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ウシの加齢に伴う卵胞液の性状変化と卵子の質低下の関係

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Academic year: 2021

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氏 名 駿 学位(専攻分野の名称) 博 士(畜産学) 学 位 記 番 号 甲 第 749 号 学 位 授 与 の 日 付 平成 29 年 3 月 21 日 学 位 論 文 題 目 ウシの加齢に伴う卵胞液の性状変化と卵子の質低下の関係 論 文 審 査 委 員 主査 教 授・博士(農学) 岩 田 尚 孝 教 授・博士(畜産学) 桑 山 岳 人 助 教・博士(農学) 白 砂 孔 明 農 学 博 士 橋 本 周* 博士(農学) 塚 本 智 史** 論 文 内 容 の 要 旨 哺乳動物の繁殖能力は加齢に伴って低下し,妊孕性は 低下する。わが国においても,第一子出生時の母の平均 年齢は年々上昇しており,高齢による不妊が社会問題と なっている。年齢を重ねても妊孕性を維持出来るように なれば,動物においては,優秀な個体の有効利用や希少 動物の保護に繋がる。また,ヒトにおいては高齢による 不妊で悩む人が増加しているため,不妊治療への応用が 期待される。こういった加齢による繁殖能力低下の原因 は,卵子の質が低下することが主な原因とされている が,この卵子の質低下の原因は明らかになっていない。 ヒトの卵子は治療時に同意を得たものが試験に用いられ るが数的,倫理的な制約も多い。また,一般的に実験動 物として広く使われるマウスは短命であり,寿命末期に 急速に繁殖能力が低下するため加齢卵子のモデルとして 不向きである。そこで本研究では寿命が長く,加齢卵子 のモデルとして適している,ウシを用いて研究を行っ た。筆者はこれまでにウシを用いた研究で,加齢により 卵子の受精発生能力の低下や,網羅的な遺伝子発現解析 の結果,ミトコンドリアの異常が主要因であることを報 告している。卵子は卵胞内で周囲を支持細胞である顆粒 層細胞と卵胞液に囲まれ相互作用のもと発育する。ま た,卵胞液は血管から移行してきた血液成分と卵胞内細 胞からの分泌物からなる。また周辺の細胞や卵胞液の性 状は卵子と同様に,加齢により変化する。そこで筆者は 加齢により卵胞液の性状が劣化し,卵子の質を低下させ ている可能性について検討を行った。 加齢個体由来卵胞液の成熟培地への添加がウシ卵子に及 ぼす影響 加齢に伴う卵子の質低下が卵胞液に起因しているのか を検討するため,10% の卵胞液添加による成熟培養を 行った。その結果,加齢個体由来卵胞液(Aged-FF)の 添加は若齢個体由来卵胞液(Young-FF)に比べて成熟 速度の進行を早期化し,ギャップ結合の早期閉鎖を引き 起こすことが明らかになった。さらに Aged-FF の添加 は Young-FF に比べて体外受精における正常受精率や, 体外発生率を低下させることが示された。また,Aged-FF 添加は Young-体外発生率を低下させることが示された。また,Aged-FF に比べて卵子内活性酸素(ROS) 量を有意に増加させた。これまで筆者が明らかにしてい る加齢個体に由来する卵子の特徴である,核成熟の早期 進 行 や,受 精 発 生 能 力 の 低 下,ROS 量 の 増 加 が, Aged-FF を成熟培地へ添加することで再現されること が明らかとなったため,加齢個体の卵子に観察される異 常は卵胞液によって引き起こされている可能性が考えら れた。 加齢個体由来卵胞液による受精成績低下の原因の解明 続いて,Aged-FF の添加による受精成績低下の原因 解明に取り組んだ。成熟培地に 10% の Young-FF また は Aged-FF を添加し,培養を行った後に,多精子拒否 機構(表層顆粒の分泌と透明帯の硬化反応)について検 討を行うと同時に,受精と密接な関係のあるミトコンド リアの機能と数について検討した。Aged-FF の添加に より,Young-FF に比べて卵子の受精処理後の表層顆粒 分泌が低下していることが示された。さらに,透明帯の 融解試験において,融解時間が Young-FF よりも Aged-─ 70 Aged-─ *IVF なんばクリニック 研究部門 部長 **放射線医学総合研究所 主任研究員

