低濃度の有機物存在下におけるオゾン水の新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)に対する不活化効果
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(2) Vol . 24No. 1. り6),環境表面に付着したウイルスの不活化は,重要. ウイルスを,多重感染度( 一つの細胞に対して感染. な感染予防対策の一つである。SARSCoV2を不活. させるウイルス粒子数) 0. 01の条件で感染させた。37. 化する消毒薬として,アルコールや界面活性剤が知. MCO18AI C; ℃に設定したCO2インキュベーター(. られている が,最近オゾン水によるSARSCoV2. Pa na s oni c ,Os a ka ,J a pa n) にて5%のCO2存在下で48時. の不活化効果が報告された 。. 間培養後,全ての上清を回収した。1, 700×gで5分間. 7, 8). 9). オゾン水は極めて強い酸化力を有しており. ,. 遠心後,上清を培養ウイルス液とした16)。. 10, 11). 低濃度( 0. 1~1mg/ l ) で短時間( 数秒~10分) のオゾン 水処理が,様々なウイルスに対して不活化効果をも たらすと報告されている. 2.3. ウイルス濃縮とタンパク質濃度測定. 。一方で,オゾン水は. ウ イ ル ス の 濃 縮 は pol ye t hyl e ne g l yc ol ( PEG) 沈殿. 環境因子の影響を受けやすく,特に有機物などの還. 法17)を一部改変して行った。培養ウイルス液をその. 元剤の存在はオゾンの分解を速めて有効オゾン濃度. 3分の1量のPEG溶液( 32% PEG8000,2 . 4% Na Cl ) と. の減衰を招くことが知られている. 。痰や唾液な. 混合し,4℃で一晩静置した。15, 000×gで20分間遠. どの分泌物と共に体外に放出されるSARSCo V2を. 心後,沈殿を培養ウイルス液の10分の1量のリン酸. 取り巻く環境因子は多岐に渡ることから,ウイルス. 緩衝液で再懸濁した。再懸濁液を用いて再度ウイル. が存在し得る様々な環境( 例えば,飛沫が付着した. ス濃縮を行い,最終的に培養ウイルス液の100分の1. 床や壁,唾液が付着した食卓や食器,汚染手指が接. 量のリン酸緩衝液で再懸濁したものを濃縮ウイルス. 触した環境表面など) を想定してオゾン水の有効性. 液とした。 濃縮ウイルス液はBCA法( BCA pr ot e i n. を評価すること,更には様々な環境に応じてオゾン. a s s a y ki t ;The r mof i s he rs c i e nt i f i c ) により,タンパク. 水の使用条件を設定することが重要な課題である。. 質濃度を測定した。. 1214). 11, 14). SARSCoV2に対するオゾン水の不活化効果の報告. 9). では,有機物の影響に関しては言及されておらず,. 2.4. ウイルス力価の測定. 有機物濃度とSARSCoV2を不活化するために必要. ウイルス力価の測定はTCI D50法を用いた18)。96穴. なオゾン濃度の関連性については未だ不明である。. プレートにVe r oE6/ TMPRSS2細胞を播種し,コンフ. 本研究では様々な環境におけるオゾン水の有効性の. ル エ ン ト の 状 態 に し た 。 ウ イ ル ス を 2% FBSと. 評価と使用条件の設定に向けた基盤知見の創出を目. 1mg/ mlG418を添加したDMEMで10倍階段希釈し. 的として,環境因子,特に有機物の影響を抑えた条. た。希釈したウイルスを細胞に接種し,CO2インキュ. 件におけるSARSCoV2に対するオゾン水の不活化. ベーターにて培養した。72時間後,細胞をリン酸緩. 効果を評価した。. 衝液で洗浄してメタノールで固定した。その後0. 5 %メチレンブルーで染色し,細胞の生死を判定した。. 2.実験方法 2.1. Re e dMue nc h法を用いてウイルス力価を算出した19)。. ウイルスと細胞. SARSCoV2J PN/ TY/ WK521株は国立感染症研. 2.5. 究所( Tokyo, J a pa n)よ り 分 与 さ れ た 。 Ve r oE6/. オゾン水の生成. オゾン水の作成には大別して気中での高圧放電や. TMPRSS2細胞 はJ CRB細胞バンク( Os a ka ,J a pa n) よ. 特殊な紫外線照射によって発生させたオゾンガスを. り購入し,5 %ウシ胎仔血清( FBS) と1 mg/ mlG418. 水に溶解させ生成する方式と,水を電気分解するこ. ( Na c a l a i ,Kyot o,J a pa n) を添加したDul be c c o' smodi -. とによって生成する電気分解方式の二種類が知られ. f i e dEa gl e ' sme di um( DMEM;The r mof i s he rs c i e nt i f i c ,. ている20)。本研究では陽極としてオゾン生成に適し. Wa l t ha m,MA) で培養した。