高脂肪食で誘発される精神性障害とそのメカニズム
の研究：オキシトシン投与で改善する高脂肪食餌誘
発性肥満マウスの社会認知機能と物体認知機能の障
害
著者
林 遼太郎
学位授与機関
Tohoku University
学位授与番号
11301
URL
http://hdl.handle.net/10097/00129326
博士論文内容要旨 高脂肪食で誘発される精神性障害とそのメカニズムの研究： オキシトシン投与で改善する高脂肪食餌誘発性肥満マウスの社会認知機能と物体認知機能の障害 東北大学大学院農学研究科 生物産業創成科学専攻 天然物生物機能科学講座 機能分子解析学分野 学籍番号 B7AD9201 林 遼太郎 指導教員 仲川 清隆 教授 令和2 年度(2020 年度)
序章 緒言 脂肪の過剰摂取は、肥満、糖尿病、メタボリックシンドロームなどの生活習慣病の主要な危険 因子である。また高脂肪食摂取や肥満はアルツハイマー病や認知機能低下、うつ病様行動、不安 行動のリスク要因であることが知られている[1, 2]。このように脂肪の過剰摂取や肥満は高血圧 症、糖尿病などの身体疾患のみならず、精神疾患とも関連があることが知られている。今日、高 脂肪食摂取の増大と肥満は世界的な健康リスクの１つであり、高脂肪食の摂取による認知機能の 低下のメカニズム解明と効果的な治療法の開発が求められている。 オキシトシン(OXT)は、視床下部傍室核(PVN)と視床上核(SON)で合成される 9 アミノ酸から成 る神経ペプチドホルモンであり、下垂体後葉に走行する軸索によって血液中に分泌される。OXT は乳腺、子宮平滑筋、舌、骨組織を含む広範囲の末梢組織において、乳汁排出、分娩、および骨 形成の制御などの様々な生理機能を有している。一方、脳内では、視床下部で合成されたOXT は、発現ニューロンの軸索を介して各核に到達し、また領域によっては拡散によってもその機能 をはたしていると考えられている。OXT 受容体(OXTR)は q/11 型 G サブユニットに結合した G タンパク質共役型受容体であり脳内では視床下部のPVN、情動、食欲、性欲、睡眠欲、意欲、 睡眠などに関わるとされる大脳辺縁系の外側中隔核(LS)、海馬、内側扁桃体(MeA)、内側前頭前 野(MPOA)、および疼痛に関与する分界条床核(BNST)を含む様々な脳領域で発現している[3, 4]。 これらの脳で発現するOXTR は様々な社会的行動、向社会行動などを制御しており、社会的認 識、攻撃的行動などの社会的行動やPair bonding、母性行動、共感行動などの向社会行動が OXT/OXTR システムよって制御されていると考えられている。一方、近年 OXT/OXTR システム が摂食制御や代謝に影響を与え肥満を制御出来る可能性があることから、抗肥満薬としての可能 性が論議されている[5]。 このようにOXT が抗肥満作用や社会認知機能の改善効果を有することから OXT 及びその受容 体アゴニストが肥満に起因する認知機能障害等の諸症状に対する包括的な治療に有効である可能 性が考えられた。しかしながら、末梢OXT 投与が高脂肪食摂取に起因する認知機能障害や不 安、うつ様行動に与える影響はこれまでに報告されていない。そこで高脂肪食摂取によって引き 起こされる行動異常に対するOXT の治療薬としての可能性を検討するため、高脂肪食摂取マウ スにおける末梢OXT 投与が認知機能や不安、うつ様行動に与える影響を解析した。また、 OXT/OXTR システムは社会認知機能に必須であることから、高脂肪食摂取による認知機能障害 がOXT/OXTR システムに起因する可能性を考え、高脂肪食摂取が OXT/OXTR システムに与える 影響を解析した。これにより高脂肪食摂取による認知機能障害メカニズムの一端が解明できると 考えられた。さらにOXT が社会認知機能を改善することから、OXT だけでなく他の OXTR アゴ ニストについても同様の効果が期待される。これまでにOXTR アゴニストはペプチド性の物質 と非ペプチド性の物質が報告されているが、非ペプチド性の物質は化学合成されたものであり、 天然物由来のOXTR アゴニストはこれまでに報告されていない。そこで食経験や食品用途等の 観点から社会認知機能を改善する天然物由来のOXTR アゴニストの開発を目指し、天然物由来 のOXTR 受容体アゴニストの探索を行った。
