科学研究費補助金研究成果報告書

様式 C‑19

科学研究費補助金研究成果報告書

平成 22 年 5 月 31 日現在

研究成果の概要（和文）：

腎 臓 は 尿 管 芽 の 周 り に 後 腎 間 葉 と 呼 ば れ る 前 駆 細 胞 集 団 が 凝 集 し 、糸 球 体 、近 位 尿 細 管 、遠 位 尿 細 管 へ と 分 化 し て い く こ と で 形 成 さ れ る 。し か し こ の 間 葉 は 生 後 速 や か に 分 化 し て 消 失 し て し ま う 。こ の 間 葉 を 増 幅 さ せ 、特 定 の 細 胞 腫 へ と 分 化 さ せ る こ と は 腎 臓 再 生 に む け て 大 き な 意 味 を 持 つ 。 そ こ で 腎 臓 前 駆 細 胞 の マ ー カ ー と し て 用 い た Sall1 を 後 腎 間 葉 で 発 現 さ せ 続 け る こ と で 未 分 化 性 の 維 持 及 び 増 殖 が 出 来 な い か を 検 討 し た 。ま た 遺 伝 子 導 入 に よ っ て 間 葉 の 未 分 化 維 持 お よ び 分 化 誘 導 を 引 き 起 こ せ な い か と 考 え 、 レ ン チ ウ ィ ル ス を 用 い た 強 制 発 現 系 の 開 発 を 行 っ た 。

研究成果の概要（英文）：

The metanephros is the main filtrating organ of the mammalian organism. The basic structural and functional unit of the kidney is the nephron, which performs a multitude of tasks including blood filtration, re‑absorption of salt, water and other compounds.

These functions can be related to specific units in each nephron that are formed in a tightly controlled manner during development. Induction of the kidney occurs through reciprocal interactions between the ureteric bud and the metanephric mesenchyme. The mesenchymal cell sequentially form condensates, renal vesicles, comma‑ and S‑shaped bodies, and terminal epithelia of glomeuli, proximal and distal tubules.

To generate multiple cell lineages for kidney regeneration, there exist three obstacles to be overcome; (1) derivation of the renal progenitors; (2) expansion of the renal progenitors; and (3) control of lineage commitment of the renal progenitors toward differentiated cell types.

The recent work on iPS formation suggests that a specific combination of multiple factors might be the most effective way to reprogram the cells.

To develop of gene transducing methods into the kidney, we first tested lentivirus vector system.

交付決定額

（金額単位：円）

直接経費 間接経費 合 計

2008 年度 1,800,000 540,000 2,340,000 2009 年度 1,400,000 420,000 1,820,000

年度 年度 年度

総 計 3,200,000 960,000 4,160,000

研究種目： 若手研究(B) 研究期間： 2008〜2009 課題番号： 20790596 研究課題名（和文）

腎前駆細胞の自己複製及び分化誘導の試み 研究課題名（英文）

Guided defferentiation of kidney precursor cells into specific cell lineages of the nephron

研究代表者

小林 千余子 （KOBAYASHI CHIYOKO）

熊本大学・発生医学研究所・助教 研究者番号：20342785

研究分野：医歯薬学

科研費の分科・細目：内科系臨床医学・腎臓内科学 キーワード：腎臓学・腎臓発生・前駆細胞

１．研究開始当初の背景

日本で人工透析を受ける人は 26 万人を越 え、腎不全等の医療費は年間１兆円を超える。

現時点での末期慢性腎不全に対する根治療 法は腎移植しかないが、ドナーが決定的に不 足しており、腎臓器売買や病気腎移植が重大 な社会的問題になっている。そこで臓器移植 に代わる新しい治療法として再生医療が期 待されているが、この再生医療で期待されて いることの一つは、特定の腎臓細胞を誘導し、

細胞移植によって損傷部位の機能を回復さ せることができないかというものである。

Sall1 は 10 個のジンクフィンガーを持つ核 内因子で、ノックアウトマウスは腎臓を完全 に 欠 損 す る (Nishinakamura,

Development

, 2001)。

Sall1

は E11.5 の後腎間葉から発現 していることから、

Sall1

遺伝子座に蛍光タ ンパク質 GFP を導入したノックインマウスを 作成(Takasato,

Mech.Dev.,

2004)し、後腎 間葉から FACS(fluorescence activated cell sorting)を用いて GFP 高発現細胞を選別し、

Wnt4 を発現する NHI3T3 フィーダー細胞上で 培養すると、１個の細胞からコロニーが形成 され、糸球体、近位尿細管、遠位尿細管のマ ーカーを発現する。またこれら個々の GFP 高 発現細胞を再凝集させて器官培養すると、3 次元構造を再構築し、糸球体や尿細管様の構 造 が 認 め ら れ る (Osafune,