ウイルスを用いた実験. たダイヤモンド電極を,陰極としてチタン電極を備. は全て大阪府立大学大学院生命環境科学研究科のバ. えた電気分解方式のオゾン水生成装置( Oz oneWa t e r. イオセーフティーレベル3実験室にて行われた。. Ge ne r a t i ngDe vi c e ,Pa na s oni c ) を使用した。本装置は,. 15). 通水させながら電極間に直流電圧をかけることによ 2.2. り,水からオゾン分子を生成し,効率よく水中に溶. ウイルス培養. コンフルエントのVe r oE6/ TMPRSS2細胞に,2 %. 存させることができる特徴を有している21)。オゾン. FBSと1mg / mlG418を添加したDMEMで希釈した. 水の原水には純水( pH 7. 0) を用い,水温は室温を想. 室内環境[2021]. 14.
(3) Vol . 24No. 1. 定して23±3℃とした。純水を原水として生成され. 抑えるため,ウイルス濃縮を介して感染培地をリン. たオゾン水の20℃付近における減衰率は,5分間で. 酸緩衝液に置換した。不活化試験に用いたウイルス. 約10%と報告されている ことから,オゾン水は生. D50/ ml ) のタンパク質濃度は330・g/ ml 液( 1×107 TCI. 成後5分以内に使用された。また,作用させたオゾ. であった。. 22). ン水の濃度を確認するため,使用と同時に吸光光度. 本条件下において,0. 5 mg/ l 濃度のオゾン水の. 計( DR900;Ha c h,Love l a nd,CO) を用いてインジゴ. SARSCoV2に対する不活化効果を評価した( Fi g.. 比色法によって濃度を測定した. 1A) 。オゾン水をウイルスの9~99倍量添加するこ. 。. 23, 24). とで,タンパク質の終濃度が異なる4群( 3 . 3,6 . 6, 2.6. 16. 5,および33・g/ ml ) を作製し,3分間反応させた。. 不活化試験. 濃縮ウイルスの力価は5~10 ×10 TCI D50/ ml であっ. タンパク質濃度33・g/ ml 群では,純水を添加した対. たため,滅菌水で1×10 TCI D50/ ml に調製したもの. 照群と比較して,生残ウイルス量の有意な低下が認. を使用した。反応時間ごとに試験管を用意し,下記. められた。またタンパク質濃度の低下に比例してウ. のとおりにウイルスとオゾン水を混合し,室温で一. イルス力価の低下は顕著となった。タンパク質濃度. 定時間静置した。( 1) 0. 5mg/ l 濃度のオゾン水をウイ. 3. 3・g/ ml 群では,ウイルス力価は検出限界未満となっ. ルスの9~99倍量添加することで,タンパク質の終. た。以上の結果より,0. 5mg/ l 濃度のオゾン水を3分. 濃度が異なる4群( 3. 3,6 . 6,16. 5,および33・g/ ml ) を. 間処理することで,タンパク質の終濃度が33・g/ ml. 作製し,3分間反応させた。( 2) 0. 1~0. 5mg/ l 濃度の. 以下のSARSCoV2は有意に不活化されることが明. オゾン水をウイルスの99倍量添加( タンパク質の終. らかとなった。. 7. 7. 濃度3. 3・g/ ml ) し,30秒~3分間反応させた。その後. Fi g.1Aの結果,ウイルス力価が検出限界未満と. 全ての試験管に0. 1Mチオ硫酸ナトリウムを混合液. なったタンパク質濃度3. 3・g/ ml 群に注目して,更に. の10分の1量添加し激しく混和することで,反応を. 低濃度で短時間におけるオゾン水の不活化効果を評. 停止した。その後,ウイルス力価を測定した。対照. 価した( Fi g.1B) 。反応30秒で対照群と比較して,0. 1. としてオゾン水生成装置に非通電状態で通過させた. mg/ l オゾン水における生残ウイルス量は約1000分の. 純水を使用して,同様の実験を行った。 再現性を. 1,0. 35mg / l 以上のオゾン水では約10 000 分の1 であっ. 確認するため, 実験は3回繰り返された。オゾン水と. た。またいずれの濃度のオゾン水処理においてもウ. チオ硫酸ナトリウム混合後にはオゾンが検出され. イルス力価の有意な低下が認められた。以上の結果. ないこと,チオ硫酸ナトリウム単独ではVe r oE6/. より,タンパク質の終濃度が3. 3・g/ ml であれば,極. TMPRSS2細胞に対する細胞傷害性がないことは,. めて低濃度である0. 1mg / l のオゾン水を30秒間処理. あらかじめ確認された。. することで, SARSCoV2が有意に不活化されるこ とが明らかとなった。. 2.7. 本研究において,0. 5mg / l オゾン水はタンパク質. 統計処理. 2群の差の検定には,スチューデントのt 検定を用. 濃度3. 3・g/ ml のウイルスの力価を10000分の1に低. いた。多重検定にはTuke yKr a me r 法を用いた。p値. 下させたが,33・g/ ml では力価の低下は10分の1に. が0. 05未満を統計学的に有意とした。. とどまった( Fi g.1A) 。純水と比較して汚泥水中の ウイルスの不活化処理には,より高濃度のオゾンを. 