Microsoft PowerPoint L2同定S2

T. Muratani

細菌検査室における

同定の

Golden Standardについて

第11回ひびき薬剤耐性菌シンポジウム

2014年5月18日 ランチョンセミナー2

村谷 哲郎

T. Muratani 検体採取 分離培養 純粋分離 同定 感受性測定 グラム染色 鏡検 白血球数 グラム染色所見 一部の菌種名 菌種名・薬剤感受性 菌量 検体提出当日 3日後（2日後） 1日後

細菌検査の流れ

培養は少なくとも2日間観察するので、2日後に発育した菌については1日遅れる。 偏性嫌気性菌などさらに発育の遅い菌ではさらに時間がかかる （2日後） T. Muratani T. Muratani T. Muratani

グラム陽性球菌とグラム陰性桿菌の構造

30S 50S 30S 50S 外膜 細胞壁 細胞膜 リボソーム DNA 各種酵素（糖分解、活性酸素分解、有機物分解など） 鞭毛、せん毛、莢膜 抗原性：細胞壁表層構造、外膜表層構造（逆受け身ラテックス凝集反応） 運動性：鞭毛の有無 生化学的性状試験 特異的DNA配列保有の有無 16S rRNAのDNA塩基配列の決定 T. Muratani プレビカラーグラム グラム染色自動染色機 蛍光顕微鏡

塗抹染色

T. Muratani

グラム染色鏡検（ｘ

1000）

A:MRSA, B: E. faecalis, C: E. coli,

D: S. marcescens, E: P. aeruginosa, F: C. koseri,

G: Candida sp., H: P. aeruginosa

A

H

G

D

C

F

B

E

T. Muratani

これは！（400倍動画）

T. Muratani 髄液直接 コロニーから

Cryptococcus neoformans

T. Muratani

各種培養器

T. Muratani

基本培地

1. 5％羊血液寒天培地

2. チョコレート寒天培地

3. ドリガルスキー改良培地

特殊培地（検体種別、目的菌により適宜使用）

エッグヨーク寒天培地（黄色ブドウ球菌）

VRE選択培地（VRE）

TCBS寒天培地（便：ビブリオ）

SS寒天培地（便：赤痢、サルモネラ）

ソルビトール加マッコンキー寒天培地（便：O157）

サイアマーチン寒天培地（淋菌、髄膜炎菌）

CCDA寒天培地（カンピロバクター）

サブロー寒天培地（真菌）

クロモアガー・カンジダ（酵母様真菌）

一般細菌の培養

T. Muratani

10

4

₁₀

5

₁₀

6

₁₀

7

臨床検体の培養結果

T. Muratani

１次培養結果

T. Muratani

同定：培養は

Campylobacter選択培地（CCDA培地：関東化学）を用い、

発育を認めたもののうち、疑わしいコロニー（ラフ状で光沢を有する）に

ついて、オキダーゼ試験を行い陽性であったコロニーを鏡検すれば、

Campylobacter sp.まではわかるはず。

Campylobacter spp.

選択培地

CCDA上での発育

(Charcoal cefoperazone deoxycholate agar)

グラム染色像

T. Muratani

TCBS上のコロニー鑑別

13

青緑色の大きい集落（直径

2mm 強）：Vibrio parahaemolyticus

青緑色の小さい集落（直径約

1mm ）：Vibrio mimicus

黄色の大きいムコイド集落：

Vibrio alginolyticus

黄色の小さい集落：

Vibrio chole

ｒ

ae

右図：

Vibrio fluvialis

T. Muratani

WYOα培地 Legionella pneumophila

B-CYE培地 pH6.9 Yeast Extract Charcoal L-cystein ･HCｌ 可溶性ピロリン酸鉄 ACES αケトグルタル酸カリウム 寒天 10 g 2 g 0.4 g 0.25 g 10 g 1 g 15 g B-CYE (Buffered Charcoal Yeast Extract)寒天培地に