Development,

2006)。この系の開発で我々は胎児の後腎間 葉内に多能性の前駆細胞が存在することを 示したが、成体ではこの

Sall1

‑GFP が高発現 す る 間 葉 領 域 は 消 失 し て し ま う 。 で は Sall1‑GFP を高発現する間葉細胞を自己複製 させ、かつ望みの系統へ分化誘導出来ないか と考えた。さらに誘導した細胞を成体へ細胞 移植することで、成体での腎臓の再生に繋げ られる可能性がある。

２．研究の目的

Sall1

ノックアウトマウス、E11.5 の後腎 間葉を単一細胞に解離し Wnt4 を発現する 3T3 フィーダー上で培養すると上皮化は起こる が形成されるコロニーの大きさが小さい。つ まり後腎間葉の増殖に関与していると考え られる。

Six2

ノックアウトマウスでは異所的 な間葉細胞の早熟な上皮化が起こり、前駆細 胞が減少し腎臓が低形成になる。さらに

Six2

ノックアウトマウスの後腎間葉で

Wnt4

の発 現領域が拡大していることから、

Six2

は Wnt4 の上皮化シグナルを抑制することにより、後 腎間葉の前駆細胞を未分化な状態に保って

いるものと考えられている(Self, 2006)。

Wnt4

のノックアウトマウスでは後腎間葉が 上皮化を起こせず(Kispert, 1998)、

Notch2

の hypomorphic ノックアウトマウスでは上皮 化は起こるが、最終的に糸球体形成不全とな る (McCright, 2001)。このような種々のノ ックアウトマウスの解析から、腎臓発生およ び分化の基本的カスケードは、尿管芽のまわ りに後腎間葉が凝集し、増殖しながら（

Sall1

及び

Six2

が関与）、Wnt4 のシグナルを受けて 上皮化が始まり、その後 Notch のシグナルや 他の分化シグナルか入ることで、多系統の細 胞分化がおこると考えられている。

そこで本研究ではこれらの基本カスケー ドに関わる遺伝子の働きを操作することで、

・腎臓前駆細胞の自己複製法の確立

・腎臓前駆細胞集団からの特定細胞系譜への 分化誘導法の確立

を行いたいと考えた。

３．研究の方法

自己複製法の確立については、

Sall1

遺伝 子の関与に関して、この遺伝子を後腎間葉で 強制発現させることで、自己複製が亢進する かを検討した。

分 化 誘 導 法 に 関 し て は

Notch2

の hypomorphic ノックアウトマウスと Notch の シグナルを活性化させるγ‑secretase の構 成タンパクである

presenilin

ノックアウト マ ウ ス に お け る 解 析 に ヒ ン ト を 得 た 。

presenilin

ノックアウトマウスでは糸球体 と近位尿細管が欠失する(Wang, 2002)。とい うことは、取り出してきた後腎間葉に Notch シグナルを操作することで、近位尿細管や糸 球体への分化が誘導出来るようになるかも し れ な い 。 そ こ で リ ガ ン ド 刺 激 や 活 性 型

Notch2

強制発現マウスによる Notch シグナル 活性増強を試み、後腎間葉細胞が一方向性に 分化するかを検討した。ま た 遺 伝 子 導 入 に よ っ て 間 葉 を 糸 球 体 細 胞 へ と 分 化 誘 導 さ せ る べ く 、レ ン チ ウ ィ ル ス を 用 い た 強 制 発 現 系 の 開 発 を 行 っ た 。

４．研究成果

(1) 腎 臓 前 駆 細 胞 の マ ー カ ー と し て 用 い た Sall1 を 後 腎 間 葉 で 発 現 さ せ 続 け る こ と で 未 分 化 性 の 維 持 及 び 増 殖 が 出 来 な い か を 検 討 し た 。そ の た め に ま ず ROSA26 遺 伝 子 座 に loxP 配 列 及 び Sall1 cDNA を 挿 入 し た マ ウ ス (Rosa‑Sall1) を 作 成 し

