近畿 大学 農学 総合 研 究所 報告 第5号(1997)

近 畿 大 農 総研 報5145〜148(1997)

Bull. Inst. Compr. Agr. Sci. Kinki Univ. 5 : 145-148 (1997)

ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ に よ る2,4,6一 ト リ ク ロ ロ フ ェ ノ ー ル の 環 境 か ら の 除 去

藤 本 尚 利*,室 原 千 賀 子*,白 坂 憲 章*,村 上 哲 男*,五 影 勲*,吉 栖 肇 栃

Elimination of an Antifunfgal Agent, 2,4,6-trichlorophenol, by Peroxidases

from the Environment

Naotoshi FUJIMOTO, Chikako MUROHARA, Norifumi SHIRASAKA, Tetsuo MURAKAMI, Isao ITSUKAGE and Hajime YOSHIZUMI

Synopsis

Antifungal compound, 2,4,6-trichrolophenol (TCP) has been frequently used as a component of the wood antiseptics, hence is widely distributed to environment. It was shown that the some part of TCP was methylated at hydroxyl residue and was converted into 2,4,6-trichroloanisole (TCA) by the various microbes. Since TCA has very strong musty odor at low concentration (ppb-ppt level) in aqueous solution, its diffusion into foods and other goods through plastic packing materials results in the deterioration of these goods with musty contamination. To prevent the formation of TCA, TCP should be removed from the environment.

In the proceeding paper, it was shown that the elimination of TCP is achieved by the use of peroxidases (EC 1.11.1.7) derived from Arthromyces ramosus and horse raddish.

1緒 論

ハ ロ ゲ ン置 換 フ ェ ノ ー ル,特 に2,4,6一 ト リ ク ロ ロ フ ェ ノ ー ル(TCP)は 製 紙 工 業 に お け るパ ル プ 等 に 存 在 し1),そ の 一 部 は種 々 の 微 生 物 に よ っ て2,4,6一

ト リ ク ロ ロ ア ニ ソー ル(TCA)に 変 換 され る こ とが 知 られ て い る2)。 こ のTCAは 極 低 濃 度(ppq‑pptレ ベ ル)で 強 い 徽 臭 を示 し,食 品 等 に 異 臭 を つ け る こ と が 明 らか に さ れ た3)。最 近,こ のTCAが 合 成 樹 脂 製 の 包 装 資 材 を通 過 して 食 品 に 徽 臭 を つ け る メ カ ニ ズ ム が 報 告 され た4)。TCAは 商 品 包 装 に 使 用 さ れ る フ ァ イ バ ー ボ ー ドカ ー ト ン 中 に 残 存 し て い たTCP の 水 酸 基 が 汚 染 繁 殖 した 微 生 物 に よ っ てo一 メ チ ル 化 さ れ て 生 成 し,包 装 袋 や キ ャ ッ プ を通 し て 食 品 に 溶 解 し 徽 臭 汚 染 を 起 こ す こ と が 判 明 し た5)。 こ の

TCA徽 臭 汚 染 を完 全 に防 止 す る た め に は包 装 関 連 資 材 か らTCPを 除 去 す る こ とが 望 ま し い。 本 報 告

で はペ ル オ キ シ ダ ー ゼ(EC1.11.1.7)を 用 い たTCP の 除 去 法 に つ い て 検 討 した 結 果 に つ い て 述 べ る。

II実 験 材 料 な ら び に 方 法 1ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ(POD)

実 験 に 用 いPOD(EC1.11.1.7)と し て は ・4γ漉 一 70物 ノ66∫η 〃20∫%S(真菌)起 源 の も の6)と 西 洋 わ さ び (ア ブ ラ ナ 科)起 源(和 光 純 薬)の2種 類 を用 い た 。 両 酵 素 の 比 活 性 は100units/mg(4一 ア ミ ノ ア ン チ ピ

リ ン/フ ェ ノ ー ル 発 色 系)7)に な る よ う に 調 節 して 用 い た 。

2ト リ ク ロ ロ フ ェ ノ ー ル(TCP)の 定 量 法

事 近畿大学農学部食品栄養学科

(Department of Food Science and Nutrition, Faculty of Agriculture, Kinki University, Nakamachi, Nara-city 631,Japan) 絆 近畿大学農学総合研究所(兼 務)

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近畿 大学 農学 総合 研 究所 報告 第5号(1997)

TCPはHPLCに よ っ て 測 定 し た が,測 定 条 件 は 以 下 の ご と く設 定 し た 。HPLC:ShimazuLC‑5A,

TOYOSODAUV‑8000,Column:COSMOSIL ODS5C18(4.6x150mm)NakaraiTesuque, Mobilephase:25mMKHzPO4(PH7.0)‑CH3 HN(3:6),Flowrate:1.Oml/min,Wavelength UV254nm.