抗菌剤を添加した培地が

WYOα (Wadowsky-Yee-Okuda α-ketoglutaric acid)寒天培地pH6.7 3 g 5 mg 10,000 units 80 mg Glycine Vancomycin Polymixin-B Amphotericin B T. Muratani T. Muratani T. Muratani 分類学の変遷 生化学性状による分類 → 16S rDNAの配列による分類 1995年以降この変更により、大幅に菌名が変更されている。 生化学性状による同定（各種酵素、器官保有の有無） 試験管法（LIM, TSIなど） VITEK2, WalkAway 自動機器 BD Crystal 用手法 RapID (偏性嫌気性菌用）用手法 免疫反応（抗体との反応性） 特異的遺伝子による同定 Probetec (SDA法) 淋菌、クラミジア

TaqManPCR 結核菌群、Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare 16S リボソームRNAのDNA塩基配列を決定 難しくはないが、コストと時間がかかるため、研究としてのみ実施 タンパク質のレーザー照射電離パターンの解析 1996年Claydon MALDI-TOF MS 2,000 Da～20,000Daのタンパク質の電離パターンを解析 この領域にリボソーム由来タンパク質が50～70％を占める。

菌種の同定

16S rRNA 23S rRNA 5S rRNA mRNA 30S subunit 50S subunit tRNA RNA protein T. Muratani T. Muratani T. Muratani

細菌の同定 （生化学性状試験）

各種酵素保有等の有無により同定する。 糖（乳糖、白糖、マルトース、トレハロース等） アミノ酸類（オルニチン、リジン、ヒスチジン等） 有機酸（乳酸、コハク酸、クエン酸等） 有機物（尿素、ジクロロアミノフェノール等） 感受性（ノボビオシン、コリスチン、オプトヒン、 バシトラシン、塩化ナトリウム等） IDテスト・HN：20ウェル/キット VITEK2：64ウェル/カード BBLクリスタル：30ウェル/キット API：20ウェル/キット T. Muratani T. Muratani T. Muratani

分類のための方法とその解釈範囲

結果の解釈

属名推定

菌種同定

菌種同定

菌種決定

菌種決定

株の種類の分類

クローンのグループ化

クローンの同一性

解析方法

GC含量

生化学性状パターン解析

MALDI-TOF MS

特異的遺伝子を標的とした核酸増幅法

16S rDNAの塩基配列の相同性

血清型、ファージ型

MLST (Multilocus sequence typing)

遺伝子多型パターン解析（

PFGE）

T. Muratani

微生物同定におけるMALDI TOF-MSの位置付け

MALDI TOF-MSを用いた菌種同定法は、MS 2,000 Da～20,000Da (1Da

≒

1.66×10

-27

_{kg)のタンパク質の電離パターンを既知の菌種のパターン}

と比較して、菌種を決定する方法である。

この領域で検出されるフラグメントは、リボソーム由来タンパク質が

50～

70％を占めるので、同定に適していると考えられる。

現在の菌種同定のGolden Standardは16SリボソームRNAのDNA塩基配

列をSequenceし、登録されている塩基配列と比較する方法である。

MALDI TOF-MSの場合、リボソーム由来タンパク質のフラグメントが半

分以上を占める領域を解析しているだけであり、他のタンパク質のフラグ

メントも多数存在しているので、

Golden Standardにはなり得ない。

株により、リボソームタンパク質以外に由来するフラグメントは多様と考

えられるので、データベース構築も塩基配列と違って、難しいと考えられ

る。国により多少違うことも考えられ、日本の株でのデータベース構築も

重要な作業と考える。

T. Muratani

質量分析法

Mass Spectrometry

真空中で試料をイオン化すると、静電力によって試料は装置内を飛行する。飛行してい るイオンを電気的・磁気的な作用等により質量電荷比に応じて分離し、その後それぞ れを検出することで、質量電荷比を横軸、検出強度を縦軸とするマススペクトルを得る ことができる。 マススペクトル(Mass Spectrum, MS) とは、質量分析の結果得られる、横軸に質量／電 荷（m/z 値）、縦軸に検出強度をとったスペクトルである。 既知物質の同定や新規物質の構造決定に用いられる。 単離が必要なので、各種分析機と直結させても使用可。 LC/MS, GC/MS, CE/MS イオン化の方法