3.結果と考察. より長時間反応させることが必要であると報告され. 本研究では,生成されたオゾン水の使用前におけ. ている14)。これらの結果から,SARSCoV2において. る減衰を低く抑えるため,pH7. 0の純水を原水とし. もウイルス液中に含まれるタンパク質などの有機物. て23±3℃でオゾン水を生成し, その後5分以内に使. によりオゾンの減衰が起こり,不活化効果が減弱す. 用した。また,設定したオゾン濃度0. 1,0. 2,0. 35,. る可能性が示された。SARSCoV2はヒトの唾液や. および0. 5mg/ l に対し,使用時の実測値はそれぞれ. 痰などの分泌物とともに環境中に放出される。唾液. 0. 13±0. 04,0. 20±0. 03,0. 35±0. 08,および0. 49±. や痰のタンパク質濃度は健常人では0. 055~2. 5mg/. 0. 08mg / l ( 平均±標準偏差) であった。更にウイルス. ml と報告されている25-27)。また呼吸器炎症時には喀. 培養液に含まれるタンパク質によるオゾンの減衰を. 痰中アルブミン濃度が約3倍に28),歯周炎時には唾液. 室内環境[2021]. 15.
(4) Vol . 24No. 1. A. *. 7. ** **. 6. log10TCID50/ml. 5 0.5 mg/l aqueous ozone. 4. distilled water 3 2 #. 1 33. 16.5. 6.6. 3.3. µg/ml viral protein concentration. B. 6. 4 **. aqueous ozone. **. **. distilled water. **. **. **. mg/l ozone 30 sec. **. mg/l ozone. dH2O. 0.5. 0.35. 0.1. # dH2O. 0.35 0.5. # # 0.1. # dH2O. #. 0.5. 0.2. 0.1. 1. 0.35. 2. 0.2. 3. 0.2. log10TCID50/ml. 5. mg/l ozone. 1 min. 3 min. Fi g .1 .I n a c t i v a t i o no fv i r u s e se x p o s e db ya q u e o u so z o n e .( A)SARSCo V2wa si n c u b a t e dwi t h0 . 5mg / la q u e o u so z o n eo r d i s t i l l e dwa t e ri ns e v e r a l v i r a l p r o t e i nc o n c e n t r a t i o n sf o r3mi n . ( B)SARSCo V2( 3 . 3・g / ml p r o t e i nc o n c e n t r a t i o n )wa si n c u b a t e d wi t ha q u e o u so z o n eo rd i s t i l l e dwa t e rf o r3 0s e c ,1 ,o r3mi n .Af t e rt h emi x t u r ei sn e u t r a l i z e db ys o d i u mt h i o s u l f a t e ,t h ev i r u s e s we r ei n f e c t e dt oVe r o E6 / TMPRSS2c e l l sa n dt i t r a t e db yTCI D50a s s a y .Da t ar e p r e s e n tt h eme a n s+SDf r o mt h r e ei n d e p e n d e n t e x p e r i me n t s .#i n d i c a t el e s st h a nt h r e s h o l d .* ,p < 0 . 0 5 ;* * ,p < 0 . 0 1s i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tf r o md i s t i l l e dwa t e r . 中タンパク質濃度が約1. 7倍になる25)ことから,呼吸. た付着箇所や状況で有機物量は様々であることが予. 器の炎症症状を呈するCOVI D19患者から放出され. 想される。従って,本研究の成果だけでは特定の環. る唾液や痰のタンパク質濃度は,健常人と比較して. 境に必要なオゾン濃度や水量,作用時間を導き出す. 高いことが予想される。感染者の咳やくしゃみ,ま. ことは困難である。今後,本研究で示された成果を. たは手指等を介して環境表面に付着したウイルスに. 基盤として,SARSCoV2を取り巻く様々な周囲環. 対するオゾン水の使用方法としては散布や拭き取り,. 境を想定したオゾン水の有効性の評価,更には様々. 流水による洗浄などが想定される。しかし飛沫中の. な環境に応じたオゾン水の使用条件の設定が必要で. ウイルスを取り巻く有機物量には個人差があり,ま. ある。. 室内環境[2021]. 16.