た 。腎 臓 前 駆 細 胞 特 異 的 に Cre リ コ ン ビ ナ ー ゼ を 発 現 す る Six2‑Cre マ ウ ス と 掛 け 合 わ せ る こ と で 、 E11.5 か ら 腎 臓 前 駆 細 胞 特 異 的 に Sall1 を 強 制 発 現 さ せ た が 、 未 分 化 前 駆 細 胞 の 数 や 分 化 の 状 態 に 変 化 が 無 か っ た 。腎 臓 に お け る Sall1 の 外 来 性 タ ン パ ク の 発 現 量 が 少 な い こ と が 表 現 型 の 現 れ に く い 原 因 の 一 つ か も し れ な い 。そ こ で 全 身 性 に Cre リ コ ン ビ ナ ー ゼ を 発 現 す る CAG‑Cre マ ウ ス と Rosa‑Sall1 マ ウ ス を 交 配 し た 。腎 臓 、脳 、 肝 臓 、肺 等 の 臓 器 で 外 来 性 の Sall1 の 発 現 を 確 認 す る こ と が 出 来 、 Sall1 の 強 制 発 現 マ ウ ス の 有 効 性 は 確 認 で き た が 、や は り 腎 臓 前 駆 細 胞 の 数 や 分 化 の 状 態 に 変 化 は 見 ら れ な か っ た 。 し か し な が ら 、 体 重 が 優 位 に 小 さ く な り （ 図 １ ）、 脳 下 垂 体 で の Sall1 の 発 現 量 変 化 に よ っ て ホ ル モ ン 量 が 変 化 し た 可 能 性 が 考 え ら れ た 。

図 1 全 身 性 に Sall1 を 発 現 し た マ ウ ス は 低 体 重 に な っ た 。

(2) Notch シ グ ナ ル を 操 作 す る こ と で 細 胞 系 譜 を コ ン ト ロ ー ル で き る か を 検 討 し た 。 Notch の リ ガ ン ド で あ る Jagged を 発 現 す る フ ィ ー ダ ー 細 胞 上 で 、後 腎 間 葉 を 培 養 し た が 、糸 球 体 お よ び 近 位 尿 細 管 の 分 化 が 促 進 さ れ る こ と は な か っ た 。 ま た 、 ROSA26 遺 伝 子 座 に loxP 配 列 及 び 細 胞 内 領 域 の み を も つ Notch2 遺 伝 子 を 挿 入 し た マ ウ ス (Rosa‑ICN2)を 作 成 し 、 腎 臓 前 駆 細 胞 特 異 的 に Cre リ コ ン ビ ナ ー ゼ を 発 現 す る Six2‑Cre マ ウ ス と 掛 け 合 わ せ る こ と で 腎 臓 前 駆 細 胞 特 異 的 に Notch2 を 強 制 発 現 さ せ た と こ ろ 、腎 臓 の 低 形 成 が み ら れ た（ 図 2）。発 生 過 程 に お い て は 、Six2 陽 性 の 腎 臓 前 駆 細 胞 が 消 失 す る と と も に Wnt4 の 異 所 的 な 発 現 が 観 察 さ れ た（ 図 3）。こ の こ と か ら 腎 臓 前 駆 細 胞 で の Notch2 の 活 性 化 は 近 位 ネ フ ロ ン へ の 細 胞 運 命 決 定 に 関 与 す る よ り は 、 上 皮 化 を 促 進 す る こ と で 未 分 化 な 腎 臓

前 駆 細 胞 を 枯 渇 さ せ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 ま た Six2 の 上 流 因 子 で あ る Pax2 の 発 現 が Hesr 遺 伝 子 を 介 し て 行 わ れ て い る こ と 等 が 明 ら か と な り 、 Six2 を 介 し た Notch2 と Wnt4 の positive feed back loop の 存 在 が 示 唆 さ れ た （ 図 4）。

図 2 腎臓前駆細胞で Notch2 を強制発現させ ると腎臓の低形成がみられた。

図 3 腎臓前駆細胞で Notch2 を強制発現さ せると Six2 遺伝子の発現低下(A, B)および Wnt4 遺伝子の異所的発現(C, D)が観察され た。

図 4 ネフロン前駆細胞に対する Notch2 の 機能

(3) コ ン ト ロ ー ル レ ン チ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー を 使 っ た 結 果 、 MOI 5 で 解 離 し た 腎 臓 前 駆 細 胞 の 約 80%が 感 染 す る こ と を 突 き 止 め た 。ま た 予 備 実 験 の 結 果 か ら 解 離 し た 後 腎 間 葉 に Wt1 遺 伝 子 を 発 現 す る ウ ィ ル ス を 感 染 さ せ る と 、下 流 で 働 く と さ れ る VEGF の 発 現 が 誘 導 さ れ る こ と 、 ま た 尿 管 芽 の 引 き 寄 せ に 関 わ る GDNF 遺 伝 子 を 発 現 す る ウ ィ ル ス を E11.5 胚 の 腎 臓