EI (Electron Ionization, 電子イオン化）法、CI (Chemical Ionization, 化学イオン化）法、 FD (Field Desorption, 電界脱離）法、FAB (Fast Atom Bombardment, 高速原子衝突）法、 MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption,マトリックス支援レーザー脱離イオン化）法、 ESI （ElectroSpray Ionization、エレクトロスプレーイオン化）法、APCI（Atomospheric Pressure Chemical Ionization、大気圧化学イオン化）法など

田中耕一氏はソフトレーザー脱離イオン化法の開発者としてノーベル賞を受賞した。 T. Muratani T. Muratani T. Muratani

MALDI TOF MSを原理として微生物同定装置

192 cm 110 cm シスメックス・ビオメリュー ブルカー、日本BD、シーメンス、栄研化学（4社併売） microflex ↓ MALDI バイオタイパー AXIMA ↓ バイテックMS 1. 少ない菌量で（105_{コ）全処理が簡便} 2. 精製されたタンパクでなくてもイオン化効 率は低下は少ない 3. 1価のイオン生成が主体なので、解析が 容易 得られたマススペクトルパターンとライブ ラリーで一致するものを探し、同定する。 T. Muratani

再測定結果

T. Muratani T. Muratani T. Muratani

VITEK-MSでは分けることが出来ない菌種

とその対処法

質量分析では同じパターンとなってしまうので、菌種名を決定出来ないものがある。 生化学性状追加試験を実施すれば鑑別可能な菌種がある。 なるべくその場で結果が出る方法を選択 インドール（綿棒に菌体をとり、直接コバック試薬を滴下） 運動性試験（生標本を観察、有、無だけでなく、動き方も含めて確認） コロニー性状（溶血、色、集落の作り方） 乳糖分解（ドリガルスキーを確認） オキシダーゼ、PYR、ラッテクス凝集試験 時間がかかるが実施している方法 VITEK-2、BBLクリスタル 糖分解試験（OF培地） VP試験 Enterobacter cloacae Enterobacter asburiae 50.0 50.0 信頼値 菌名 信頼性レベル T. Muratani T. Muratani T. Muratani

VITEK-MSで鑑別出来ない組み合わせ

Achromobacter xylosoxidans/denitirificans

Acinetobacter baumannii complex (baumannii, calcoaceticus, nosocomialis, pitii) Aeromonas hydrophila/caviae Bacillus cereus/thuringiensis/mycoides Bacillus subtilis/amyloliquefaciens Bifidobacterium spp. (5菌種） Brevibacillus spp. （7菌種） Corynebacterium amycolatum/xerosis Escherichia coli/Shigella spp. Lacobacillus casei/paracasei Micrococcus luteus/lylae Paenibacillus spp. (8菌種) Proteus vulgaris/penneri

Salmonella group (Salmonella Typhi, Salmnella Paratyphi A, Salmonella Gallinarum, Salmonella enterica ssp. arizonae/diarizonaeは鑑別可）

その他、subspeciesを鑑別出来ない菌種あり T. Muratani

同定キット

2つ使ったらコストと時間の無駄

自動機器やキットの結果を鵜呑みにしてはいけない！ コンタミネーション、菌株の取り違い、入力の間違い、機器の限界、機器の不良 安易にキットに頼らず正確に同定 コストと時間をかけずに同定するためには・・・ 迅速試験 カタラーゼ、オキシダーゼ、インドール、運動性、抗原抗体反応、コロニーの色 特徴的なコロニー 試験管培地の活用 糖分解、VP 選択剤の活用 オプトヒン、バシトラシン、ノボビオシン、亜テルル酸 バンコマイシン、アズトレオナム、ゲンタマイシン、コリスチン

T. Muratani T. Muratani T. Muratani

Escherichia coli/Shigella spp.