(5) Vol . 24No. 1. 謝辞. c ompa r e dwi t hSARSCoV1,N.Engl .J .Me d. , 382,15641567( 2020) .. SARSCoV2を分与頂いた国立感染症研究所に感. ,Pf a e nde rS.a ndSt e i nma nnE. : 7)Ka mpfG. ,TodtD.. 謝申し上げます。. Pe r s i s t e nc eofc or ona vi r us e soni na ni ma t es ur f a c e s a ndt he i ri na c t i va t i onwi t hbi oc i da la ge nt s ,J .Hos p.. 利益相反 第2ならびに第3著者はパナソニック株式会社に所. I nf e c t . ,104,246251( 2020) .. 属している。また本研究は,第2ならびに第3著者が. 8)Fa t hi z a de hH. ,Ma r ouf iP. ,Mome nHe r a viM. ,Da o. 所属するパナソニック株式会社の研究費で実施され. S. ,K・s e. ,Ga nba r ovK. ,Pa gl i a noP. ,Es pos i t oS.. た。. a ndKa f i lH.S. :Pr ot e c t i ona nddi s i nf e c t i onpol i c i e s a ga i ns tSARSCoV2( COVI D19) ,I nf e z .Me d. ,28,. 引用文献. 185191( 2 020) .. 1 )LuR. ,Zha oX. ,LiJ . ,Ni uP. ,Ya ngB. ,WuH. ,. 9)Mur a t a T. ,Komot o S. ,I wa hor iS. ,Sa s a kiJ . ,. Wa ngW. ,SongH. ,Hua ngB. ,ZhuN. ,BiY. ,Ma. Ni s hi t s uj iN. ,Ha s e beT. ,Hos hi na gaK.a ndYuz a wa. X. ,Zha nF. ,Wa ngL. ,HuT. ,ZhouH. ,HuZ. ,Zhou. Y. :Re duc t i onofs e ve r ea c ut er e s p i r a t or ys yndr ome. W. ,Zha oL. ,Che nJ . ,Me ngY. ,Wa ngJ . ,Li nY. ,. c or ona vi r us 2i nf e c t i vi t ybya dmi s s i bl ec onc e nt r a -. Yua nJ . ,Xi eZ. ,MaJ . ,Li uW.J . ,Wa ngD. ,XuW. ,. t i onofoz onega sa ndwa t e r ,Mi c r obi ol .I mmunol . ,. Hol me sE.C. ,Ga oG.F. ,WuG. ,Che nW. ,ShiW.. doi :10. 1111/ 13480421. 12861( 2020) .. a nd Ta n W. : Ge nomi c c ha r a c t e r i z a t i on a n d. 10)赤堀幸男,村上篤司,星昭二:オゾン水の殺菌. e pi de mi ol ogyo f2019nove lc or ona vi r us :i mpl i c a -. 効果と院内感染予防への応用,日本集中治療医. t i onsf orvi r usor i gi nsa ndr e c e pt orbi ndi ng,Lanc e t ,. 学会雑誌,7,310( 2000) .. 395,565574( 2020) .. 11)Me ga he dA. ,Al dr i dgeB.a ndLoweJ . :Themi c r o-. 2)Wr a ppD. ,Wa ngN. ,Cor be t tK.S. ,Gol ds mi t hJ .A. ,. bi a lki l l i ngc a pa c i t yo fa que ousa ndga s e ou soz one. Hs i e h C.L. ,Abi ona O. ,Gr a ha m B.S.a nd. ondi f f e r e nts ur f a c e sc ont a mi na t e dwi t hd a i r yc a t t l e. Mc Le l l a nJ .S.:Cr yoEM s t r uc t ur eoft he2 019-. ma nur e ,PLOSONE,13,e 0196555( 2018) .. nCoVs pi kei nt hepr e f us i onc onf or ma t i on,Sc i e nc e ,. 