第１章 高脂肪食摂取マウスにおけるOXT の認知機能改善効果の検証 【目的】 高脂肪食摂取により社会認知機能、物体認知機能が低下し、またOXT の投与によって社会認 知機能が改善することが知られている。しかしながら、OXT の末梢投与が高脂肪食摂取による 認知機能異常などの行動異常に与える影響は不明であった。本章では高脂肪食摂取マウスにおけ る末梢OXT 投与が社会的認知機能、物体認知機能、不安行動、うつ様行動に与える影響を評価 することで、高脂肪食摂取によって引き起こされる行動異常に対するOXT の治療薬としての可 能性を検討した。 【方法・結果】 5 週齢の C57BL6/J 雄マウスを通常食群、高脂肪食群、高脂肪食＋OXT 群の 3 群に分け、通常 食若しくは高脂肪食を10 週間投与した。通常食群、高脂肪食群には生理食塩水を、高脂肪食 +OXT 群には OXT(1mg/kg)を投与し 45 分後に行動試験に供した。行動試験は Three chamber test, Object recognition test, Object location test, Olfactory habituation dishabituation test, Open field test, Tail suspension test, Forced swim test を行った。
Three chamber test は 3 室(チャンバー)からなる測定箱の両角に配置された刺激マウスに対して 探索した時間を計測することで社会性(Sociability)及び社会認知機能(Social recognition)を評価する 試験である(Fig1.A)。この試験では馴化を行った後に、一度も接触したことのない新奇マウスと 空のケージを左右の角に配置し、それぞれに対する探索時間を測定することで社会性を評価し た。その後、社会性の評価で用いた既知マウスと新奇マウスを左右の角に配置しどちらに探索時 間を多く費やすかを測定することで、新奇マウスと既知のマウスを見分ける社会認知機能(Social recognition)を評価した。結果、社会性については高脂肪食の摂取及び OXT の投与による影響は 認められなかった(Fig1.B)。社会認知機能については通常食群では新奇マウスに対して多くの探 索行動を示したが、高脂肪食群では探索行動の時間に差が見られなかった。一方で、OXT の投 与により新奇マウスに対して多くの探索行動を示した(Fig1.C)。これらの結果から高脂肪食の摂 取及びOXT の投与は社会性には影響を与えないが、高脂肪食摂取は社会認知機能を低下させ、 OXT の投与は低下した社会認知機能を回復させることが示された。
Object recognition test では異なる物体を区別して認識する物体認知機能を評価する試験である (Fig1.D)。この試験では２つの同じ物質体をチャンバー内に配置し探索させた後に、翌日に 2 つ の物質のうち1 つを一度も接触したことのない新奇の物質体に交換して自由に探索させた。既知 物体と新奇物体のどちらに探索時間を多く費やすかを測定することで物体認知機能を評価した。 結果、通常食群では新奇物体に対して多くの探索時間を費やしたが、高脂肪食群では探索行動の 時間に差が見られなかった。一方で、OXT の投与により新奇物体に対して多くの探索時間を示 した。この結果から、高脂肪食摂取は社会認知機能を低下させ、OXT の投与は低下した物体認 知機能を回復させることが示された(Fig1.E)。
Object location test では物体の位置を区別して認識する位置認識能を評価する試験である。この 試験では２つの同じ物質体をチャンバー内に配置し探索させた後に、翌日に2 つの物質のうち 1
つの場所を変え自由に探索させる。同じ場所と新しい場所においた物体どちらに探索行動時間を 多く費やすかを測定することで物体認知機能を評価した(Fig1.F)。結果、通常食群では場所を変 えた物体に対して多くの探索行動を示したが、高脂肪食群では探索行動の時間に差が見られなか った。一方で、OXT の投与により場所を変えた物体に対して多くの探索時間を示した。この結 果から、高脂肪食摂取は社会認知機能を低下させ、OXT の投与は低下した位置認知機能を回復 させることが示された(Fig1.G)。
Olfactory habituation dishabituation test は嗅覚の機能を評価する試験である。非社会的、社会的 匂いに対して探索した時間を測定することで嗅覚機能を評価した。結果、高脂肪食群、高脂肪食 ＋OXT 群では通常食群に比べて探索時間が短かった。この結果から、高脂肪摂取は嗅覚機能を 低下さるが、OXT の投与は嗅覚機能に影響を与えないことが示された(Fig3)。