生標本で 運動性鏡検 乳糖BTB寒天培地 E. coli 黄変 インドール 陽性 陰性 E. coli ＋ PCR virA－ － 赤痢菌免疫血清 EIEC or Shigella spp. virA+ 青変 T. Muratani

Achromobacter の菌種決定

OF培地(10%Glucose)

Achromobacter denitrificans Achromobacter xylosoxidans 50.0 50.0 T. Muratani

Aeromonas hydrophila/caviae

VPで鑑別

Aeromonas hydrophila/caviae 99.9 T. Muratani T. Muratani T. Muratani

Streptococcus

溶血素(hemolysin)による分類 α溶血：緑色を帯びた不完全溶血帯を生ずる。 α溶連菌、緑連菌、ビリダンスグループ連鎖球菌、oral streptococciなどと呼ばれる。 過酸化物により、赤血球が障害され鉄イオンが酸化され緑色を呈色する？ α’溶血：溶血帯が狭い不完全溶血だが緑変をほとんど認めないものを指す。β溶血素に 類似するが活性が弱い溶血素を産生する菌などに見られる。通常β溶血に分類される。 β溶血：コロニー周囲に透明帯を生ずる完全溶血。溶血帯は広く、その内部ではほとん どの赤血球が溶血によって消失する（＝完全溶血）。細胞膜に孔を生じるなどの機能を 持つ、細胞傷害性の強い溶血素を産生する細菌で見られる。溶連菌、β溶連菌と呼ばれ る。 γ溶血：溶血素を持たず溶血が起こらない場合。 非溶血性溶連菌 抗原性による分類（Lancefieldの分類） A, B, C, F, G, …, V (D: Enterococci) Streptococcus agalactiae以外は、VITEK-MS＋ラテックスの結果で菌種名を決定。 菌種とLancefieldの分類まで報告。 T. Muratani

β溶連菌

Streptococcus dysgalactiae ssp. dysgalactiae Streptococcus pyogenes

Streptococcus dysgalactiae ssp. equisimilis

ラテックス AならPYR実施、＋pyogenes, ｰ equisimilis Gまたはｰなら equisimilis Cならssp. dysgalactiae or equisimilis 必要に応じてVITEK2などで決定 T. Muratani T. Muratani T. Muratani

Streptococcus

のコロニー性状

(A) S. pyogenes (B) S. agalactiae

(C) S. dysgalactiae subsp. equisimilis (Lancefield group G)

(D) S. anginosus,

S. dysgalactiae subsp. equisimilis (E), (F) S. pneumoniae

T. Muratani

Streptococcusの血液寒天培地上の発育

α溶血

Optochin test

β溶血

S. pyogenes

GAS

S. agalactiae

GBS

S. pneumoniae

Viridans group

β(α‘)溶血

CAMP test

T. Muratani T. Muratani T. Muratani

Streptococcus属の性状

S. pyogenes S. agalactiae S. dysgalactiae ssp. dysgalactiae S. dysgalactiae ssp. equisimilis S. equi ssp. equi S. equi ssp. zooepidemicus S. canis S. anginosus group S. porcinus Viridans group Lancefield A B C A, C, G, L C C G A, C, G, F, none E, P, U, V, none PYR + -+ Colony Large Large Large Large Large Large Large Small Large CAMP -+ -+ -+ Hemolysis β β (α’) β β β β β (α’) α, β, γ β (α’) α, γ いずれの菌種も非溶血株が存在する。

fPresence of the enzyme pyrrolidonyl aminopeptidase.

gCAMP factor reaction (cohemolysis in the presence of the Staphylococcus aureus beta-hemolysin) hVoges-Proskauer test (formation of acetoin from glucose fermentation).