12)Li m M.Y. ,Ki mJ .M. ,Le eJ .E.a ndKoG.P. :. 367,12601263( 2020) .. Cha r a c t e r i z a t i onofoz onedi s i nf e c t i onofmur i ne. 3)WuF. ,Zha oS. ,YuB. ,Che nY.M. ,Wa n gW. ,. nor ovi r us ,Appl .Env i r on.Mi c r obi ol . ,76,1120-. SongZ.G. ,HuY. ,Ta oX.W. ,Ti a nJ .H. ,Pe iY.Y. ,. 1124( 2010) .. Yua nM.L. ,Zha ngY.L. ,Da iF.H. ,Li uY. ,Wa ng. 13)RoyD. ,Wo ngP.K.Y. ,Enge l br e c htR.S.a nd. Q.M. ,Zhe ngJ .J . ,XuL. ,Hol me sE.a ndZh a ngY.. Chi a nE.S.K. :Me c ha ni s m ofe nt e r ovi r a li na c t i va -. Z.:An e wc or ona vi r usa s s oc i a t e dwi t hhuma nr e s -. t i onbyoz one ,Appl .Env i r on.Mi c r obi ol . ,41,718-. pi r a t or ydi s e a s ei nChi na ,Nat ur e ,579,2 65269. 723( 1981) .. ( 2020) .. 14)Ki mJ .G. ,Yous e fA.E.a ndDa veS. :Ap pl i c a t i on. 4)GuyK.R. ,Di Pa ol aR.S. ,Roma ne l l iF.a ndDut c h. ofoz onef ore nha nc i ngt hemi c r obi ol ogi c a ls a f e t y. R.E. :Ra pi dr e pur pos i ngofdr ugsf orCOVI D19,. a ndqua l i t yoff oo ds :ar e vi e w,J .FoodPr o t e c t . ,62,. Sc i e nc e ,368,829830( 2020) .. 10 711087( 1999) .. 5)Wo r l dhe a l t hor ga ni z a t i on. "WHOCor ona vi r usDi s -. 15)Ma t s uya maS. ,Na oN. ,Shi r a t oK. ,Ka wa s eM. ,. e a s e( COVI D19)Da s hboa r d" :. Sa i t oS. ,Ta ka ya maI . ,Na ga t aN. ,Se ki z ukaT. ,. ( ht t ps : / / c ovi d 19. who. i nt / ) .( 2021年1月21日閲覧). Ka t ohH. ,Ka t oF. ,Sa ka t aM. ,Ta ha r aM. ,Kut s una. 6)va nDor e ma l e nN. ,Bus hma ke rT. ,Mo r r i sD.H. ,. S. ,Ohma ga r iN. ,Kur odaM. ,Suz ukiT. ,Ka ge ya ma. Hol br ookM.G. ,Ga mbl eA. ,Wi l l i a ms onB.N. ,. T.a ndTa ke daM. :Enha nc e di s ol a t i onofSARS-. Ta mi nA. ,Ha r c our tJ .L. ,Thor nbur gN.J . ,Ge r be r. CoV2byTMPRSS2e xpr e s s i ngc e l l s ,Pr oc .Nat l .. S.I . ,Ll oy dSmi t hJ .O. ,deWi tE.a ndMu n s t e rV.. Ac ad.Sc i .USA. ,117,70017003( 2020) .. J .:Ae r os ola nds ur f a c es t a bi l i t yofSARSCoV2a s. 16)安木真世,小村泰浩,石上陽平:帯電微粒子水. 室内環境[2021]. 17.
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