Open field test は不安様行動を評価する試験である。チャンバーにマウスを入れ自由に探索させ た際の、チャンバーの中央に滞在した時間と、Freezing behavior の時間を測定した。Freezing behavior はすくみ行動とも呼ばれる不安行動様行動の 1 つである。結果、中央滞在時間は高脂肪 食摂取群と高脂肪食摂取＋OXT 群で通常食群に比べて低下していた(Fig2.A)。また Freezing behavior は高脂肪食摂取+OXT 群で高脂肪食摂取群よりも増加していた(Fig2.B)。この結果から、 OXT 投与により不安様行動の 1 つである Freezing behavior が増加し、OXT 投与が不安を惹起さ せる可能性が示された。
Tail suspension test は鬱様行動を評価する試験である。マウスの尾を固定して懸垂をさせた際の 不動時間を測定することで鬱様行動を評価した。結果、高脂肪食の摂取、OXT の投与は不動時 間に影響を与えなかった(Fig2.C)。
Forced swim test も鬱様行動を評価する試験である。水にマウスを入れた際の、不動時間を測定 することで鬱様行動を評価した。結果、高脂肪食摂取＋OXT 群の不動時間が高脂肪食摂取群に 比べて低下していた。この結果からOXT の投与が鬱様行動を減少させることが示された (Fig2.D)。
【考察】
OXT の末梢投与は高脂肪食摂取による社会的、物体認知機能の低下を改善することが示され た。また、OXT の投与によって不安行動の 1 つである Freezing behavior が増加することが示され た。一方、OXT の投与は嗅覚行動に影響を与えないことが示された。嗅覚機能は社会的認知機 能の維持に必須とされており、OXT の投与により嗅覚機能は回復していないにも関わらず社会 認知機能が回復していることから、OXT による認知機能の回復は嗅覚機能以外のメカニズムで 起きていると考えられた。そこで、次にOXT の末梢投与が脳内遺伝子発現や内分泌系に影響を 与えている可能性を検討することとした。
第２章 高脂肪食摂取マウスにおけるOXT の認知機能改善メカニズムの解明 【背景・目的】 前章にて、OXT の腹腔内投与が高脂肪食摂取マウスの社会的・物体認知機能を改善させ、不 安様行動の１つであるFreezing behavior を増加させることが示された。これらのメカニズムの解 明を目指して、高脂肪食摂取マウスに末梢投与したOXT が脳内に与える影響を解析した。 【方法・結果】 5 週齢の C57BL6/J 雄マウスを通常食群、高脂肪食群、高脂肪食＋OXT 群の 3 群に分け、通常 食若しくは高脂肪食を10 週間投与した。通常食群、高脂肪食群には生理食塩水を、高脂肪食 +OXT 群には OXT を 1mg/kg で投与した。投与後に社会認知機能に関わる、前頭前皮質、外側中 隔、内側扁桃体、海馬、視床下部をサンプリングしRT-PCR に供した。また投与後に還流固定 し、視床下部のOXT 発現を免疫化学染色にて検出した。また投与後に採血を行い、血中 OXT 濃 度をELISA で測定した。
まず、高脂肪食摂取とOXT の投与が OXT/OXTR 系に与える影響を評価するために、OXTR と OXT mRNA 発現を RT-PCR で解析した。結果、海馬において高脂肪食の摂取により OXTR の発 現が低下していた(Fig4.E)。また視床下部において OXT の投与により OXTR の発現が低下してい た(Fig4.D)。一方で視床下部において OXT の投与により OXT の発現が上昇していた(Fig4.K)。 高脂肪食摂取とOXT の投与が神経の活性化に与える影響を評価するために、神経の活性化マ ーカーであるc-fos mRNA 発現を RT-PCR で解析した。結果、海馬において高脂肪食の摂取によ りc-fos の発現が低下していた(Fig4.J)。次に視床下部の OXT 産生領域である室傍核の OXT タン パク発現細胞を免疫化学染色で検出しカウントした。結果、OXT の投与により室傍核の OXT 陽 性細胞数が増加していた(Fig5.A-D)。
高脂肪食の摂取及びOXT の投与が血中 OXT 濃度に与える影響を評価するために、血中 OXT 濃度を測定した。結果、高脂肪食の摂取は血中OXT に影響を与えなかったが、OXT の投与によ り血中OXT 濃度が上昇した(Fig4.L)。
【考察】