VP -+ + T. Muratani T. Muratani T. Muratani Bacillus cereus/thuringiensis/mycoides →

Colony性状で、B. cereus/thuringiensisまたはB. mycoidesで報告

追加試験により菌名を決定するもの

Enterobacter cloacae/asburiae → 生標本で運動性確認。 わかりにくければVP実施（＋ならE. cloacae） Streptococcus dysgalactiae ssp dysgalactiae/equisimilis

ラテックスC群→Streptococcus dysgalactiaeで報告。必要に応じてVITEK-2で同定 その他（主にG群）→Streptococcus dysgalactiae ssp equisimilis

Corynebacterium amycolatum/xerosis → 通常このまま報告。 Morganella morganii ssp morganii/sibonii

Trehalose＋：Morganella morganii ssp sibonii Treholose－：Morganella morganii ssp morganii

T. Muratani

培養温度とコロニー性状

22℃ 37℃ B. mycoides B. licheniformis http://microbio146.blogspot.jp/2011_08_01_archive.html B. megaterium T. Muratani

鞭毛染色（レイフソン）と運動性確認

（400倍鏡検動画）

レイフソン染色 試薬は自家製とし、タンニン酸の濃度を80％とするとうまくいくらしい。 （レイフソン大久保変法） T. Muratani

Pseudomonas aeruginosa （400倍動画）

T. Muratani T. Muratani T. Muratani

追加試験により菌名を決定している菌種

Achromobacter xylosoxidans/denitrificans Glucose A. xylosoxidans A. denitirificans Aeromonas hydrophila/caviae A. hydrophila A. caviae VP Micrococcus luteus/lylae コロニー 黄色 白色 Trehalose M. luteus － M. lylae Proteus vulgaris/penneri インドール P. penneri _{P. vulgaris} + + + + － － － T. Muratani T. Muratani T. Muratani まず、再度レーザー照射を行い再判定を行う。それでも決定できない時は、

Raoultella ornithinolytica/planticola/terrigena → PCR (β-lactamase領域）で決定 Chryseobacterium indologenes/gleum → 溶血＋ならC. indologenes

Globicatella saguinis/sulfidifaciens → PYR+なら G. saguinis

Citrobacter braakii/freundii/gillenii/murliniae/rodentium/sedlakii/werkmenii/youngae → Citrobacter freundii complex, これ以外の菌種も入ったら、Citrobacter sp. Pseudomonas fluorescens/veronii → 生標本観察 直進のみであればP. veronii Burkholderia cepacia/vietnamiensis→ VITEK-2へ

Corynebacterium pseudodiphtheriticum/propinquum → Corynebacterium sp. Streptococcus salivarius ssp salivarius/Streptococcus vestibularis → 溶血＋ならStreptococcus vestibularis

本来同定できるが、よく複数菌名が

表示される菌種とその対処法

T. Muratani T. Muratani T. Muratani

Acinetobacter baumannii/calcoaceticus/nosocomialis/pittii → A. baumannii complex Bacillus subtilis/amyloliquefaciens → このまま

Campylobacter jejuni ssp jejuni/doylei → Campylobacter jejuni

Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae/ozaenae/rhinoscleromatis → K. pneumoniae Streptococcus constellatus ssp constellatus/pharyngis → S. constellatus

Streptococcus mitis/oralis → このまま ただし、血液や髄液由来株の場合は、 VITEK-2, BBLクリスタルなどを追加する場合もある。

菌名が複数表示された場合でも、追加試験を

実施せずそのまま報告するもの

T. Muratani

Kerstersia gyiorum

特定の施設の喀痰から、頻繁に同定不能菌が検出された。 VITEK-MSでは、明確なパターンが示されるが、同定不能となる。 VITEK-2やその他のキットでも同定不能。 複数株について、16SrDNA約1,500bpsを解析したところ、Kerstersia gyiorumと同定。 NFGNR, コロニー性状を確認し、VITEK-MS同定不能かつ特徴的3 peakを認めた場合、 本菌名で報告することとしている。 T. Muratani