3PODに よ るTCP除 去 実 験

1/10Mphosphatebuffer(pH7.0)に 被 検TCP を添 加 し,POD反 応 前 後 のTCPを 定 量 し てPOD に よ るTCP除 去 を検 討 し た 。

4定 能 テ ス ト に よ るPODのTCP除 去 効 果 の 確 認

TCPも フ ェ ノ ー ル 系 の 薬 品 臭 を 認 め る の で,官 能 テ ス トに よ っ てPODのTCP除 去 効 果 を検 討 し た 。

この 実 験 に はArthromycesPODを 用 い,TCP量(A 因 子,ppm)をA1=0,A2=20,A3=40,A4=60の

4水 準 と した 。POD添 加 量(B因 子,units/4m1反 応 液 を),B、=0,B2=5,B3=10,B4=30,B5=50

の5水 準 と し た.官 能 テ ス トの パ ネ リス トは研 究 室 専 攻 生20名 の 中 か ら ラ ン ダ ム に選 び(C因 子)と し, C1=S君,C2=F君,C3=Y君,C4=YK君 の4水 準 と した 。ま た,測 定 日 はD1=12月8日 とD、=12月 9日 の2水 準 と し た 。 な お,AとBは 母 数 因 子 で,C

とDは 変 量 因 子 と し た 。 全 量 が4mlの 反 応 液 に各 水 準 のTCPとPODを 添 加 し5分 間 室 温 で 撹 搾 し た の ち 官 能 テ ス トを 行 っ た 。 官 能 テ ス トの 特 性 値 は

1)臭 い は な い:0,2)臭 い が あ る と も言 え な い:

1,3)臭 い が あ る:2,4)大 変 強 い 臭 い が あ る:

3,と し て 証 価 し た 。1日 に 延 測 定 回 数80回 の う ち AiBj(20組 合 せ)に つ い て は順 序 は ラ ン ダ マ イ ズ し, 2日 で 総 測 定 数160回 を得 た 。 な お,1人 の パ ネ リス トの 測 定 は15分 間 隔 で 行 い,残 存 効 果 ・疲 労 効 果 を 少 な く し た 。

III実 験 結 果

1ArthromycesPODと 西 洋 ワ サ ビPODに よ る TCPの 除 去

燐 酸 緩 衝 液(100mM,pH7.0)にTCPを80μg/

m1に な る よ う添 加 し た後,種 々 の 量 のPODを 添 加 し,25℃ で15min反 応 後HPLCに よ っ てTCPを 測 定 し た。Fig.1‑(a),(b)に 添 加PODに よ るTCPの 減 少 を 示 し た 。(a)ではArthromycesPOD10、 μg/m1で 西 洋 ワ サ ビPOD20μg/mlでTCPは ほ ぼ 消 滅 し, (b)で は両PODと も約2units/m1でTPCは 除 去 さ

れ る こ と が 認 め ら れ る。 従 っ て 環 境 中 のTCPは 両 PODに よ っ て 取 り除 く こ とが で き,TCPか らTCA へ の 微 生 物 変 換 に よ る食 品 等 の 徽 臭 汚 染 の 原 因 物 質 の消 去 が 可 能 で あ る こ と を示 し た 。

2官 能 テ ス トに よ るPODのTCP除 去 効 果 確 認 官 能 テ ス トに よ る デ ー タ をTable1に 示 し た 。 分 散 分 析 ・重 回 帰 分 析 を 行 い,A1の 回 帰 直 線(1次)

式 とA2,A3,A4を 込 み に し た 式 をFig,2に ま と め た 。Fig.2の 下 の 線 はTCP濃 度Oppmの 時 の 評 価

( ■ヒ ニ ニ ) ﹂ 0 ﹂ °

TCPdeg.‑data

POD(ug)

TCPdeg.‑data

OQ.511.522.5

PQD{units}

Fig.1.TCPremovalbyPODfromArthromycesramosusandhorseradish.

ramosusPOD,{B)HorseradishPOD

(A)14γ 舌hromyces

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Table1.Analysisofvariance{Yijkl)

N=160

B,{0) BZ(20)

s3(4a)

Bs(80)

A,(0}

atotal

ユ ヨるCCCC 09θ‑⊥14 01001←EJ 9ρ1014 09自10り07 0り000つ﹂ 01⊥0014 09白006乙 0り乙19﹂￡U8 0ワ9009白 09白009θ4 21835

28

mean a.say 0.875 0.500 1.000 0.500 o.70a

B,{0)

BZ(20) B3{4a)

AZ{aa)

atotal

ユ ヨるCCCC

32 23 32 33 1110

21

可⊥29θ947謬

2 2 2 1 7 14

‑り09山‑⊥71

2 2 2 1 7 14

り乙3つ﹂‑⊥0ヲ

2 3 1 1 7 16

り白9自9自ーワ5

320 224 120 115 7 1479

mean 2.625 1.750 1.750 2.000 1.750 1.975

B,(0)

Bs(80)

A3{40)

atotal

ユ ヨるCCCC り自31←28 6り自り白9山り乙001 119盈9白べU 3り々‑←り盈り白7ε1 109白0り0

2 i 2 3 8 11

り乙(り9ρり0ワ4

13 23 02 12 43a 11

21$

215 217 219 8 1869

mean 2.000 1.625 1.375 2.250 1.725

B1(0) BZ(20)