高脂肪食摂取により海馬のOXTR と c-fos の発現が低下していた。海馬の OXTR は社会認知機 能に必須であることが報告されており、海馬のOXTR の発現低下が社会認知機能の低下の原因 の1 つである可能性が考えられた。また海馬は物体認知機能を担う脳領域の１つであり、高脂肪 食摂取による海馬のc-fos の低下は物体認知機能の低下の原因の 1 つである可能性が考えられ た。また先行研究においてOXT/OXTR 系におけるネガティブフィードバック機構の存在が示唆 されており、本研究のOXT の投与による視床下部の OXTR 発現の低下はこれを支持する結果で あった。OXT の投与により視床下部の OXT mRNA 発現が上昇し、視床下部の室傍核の OXT 陽 性細胞数が上昇していたことから、末梢投与したOXT が視床下部の OXT mRNA の発現を上昇 させ、OXT 産生を促進することが示唆された。
第３章 認知機能改善食品素材の開発を目指した天然物由来OXTR アゴニストの探索
【背景・目的】
前章までの結果から、末梢投与したOXT は中枢の mRNA 発現を上昇させ、OXT の産生を促 進、OXT は社会認知、物体認知機能を改善させることが明らかになった。そこで高脂肪食摂取 に起因する認知機能障害をOXT/OXTR システムを介して改善する機能性食品素材の開発を目指 して天然物由来OXTR アゴニストの探索を行った。
【方法・結果】
ヒト胎児腎細胞であるHEK293 に OXTR の発現ベクターと、OXTR の下流シグナルのレスポ ンスエレメントであるNFAT-RE (Nuclear factor of activated T cells – response element)の下流にホタ ルルシフェラーゼが導入されているベクターを導入し、OXTR の活性化をルシフェラーゼの発現 で検出できるDual luciferase Assay (DLA)を構築した(Fig6.A)。構築した DLA を用いて京都薬科大 学生薬学分野が有する植物エキスライブラリを評価したところ、そのうち1 つの物質(Compound A)に OXTR アゴニスト活性が確認された。さらに、Compound A の OXTR アゴニスト活性が OXTR アンタゴニストによってキャンセルされること、濃度依存性が確認された(Fig6.B-C)。 【考察】
DLA により天然物由来の OXTR アゴニスト候補物質を発見することに成功した。現在、構造 類縁体等の評価を行っている。また今後、当該物質の生体内での機能を動物試験によって検討す る予定である。
第４章 総括 本研究では高脂肪食に起因する認知機能障害等の精神性障害に対するOXT の効果及びそのメ カニズムの検討を行い、高脂肪食に起因する精神性障害に対する新たな予防、治療法の検討を目 的とした。 第１章では高脂肪食によって誘導される精神性障害に対する末梢OXT 投与の効果について検 討を行った。これまでOXT の投与は社会的認知機能を改善するすることが知られていたが、本 研究によってOXT の末梢投与が社会的、非社会的認知機能の両方を改善することが示された。 このことはOXT/OXTR システムが社会認知機能だけではなく物体認知機能も含んだ広範囲な認 知機能の改善に寄与する可能性を示した。さらに副作用として不安様行動が惹起される可能性を 示した。 第２章では高脂肪食の摂取がOXT/OXTR 系に与える影響と、OXT による認知機能改善メカニ ズムを検討した。高脂肪食摂取が脳内のOXT/OXTR システムに与える影響についてはほとんど 報告がなかったが、本研究で高脂肪食摂取が海馬特異的にOXTR の発現を低下させることを明 らかにし、高脂肪食摂取による海馬OXTR 発現の低下が社会認知機能の原因の１つである可能 性を示した。また末梢OXT 投与により中枢 OXT の合成が促進されることを示した。このことは 末梢OXT 投与による内在性の OXT の合成促進が認知機能改善効果に関係している可能性を示し ている。 第３章では、高脂肪食に起因する精神性障害に対する新たな予防、治療法の開発を目指して天 然物由来OXTR アゴニストの探索を行った。これまでに非ペプチド性の OXTR アゴニストで天 然物由来の物質は報告されていないが、本研究では天然物由来のOXTR アゴニスト候補物質を 発見することに成功した。 本研究によってOXT の末梢投与が高脂肪食摂取に起因する認知機能障害の治療に寄与する可 能性が示された。また、天然物由来のOXTR アゴニストは高脂肪食摂取に起因する認知機能障 害の改善、予防だけでなく、OXT/OXTR システムが関係する摂食制御、母性行動制御、攻撃行 動制御などこれまでにない新しい機能を持った食品の開発に貢献できると期待される。
[Reference]
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