細菌検査室における同定のGolden Standardは？

どこまで菌種名を報告するか。属名までではだめか。→ 基準はない。 少なくとも下記の3つが一致することを確認する必要がある。 グラム染色、コロニー性状、自動機器（質量分析、生化学性状）または同定キット Ex. グラム陽性球菌、自動機器：肺炎球菌、オプトヒン感受性 しかし、コロニー性状は肺炎球菌とは思えない。 肺炎球菌特異的酵素LytAのPCR実施→陰性 グラム陽性球菌（同定不能）で報告 我々は、その他の菌種も含め、難しいケース（主に自動機器の結果とコロニー性状が 一致しない場合）はPCRに頼っているが、どこの施設でも実施できるわけではない。何 をGolden standardとするかはそれぞれの施設で決めておく必要がある。 PCRも論文になっているからと言って、必ずしも特異的とは限らない。Primer配列を吟 味する必要あり。ある論文に記載されているCampylobacter jejuniの配列は偽陰性多 発。

感染症予防法 二類感染症

1999年1例報告があるが以降国内では

報告なし。

Corynebacterium diphtheriae 99.9%と

同定されても、安易に報告はできない。

これまで2例経験

同定および毒素のための

primer setを

作成し、

PCRまで確認した後、報告。

ジフテリアの国内届出患者数

T. Muratani

T. Muratani 97才女性 8/31-3011 特に症状なし。監視培養？ VITEK-MSにて、Corynebacterium diphtheriae 99.9%となる。 特異的Primerを作成し、PCRで確認→陽性 毒素遺伝子に対しても特異的Primerを作成→陰性 2014年5月にも94才女性から分離された。

喀痰から

Corynebacterium diphtheriae

が分離されたケース

感染症予防法 二類感染症 検査方法（病変（感染）部位からの採取材料） １．分離・同定による病原体の検出、かつ、分離菌におけるジフテリア毒素の確認 ２．ＰＣＲ法による病原体の遺伝子の検出 （2014年5月12日削除）

(※）本感染症は、Corynebacterium diphtheriaeによるものであるが、Corynebacterium ulcerans及 びCorynebacterium pseudotuberculosisにおいてもジフテリア毒素を産生する株が確認されている ので、分離・同定による病原体の検出、病原体の毒素遺伝子の検出の際に留意が必要である。 (2014年5月12日削除）

(※）ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）であっても、ジフテリア毒素非産生性の菌は届出 の対象ではない。 Corynebacterium ulcerans及びCorynebacterium pseudotuberculosisについては、 ジフテリア毒素を産生する株があるものの、それらは届出の対象ではない。 （2014年5月12日新 設） T. Muratani プロテオースペプトン 酵母エキス L-システイン 寒天 サプリメント 血清 亜テルル酸カリウム チオ硫酸ナトリウム 20.0 g 5.0 g 0.24 g 15.0 g 100 mL 345 mg 425 mg 1L

TINSDALE AGAR (Billings modification)

C. diphtheriae biotype gravis C. diphtheriae biotype mitis C. ulcerans

C. diphtheriae biotype intermedius ジフテロイド C. pseudodiphtheriticum Haemophilus sp., Klebsiella sp. Neisseria sp., Staphylococcus sp. Streptococcus sp. Proteus sp. 24時間培養後、暗褐 色ハローを伴う隆起し 光沢のある小さな黒 色コロニー 36時間培養後、ハ ローを伴う淡褐色コロ ニー ハローを伴わない暗 褐色コロニー 培地の変色がない微 小コロニー 特徴的な臭気と形状 を持つ黒褐色コロニー 35℃48時間好気培養。炭酸ガス培養不可。 _{T. Muratani}