M よりも有意に陽性率の減少を認めた。Cyclin Aにおいて，全保存液の 1W，1M および 3M の間に おいて，有意差を認めなかった。MCM7 において， Gyneと Blue での 3M は 1W よりも有意に陽性率の 減少を認めたが，Red は 1W，1M および 3M の間に おいて，有意差を認めなかった。以上のことより， 各保存液での各抗体において，経時に従い陽性率の 減少を認めたものの，一定の相関や傾向は認めなかっ た。しかしながら，今回検討した抗体は，日常業務 で使用している抗体のごく一部であり，さらなる追 加検討が必要である。 各種 LBC 法の保存液を用いた免疫染色での経時 的変化についての報告は少ない。石井ら5)は 4 種類 の LBC 保存液を用いた免疫染色において，15 種類 の抗体を使用し，最長保存期間 8 週間による染色性

の経時的変化を検討した結果，安定した染色結果を 得られた抗体もあったが，核内抗原である ER や TTF-1，Ki67 では 1 週間目から明らかな染色性の減 弱が見られたと報告している。一方，城戸ら6)は Red 保存液で 5℃にて最長 6 ヶ月間の保存における陽性 率を検討した結果，6 ヶ月保存では p53 は 83%， TTF-1は 75%と，核に局在する抗原は長期保存の場 合でも比較的安定した結果が得られたと報告してい る。浅見ら7)は Red 保存液で室温にて長期保存（3 ヶ 月，6 ヶ月）した培養細胞での免疫染色の検討を行 い，Ki67 陽性率は 3 ヶ月で 67.8%，6 ヶ月で 68.0%， また，p53 は 3 ヶ月で 69.8%，6 ヶ月で 70.8%と，良 好であったと報告している。上述の報告からもわれ われの検討結果と同様，一定の傾向がみられず，保 存液や抗体による差異を認めた。 本検討においてわれわれは当初，Blue ではアル コール濃度が約 50%と，Gyne や Red（約 25%～ 35%）に比べて高濃度のため，固定作用が Gyne や Redよりも強く，長期間の抗原性の保持が可能であ ると予測した。しかし保存期間 3M において，Ki67 での Blue が Gyne や Red よりも約 2 倍の陽性率を示 したのみで，他の抗体では Blue は Gyne や Red とほ ぼ同様の結果であった。その理由について，Gyne や

Redではホルムアルデヒド（Red 0.4%, Gyne 0.08%）

を微量であるが含有していることが考えられた。エ タノール等の有機溶剤系固定液は蛋白質に親和して いる水とアルコールが置換され，蛋白質の立体構造 が変化し細胞が凝固・ゲル化する凝固型固定液であ る。また，ホルマリン等のアルデヒド系固定液はタ ンパク質分子内および分子間でメチレン架橋を形成 しタンパク質を安定化させる変性型固定液である8)。 一般的にエタノール固定は，細胞表面マーカーや細 胞骨格蛋白といった不溶性抗原の保持に適している。 一方，細胞質・核内の可溶性蛋白は，エタノールに よる脱水・脱脂固定の過程で溶出するため，アルデ ヒド系固定液が優れているとされている8),9)。した がって，Gyne や Red ではアルコールとホルムアル デヒドの相乗効果により，抗原性の減弱が防止され， Blueとほぼ同様の固定作用を呈したものと推測し た。以上のことより，シュアパス-LBC 法における 3種の保存液では成分が異なるにもかかわらず，経 時による抗原保持能力に明らかな差異を認めないこ とが明らかになった。 われわれは 1H の陽性率を 1（基準）とし，1W， 1M，3M での相対比率を算出した。その結果，保存 期間 1W において，Gyne での Ki67 と Cyclin A では 陽性率が 7 割以下に減弱していた。同様に，Red で は Ki67，Cyclin A および MCM7 において陽性率が 7割以下に減弱していた。Blue では全ての抗体で陽 性率が 7 割以上であった。このことは抗体の種類に よっては保存期間 1W ですでに 3 割もの陽性率の低 下をみとめ，陽性率の判定結果が変わってくる（正 確でなくなる）可能性を示唆していると考えられた。 上述の結果を受けて，抗原性の長期保持には固定液 保存の際の温度も重要と思われた。城戸ら6)は Red 保存液を 5℃で保存し，6 ヶ月保存でも核抗原は比較 的安定した結果が得られたと報告している。Sauer10) らは ThinPrep-LBC 保存液で作製した標本を−20℃と −74℃で 3 ヶ月から 6 ヶ月保存し，ER および PgR の 免疫活性は不変であったと述べている。したがって， 今後ますますの利用が予測されるシュアパス-LBC 法における免疫染色の日常業務における運用のため に，さらなる諸条件の追加検討が必要であると考え る。 Ⅴ　結 語 現在，本邦では数社からの LBC 法があり，保存液 の成分はメーカーによって異なる。本検討は LBC 法 の一種であるシュアパス法での保存液を用いたが， その結果からも，免疫染色の運用に際しては，保存 液の特性を十分理解した上で，使用するマーカーの 種類や細胞保存方法・期間などの条件設定を行うこ とが望まれる。 ■文献