B3{40) s,(so)

A4(60)

atotal

ユ ヨるCCCC り09々りρ07●

23 32 22 33 1010 17

2 1 2 2 7 17

0乙n乙9自‑17 2121613 9﹂‑19ゆ8

12 23 22 23 710 15

222 320 320 220 10 2082

mean 2.125 2.125 1.625 1.875 2.50a 2.050

total

30 292724202226242927

5951425056 258

mean 1.844 1.594 1.313 1.563 i.75a 1.613

ComponentsofData

Y」jklニm十a1十bj十(ab)IJ十(ag)1k十(bg)jk十(bd)jl十(gd)k1十e1,kl Sa1=0,Sbj=0,Sgk≠0,ε(gk)=0,Sd1≠0,S(d童)=O

Se亘 」k1≠0,ε(ei}kL)=0,eljklεNID(0,S。2) Factors:A,^‑A4=TCPcncentration(ppm}

B,^‑B,=PODconcentration{units/4ml}

Cl^‑C,=Panelers

値 を 示 した もの で,嗅 覚 評 価 値 が1以 下 を 通 り,臭 い が 有 る と も無 い と も言 え な い こ と を 示 して い る。

上 の 曲 線 はTCP濃 度20,40,60ppmの 場 合 を示 し, POD添 加 濃 度 が20units/4m1で 嗅 覚 評 価 値 は最 低

を示 し て い る。 し か しPOD濃 度 が20units/4mlを

越 える と臭 覚評 価値 は逆 に上 昇 してい る。 した が っ

て,PODは 水 溶液 中 のTCPを 系外 に除 去す る事 は

明 らかで あ るが,POD酵 素量 が過 剰 に な る と生成物

が再分 解 され るか,ま た は別 の臭 気 を有 す る物質 を

再 生成 す る可能 性 が考 え られ る。 しか し,こ の官 能

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近 畿大 学 農学総 合研 究所 報 告 第5号(1997)

V要 約

殺 菌 剤 等 の形 で 自然 界 に散 布 さ れ て 残 留 し た り, フ ェ ノ ー ル 含 有 排 水 の 塩 素 処 理 に よ っ て 生 成 し た り し て 自 然 環 境 に 存 在 す る塩 素 化 フ ェ ノ ー ル のTCP は微 生 物 変 換 され て 徽 臭 の 強 力 なTCAに な り,食 品 等 を汚 染 す る。 こ の 徽 臭 汚 染 を 防 除 す る 方 法 と し て,2種 類 のPOD酵 素 を 用 い るTCP除 去 法 を検 討

し た 。Arthromycesramosusと 西 洋 ワ サ ビ 由 来POD は い ず れ も2units/ml程 度 で80ppm程 度 のTCP 水 溶 液 か らTCPを 除 去 し う る こ と を 示 し た 。 この PODに よ るTCP除 去 作 用 は 官 能 テ ス ト に よ っ て

も確 認 さ れ た 。 051020304050

Fig.2.OrganoleptictestforTCPremovelbyPOD.

テ ス トに よ っ て,PODを2〜4units/ml添 加 す る こ と に よ っ てTCPを 除 去 出 来 る こ と が 確 か め ら れ た。

IV考 察

TCPは そ の 強 い 殺 菌 力 の 故 に,木 材 等 の 防 腐 剤 に 使 用 さ れ ブ ロ イ ラ ー 飼 育 場 の 床 敷 き の 大 鋸 屑 に 残 留 し,種 々 微 生 物 に よ っ てTCAに 変 換 さ れ て プ ロ イ ラ ー に徽 臭 を付 け た 事 例8,9,1°}が1970年代 に 報 告 さ れ て い る。1980年 代 に はTCAが 包 装 材 を通 して コ コ ア粉 末 や 乾 燥 果 実 等11,12)を汚 染 し 商 品 価 値 を 著 し く低 下 さ せ る こ とが 知 ら れ て い る。 極 め て低 濃 度 (ppq‑pptlevel)で 徽 臭 を付 け るTCAはTCPの 微 生 物 変 換 に よ っ て 生 成 す る が,こ のTCPは 微 量 の フ ェ ノ ー ル を含 む 都 市 ・工 場 排 水 を塩 素 処 理 し た場 合 に も生 成 し13},河 川 に放 流 さ れ た 後 に 用 水 と し て 再 使 用 さ れ る場 合 にTCPか らTCAへ の 変 換 が 起 こ り都 市 上 水 を 汚 染 す る 可 能 性 が 指 摘 さ れ る。 こ の よ う にTCP等 の塩 素 化 フ ェ ノ ー ル 類 が 環 境 に 広 く 分 布 す る 現 状 に 鑑 み,酵 素 的 なTCP除 去 技 術 の 構 築 は環 境 浄 化 の 面 か ら も有 用 で あ り,POD処 理 に よ っ て 徽 臭 原 因 物 質TCAの 生 成 防 止 技 術 と し て も 重 要 で あ る と考 え られ る。

 1

, 2

10)

11}F.B.Whitefield,et.al.,:Chem.Ind.,

12}

13)

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