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FF 添加で短く,Aged-FF 添加によって正常な透明帯反 応が起こっていないことが示された。このことから, Aged-FF の添加は多精子拒否機構の劣化を惹起するこ とが明らかになった。また,リアルタイム PCR で測定 したミトコンドリア DNA 数は両年齢区間で差がないも のの,ATP 量は Young-FF よりも Aged-FF 添加により 有意に減少することが明らかとなった。筆者はこれま で,加齢個体由来卵子ではミトコンドリアに異常がある ことを示している。これらのことから,Aged-FF は卵 子のミトコンドリアに悪影響を与えることで,卵子の質 を低下させていることが示唆された。 糖最終産物がウシ卵子に及ぼす影響 加齢個体で卵胞液が卵子の質を低下させていることが わかった。そこで,加齢により蓄積し,細胞に毒性のあ る糖最終産物(AGE)が卵子に与える影響を検討した。 まず AGE は Aged-FF 中に多いこと,生体から採取し た血液との間に高い相関があることを見出した。成熟培 地へ AGE を添加したところ,AGE は減数分裂の早期 化と,ギャップ結合の早期閉鎖を引き起こした。さらに AGE の添加は異常受精率を有意に増加させ,胚盤胞期 胚率も有意に低下させた。そして,AGE は卵子中の ROS 量も有意に増加させることが明らかになった。こ のことから,卵胞液中で加齢による卵子の質を低下させ る要因の一つとして高濃度に含まれる AGE が示唆され た。 加齢がウシの卵胞液成分に及ぼす影響 卵胞液には血液からの移行成分や,卵胞内の細胞から 分泌される成分など,様々な成分が含まれており,それ らが卵子や卵子周辺の体細胞に働き卵胞と卵子の発育を 促す。AGE 以外の成分として卵胞液中のグルコース, コレステロール,遊離脂肪酸(NEFA),トリグセリド, さらには抗酸化能を測定した。若齢および加齢個体のウ シ卵巣から卵胞液を個体別に採取し,各測定項目の測定 に用いた。銅イオンに対する還元反応を利用した抗酸化 能の測定では,Aged-FF は Young-FF より抗酸化能が 低いという結果となった。トリグリセリド含量には Aged-FF と Young-FF の間には差は見られないものの, グルコース,コレステロール,NEFA 含量は Aged-FF で Young-FF よりもその量が有意に少ないという結果 となった。さらに,Aged-FF を添加して卵子の成熟培 養を行うと,Young-FF で培養を行ったものよりも,卵 子の発育能力の指標である卵子中の脂質の量が有意に少 なくなる結果を得た。また,Aged-FF 添加は Young-FF に比べて卵子中 ATP 量を減少させる結果を得たた め,Aged-FF はエネルギー成分が不足しており,これ らが卵子の能力低下の一因であることが明らかとなっ た。 総 括 本研究は加齢による卵子の質低下の要因として卵胞液 が卵子に及ぼす影響について検討した。結果として,加 齢個体に由来する卵胞液には加齢個体由来卵子で観察さ れる数々の特異的な異常を惹起する効果があることが明 らかになった。また,その原因の一つとして多量に含ま れている AGE が示された。さらに,グルコースや脂質 成分といった成分の変化も卵子質低下の一因となってい ることが明らかになった。本研究の結果より,卵子に加 齢由来の障害が蓄積しているという従来の概念に加え, 周囲の環境を改善することで卵子の質の一部は回復可能 であることが示された。 審 査 報 告 概 要 哺乳動物の繁殖能力は加齢に伴って低下し,卵子の質 低下がその主な原因と考えられている。本研究では,卵 子周囲の卵胞液が卵子の質を低下させているのかを調 べ,若齢個体の卵胞液(Young-FF)と比較して,加齢 個体の卵胞液(Aged-FF)が加齢個体由来卵子特異的な 異常(減数分裂の早期進行,ギャップ結合の早期閉鎖, 体外受精および発生成績の低下や卵子内 ROS 量の増 加)を惹起することを示した。また,この変化は Aged-FF に多く含まれる糖化最終産物(AGE)が誘導するこ とを示した。さらに,Aged-FF では抗酸化能の低下や, グルコース,コレステロ―ル,遊離脂肪酸の含量の減少 が観察された。本研究では,加齢による卵胞液の変化が 卵子の能力を減退させている要因の一つであることを示 した。これらの研究成果等を詳細に検討した結果,審査 員一同は博士(畜産学)の学位を授与する価値があると 判断した。 ─ 71 ─

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