 1) Norimatsu Y et al.: “Diagnostic utility of phosphatase and tensin homolog, beta-catenin, and p53 for endometrial carcinoma by thin-layer endometrial preparations,” Cancer, 2008; 114: 155–164.  2) Norimatsu Y et al.: “Expression of immunoreactivity of nuclear findings by p53 and cyclin a in endometrial cytology: Comparison with endometrial glandular and stromal breakdown and endometrioid adenocarcinoma grade 1,” Diagn Cytopathol, 2013; 41: 303–307.

 3) 川西 なみ紀，他：「BD 液状化検体細胞診用保存液における 血液の影響に関する基礎的検」，医学検査，2015; 64: 475–481.  4) 則松 良明，他：「子宮内膜腺間質破綻における化生変化の免

疫細胞化学的検討」，愛臨検技会誌，2017; 36: 23–27.  5) 石井 喜雄，他：「各種病変における LBC の免疫細胞化学的検 討―免疫染色性の経時的変化を中心に―」，日臨細胞誌，2011; 50: 109.  6) 城戸 貴之，他：「サイトリッチレッドによる保存期間が LBC 検体を用いた免疫細胞化学染色に及ぼす影響」，日臨細胞誌， 2017; 56: 394.  7) 浅見 力也，他：「各種細胞保存液を用いた場合における細胞 の経時的変化―形態・免疫細胞化学・分子病理学的検討―」， 日臨細胞神奈川県支部会誌，2011; 16: 21–32.  8) 名倉 宏，他：「第一章　総論　IV．組織・細胞の固定」，改 訂四版　渡辺・中根の酵素抗体法，82–99，学際企画，東京， 2002.  9) 堤 寛：「免疫染色のトラブルシューティング」，組織細胞化学 2011―第 36 回組織細胞化学会講習会，209–218，日本組織細 胞化学会（編），学際企画，東京，2011.

10) Sauer T et al.: “Liquid based material from fine needle aspirates from breast carcinomas offers the possibility of long-time storage without significant loss of immunoreactivity of estrogen and progesterone receptors,” Cytojournal, 2010; 7: 24.

本論文に関連し，開示すべき COI 状態にある企業等はありません。

Technical Article

Study of immunocytochemical staining using preservative solution

with SurePath

TM

_-LBC

Namiki KAWANISHI1)_{Yoshiaki NORIMATSU}2)_{Satoshi IRINO}3)

1)Department of Laboratory Medicine, JR Hiroshima Hospital (3-1-36, Futabanosato, Higashi-ku, Hiroshima 732-0057, Japan)

2)Medical Technology, Facuity of Health Sciences, Ehime Prefectural University of Health Sciences 3)Department of Nursing, Faculty of Health Sciences, Ehime Prefectural University of Health Sciences

Summary

The BD SurePathTM _{as a liquid-based cytology system has three types of preservative solution for cellular fixations}

(gyne for gynecologic materials, and red and blue for nongynecologic materials). Differences in their capability for antigenic preservation are expected in immunostaining because the three preservative solutions have different ingredients. The aim of this study was to determine the capability of each preservative solution for sequential antigenic preservation. Cellular sediments of pleural effusion from four cases of lung adenocarcinoma were stored for four different periods (1 hour, 1 week, 1 month, and 3 months). After each period, immunostaining of four markers (Ki67, p53, Cyclin A, and MCM7) was performed, and positivity rate was calculated. From the results, the following became obvious: (1) No consistent correlation was recognized in each marker with each preservative solution, although a decrease in positivity rate was recognized after each period. (2) As for the capability for antigenic preservation, no clear difference was recognized. (3) Because a decrease in positivity rate of 30% was found in a period of one-week preservation with an antibody, the possibility of incorrect decision on positivity was suggested. (4) After this, additional examination of cellular preservative methods using many types of markers that are used is necessary, and the development of an original immunostaining protocol is desired.

Key words: SurePath-LBC, preservative solution for the cellular fixations, cellular preservative period,  immunocytochemical staining, ability for sequential antigenic preservation