に 感 染 さ せ る と 、過 剰 な 尿 管 芽 の 分 岐 誘 導 が 観 察 さ れ た（ 図 5）。こ れ ら か ら レ ン チ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー を 用 い た 強 制 発 現 系 は 腎 臓 に 有 効 で あ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。現 在 、糸 球 体 細 胞 へ の 分 化 誘 導 因 子 候 補 11 種 と 未 分 化 維 持 因 子 候 補 ２ 種 の ウ ィ ル ス 作 製 を 行 っ て お り 、コ ロ ニ ー ア ッ セ イ ま た は 器 官 培 養 系 で の 効 果 を 検 証 し た い 。

図 5 GDNF 遺伝子を発現するウィルスを E11.5 の後腎に感染させると、過剰な尿管芽 の分岐が確認された。

５．主な発表論文等

（研究代表者、研究分担者及び連携研究者に は下線）

〔雑誌論文〕（計 4 件）

① Yukako Uchiyama, Masaji Sakaguchi, Takeshi Terabayashi, Toshiaki Inenaga, Shuji Inoue, Chiyoko Kobayashi, Naoko Oshima, Hiroshi Kiyonari, Naomi Nakagata, Yuya Sato, Kiyotoshi Sekiguchi, Hiroaki Miki, Eiichi Araki, Sayoko Fujimura, Satomi Tanaka, Ryuichi Nishinakamura.

(2010)

Kif26b, a kinesin family gene, regulates adhesion of the embryonic kidney mesenchyme.

Proc. Natl. acad. Sci. USA. (in press).

査読有

② Sayoko Fujimura, Qing Jiang , Chiyoko Kobayashi, Ryuichi Nishinakamura.

(2010)

Notch2 activation in the embryonic

kidney depletes nephron progenitors.

J. Am. Soc. Nephrol. 21:803‑810. 査読 有

③ Qing Jiang , Sayoko Fujimura, Chiyoko Kobayashi, Ryuichi Nishinakamura.

(2010)

Overexpression of Sall1 in vivo leads to reduced body weight without affecting kidney development.

J. Biochem. 147: 445‑450. 査読有

④ Minoru Takasato, Chiyoko Kobayashi, Koji Okabayashi, Hiroshi Kiyonari, Naoko Oshima, Makoto Asashima, Ryuichi Nishinakamura (2008)

Trb2 , a mouse homolog of tribbles , is dispensable for kidney and mouse development.

Biochem. Biophys. Res. Commun. 373:

648‑652. 査読有

〔学会発表〕（計 5 件）

① Chiyoko Kobayashi. (2009)

Development of gene transducing methods into the kidney.

Global COE‑IMEG Joint Summer Retreat Seminar in ASO, At Hotel Green Pia Minami Aso Aso, Kumamoto, Japan. Sep, 3.

② 阪口雅司, 内山裕佳子, 稲永敏明, 小 林千余子, 藤村幸代子, 西中村隆一 腎臓形成不全を示す KIF‑K ノックアウトマ ウスの解析

第５回宮崎サイエンスキャンプ 2009 年 2 月 21 日、ワールドコンベンションセンター サミット宮崎, 宮崎.

③ Chiyoko Kobayashi (2008)

Guided differentiation of kidney precursor cells into specific cell lineages of the nephron.

Global COE‑IMEG Joint Summer Retreat

Seminar in ASO, At Hotel Green Pia Minami Aso. Aso, kumamoto, Japan. Aug, 28.

④ Yukako Uchiyama, Toshiaki Inenaga, Shuji Inoue, Chiyoko Kobayashi, Ryuichi Nishinakamura. (2008)

KIF‑K, a kinesin family gene, regulates Gdnf maintenance and controls ureteric bud attraction in kidney development.

The 41

^th

annual meeting of the Japanese Society of Developmental Biologists.

Tokushima Arts Foundation for Culture, Tokushima, Japan. May, 29.

⑤ Yukako Uchiyama, Toshiaki Inenaga, Shuji Inoue, Chiyoko Kobayashi, Ryuichi Nishinakamura. (2008)

The roll of KIF‑K, a kinesin family gene, in a renal progenitor population.

The 6

^th

annual meeting of International Society for Stem Cell Research.

Pennsylvania Convention Center, Philadelphia, PA USA. June, 13.

〔その他〕

ホームページ等

http://www.imeg.kumamoto‑u.ac.jp/divisi ons/integrative̲cell̲biology

６．研究組織 (1)研究代表者

小林 千余子

（KOBAYASHI CHIYOKO）

熊本大学・発生医学研究所・助教 研究者番号：20342785

(2)研究分担者

（ ）

研究者番号：

(3)連携研究者

（ ）

研究者番号：